应用密度梯度离心结合免疫磁珠法富集孕妇外周血中胎儿NRBC的实验研究

目的 研究利用不连续密度梯度离心结合免疫磁珠方法,分选孕妇外周血中的胎儿有核红细胞(NRBC).方法 采集21名孕周在12-28周的孕妇外周血10ml,经不连续密度梯度离心后,再用免疫磁珠法分选和富集胎儿NRBC,同时对富集前后的孕妇外周血进行瑞氏染色和胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)特异性抗体标记、识别.结果 未经分选、富集,21名孕妇外周血有核细胞层涂片经瑞氏染色检查均未发现NRBC;梯度离心富集后21名孕妇中有11例外周血有核细胞涂片找到1～8个NRBC;再经免疫磁珠分离后有12例涂片发现1～7个NRBC,同时进行HbF特异性抗体标记,证实其NRBC阳性涂片中均存在胎源性NRBC.结论 本研究初步建立了分选、富集胎儿NRBC的实验方法,通过进一步的方法学改进,有望用于产前基因筛查的研究.     

应用密度梯度离心结合免疫磁珠法富集孕妇外周血中胎儿NRBC的实验研究

目的研究利用不连续密度梯度离心结合免疫磁珠方法,分选孕妇外周血中的胎儿有核红细胞(NRBC)。方法采集21名孕周在12-28周的孕妇外周血10ml,经不连续密度梯度离心后,再用免疫磁珠法分选和富集胎儿NRBC,同时对富集前后的孕妇外周血进行瑞氏染色和胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)特异性抗体标记、识别。结果未经分选、富集,21名孕妇外周血有核细胞层涂片经瑞氏染色检查均未发现NRBC;梯度离心富集后21名孕妇中有11例外周血有核细胞涂片找到1～8个NRBC;再经免疫磁珠分离后有12例涂片发现1～7个NRBC,同时进行HbF特异性抗体标记,证实其NRBC阳性涂片中均存在胎源性NRBC。结论本研究初步建立了分选、富集胎儿NRBC的实验方法,通过进一步的方法学改进,有望用于产前基因筛查的研究。     

应用新型抗胎儿血红蛋白抗体富集母体循环中胎儿有核红细胞

目的 利用多肽合成技术制备抗胎儿血红蛋白(fetal hem-oglobin,HBF)γ链的抗体,探讨其用于检测孕妇外周血中胎儿有核红细胞(nucleated red blood cell,NRBC)进行无创性产前基因诊断的可行性.方法 针对胎儿血红蛋白的特异性抗原表位,选定第69～78位HbF-γ特异的11个氨基酸残基的肽段为免疫原,将人工合成的胎儿血红蛋白γ链的多肽与载体蛋白(KLH)偶联,佐剂乳化后免疫羊,制备羊抗人胎儿血红蛋白的抗血清,经蛋白G纯化,HbF特异性抗体标记、识别、显微操作法富集32例孕周为22～39周的孕妇外周血中的胎儿有核红细胞,引物延伸预扩增后,利用9个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)的复合扩增方法对富集的阳性细胞进行扩增,用于孕妇外周血中富集的HbF阳性细胞胎儿来源的遗传学鉴定.结果 经HbF多克隆抗体标记,32名孕妇外周血中均发现与HbF呈阳性反应的胎儿NRBC,并具有鲜明的形态学特征,光学显微镜下可见NRBC细胞质呈棕黄色,核浆比例较低,苏木素复染后胞核呈蓝色,明显区别于其他细胞,每份样本出现NRBC 0.6～1.8个/ml,共计183个,平均为1.3个/ml,经STR多态性基因位点鉴定,准确率为90.6%.结论 利用多肽合成技术制备的抗胎儿血红蛋白γ链的抗体能有效识别母血中的胎儿有核红细胞,可应用于无创性产前基因诊断,具备良好的应用前景.     

三种特异性抗体结合流式细胞术分选母血中胎儿细胞方法的评价

研究证实母血中的游离胎儿细胞可用于无创性单基因病产前诊断。胎儿细胞仍是检测胎儿染色体异常的惟一来源，虽然母血中胎儿有核红细胞（FNRBC）数量很少，但其特异性形态在正常人外周血中极罕见，并可携带完整的胎儿基因。因此，建立富集母血中胎儿细胞的方法则是无创性产前诊断的关键。本研究用3种FNRBC特异性抗体和流式细胞术分选胎儿细胞，并通过计算FNRBC准确率和特异性，以评价分选母血中胎儿细胞的最适宜方法。     

孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集及鉴定

目的：建立富集分离孕妇外周血胎儿有核红细胞的方法,并证实其为胎儿来源。方法;以血型糖蛋白Ａ（ＧＰＡ）为识别标志,对５例厚１２￣４０周的孕妇外周血进行密度离心富集胎儿有核红细胞,并经流式细胞分析及ＰＣＲ技术扩增Ｙ特异性序列以鉴定富集效果。结果：５例孕妇外周血富集后流式细胞分析结果,ＧＰＡ＾＋细胞含量平均为上层２．３８％,下层１８．１８％,富集后下层ＧＰＡ＾＋细胞含量是上层的７．６倍;ＰＣＲ扩增结果,     

单抗CD71用于荧光激活细胞分选法富集分选母血中的胎儿细胞

目的:研究转铁蛋白受体(CD71)抗体对单个核细胞的标记情况,探讨该单克隆抗体识别胎儿细胞的有效性。方法:选用CD71抗体对92例正常孕妇外周血、15例未孕妇女外周血和15例胎儿脐血单个核细胞进行标记,并用于荧光激活细胞分选法富集分选母血中的胎儿有核红细胞。结果:孕10～35周的孕妇外周血中CD71阳性细胞的比例为(5.59±4.83)×10-2,与未孕妇女外周血及胎儿脐血中CD71阳性细胞的比例比较,均差异有极显著性(P<0.001)。结论:孕妇外周血中存在胎儿细胞,单抗CD71可以作为一种有效识别抗体用于母血中胎儿细胞的分选,从而为进一步的无创性产前诊断工作打下基础。     

孕妇外周血中胎儿有核红细胞数量与胎盘损伤的相关性研究

母体外周血中存在胎儿有核红细胞(FNRBC),这一现象经国内外学者的大量研究已得到证实.有发现,某些病理妊娠状态下,母体外周血中存在胎儿有核红细胞有增多的情况[1].胎盘损伤可影响母体与胎儿之间的物质交换,造成胎儿缺氧、胎儿窘迫、胎儿生长受限、妊娠期高血压疾病等,而这些疾病又可引起或加重胎盘损伤,形成恶性循环,危害孕妇及胎儿健康.因此在孕期了解胎盘损伤的程度,并以此了解胎儿的发育及孕妇妊娠状况有着重要的临床意义.     

孕妇外周血中胎儿有核红细胞数量与胎儿窘迫的关系

目的:探讨孕妇外周血中胎儿有核红细胞(nucleatedredbloodcells,NRBC)数与胎儿窘迫的关系。方法:对54名孕龄32～42周,年龄19～35岁(包括19名急性胎儿窘迫,15名慢性胎儿窘迫)的孕妇外周血进行不连续密度梯度离心,对分离后的细胞进行制片、染色,显微镜下进行NRBC计数,比较组间差异。结果:15名慢性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目为(23.26±6.75)个/7mL;同孕龄正常妊娠妇女外周血中NRBC数目为(9.43±4.01)个/7mL,两者间差异有显著性(P<0.05)。19名急性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目为(10.87±4.29)个/7mL,与正常妊娠间差异无显著性(P>0.05)。结论:慢性胎儿窘迫孕妇外周血中NRBC数目明显升高,为胎儿窘迫的临床预测和评估提供了一条新思路。     

免疫荧光染色法检测结核分支杆菌的建立与临床应用

目的建立免疫荧光染色法特异性检测结核分支杆菌,提高痰涂片阴性肺结核患者的诊断率。方法随机选取浸润型肺结核患者57例作为实验组,其中痰涂片抗酸染色阳性患者28例,痰涂片阴性患者29例;对照组13例,为呼吸道其它细菌感染者。受检者晨起留取痰液,高温高压后与标本等量的5%次氯酸钠溶液混合,离心后分别行直接涂片抗酸染色检查或免疫荧光染色法检查。结果 57例浸润型肺结核患者中,28例痰涂片抗酸染色检查阳性,免疫荧光染色法检测仍阳性;在29例痰涂片阴性肺结核患者中,免疫荧光染色法检测15例阳性。13例呼吸道其他细菌感染者者经免疫荧光染色法检测与抗酸染色均为阴性。结论免疫荧光染色法检测结核分枝杆菌具有特异性,显著提高痰菌阴性肺结核的诊断率。     

结核性脑膜炎患者中几种病原诊断检测技术的应用

目的探讨不同病原学检测方法在结核性脑膜炎(结脑)临床诊断中的应用。方法对临床诊断为结脑患者60例(结脑组)和非结脑患者70例(非结脑组)的脑脊液标本,同时进行离心涂片抗酸染色、结核菌BACTEC MGIT 960快速培养、实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)、玻片离心改良抗酸染色检测,并对其结果进行比较分析。结果结脑组标本中,涂片抗酸染色、结核菌快速培养、FQ-PCR检测、玻片离心改良抗酸染色法的检出率分别为11.7%(7/60)、6.7%(4/60)、48.3%(29/60)、61.7%(37/60)。非结脑组中2例玻片离心改良抗酸染色阳性。玻片离心改良抗酸染色法检出率高于其他3种检测方法,差异有统计学意义(P0.05),且能发现细胞内抗酸杆菌,应用该种方法检测,4例结核菌培养阳性患者的8份脑脊液标本均为阳性。结论玻片离心改良抗酸染色法操作简便、快速,可明显提高脑脊液中抗酸杆菌的检出率,既能检出细胞外抗酸杆菌,也可检出细胞内抗酸杆菌,此方法可能有助于提高病原检测的阳性率,值得进一步探讨其在结脑早期诊断中的临床意义。     

孕妇外周血胎儿有核红细胞富集的孕周选择

目的 利用抗转铁蛋白受体（CD71）抗体和抗白细胞共同抗原（CD45）抗体双标法，检测不同孕周孕妇外周血中有核红细胞的比例，以期选择最佳孕周进行胎儿有核红细胞富集。方法 采用抗-CD71抗体和抗-CD45抗体双标法，应用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测81例不同孕周孕妇外周血中有核红细胞的比例，并与未孕组和脐血组进行对照。结果 孕7～34周孕妇外周血中CD71^＋／CD45^dim细胞的比例为（0．107土0．063）×10^-2，与未孕组和脐血组相比差异均有统计学意义；CD71^＋／CD45^dim细胞在外周血中的比例在孕17～18周达峰值，为（0．144土0．096）×10^-2。结论 不同孕周孕妇外周血有核红细胞比例不同，孕17～18周比例最高。利用母血循环中的胎儿有核红细胞进行产前诊断，其最佳时间可选择在妊娠17～18周。     

孕妇外周血胎儿ABO血型基因分型技术的建立

本研究目的是建立孕妇外周血胎儿ABO血型基因分型技术,用于ABO血型不合引起的新生儿溶血病的产前诊断。根据ABO血型基因DNA全序列和mRNA序列设计4对引物,选择20例健康供者血浆,提取血浆中DNA进行扩增,探索最佳的血浆DNA提取及PCR扩增条件,初步建立单人ABO血型基因分型技术。将O型血浆DNA与A型或B型血浆DNA按1：1、2：1、4：1、8：1、10：1、20：1、40：1、100：1进行混合,模拟孕妇外周血胎儿与孕妇自身ABO基因混合状态,建立混合ABO血型基因分型技术。选取14例孕30周以上的孕妇外周血标本,进行胎儿ABO血型基因型鉴定,并对孕妇进行追踪,尽量获取胎儿出生以后的外周血标本进行ABO血型鉴定,以评价孕妇外周血胎儿ABO血型基因分型技术的灵敏度与准确性。结果表明：单人血浆进行准确血型鉴定的最少模板DNA量约为0．625ng,500μl血浆提取的DNA量即可达到PCR扩增要求;当混合血浆中O型DNA所占比例≤10时,可以准确检测出非0基因的存在;14名O型孕妇外周血标本中9例标本扩增出非O型基因,5例未扩增出非0基因;通过血清学方法对5例胎儿出生后外周血进行ABO血型鉴定,其中A型3例,B型1例,O型1例,与其基因分型结果一致,符合率100％。结论：本研究建立的孕妇外周血胎儿ABO血型基因提取、分型技术,可以对妊娠中晚期胎儿ABO血型基因型进行准确鉴定,从而为新生儿溶血病的产前诊断与预防提供指导意见。     

应用流式细胞术从孕妇外周血分选胎儿有核红细胞并进行DYS14基因扩增与检测

目的 从孕妇外周血分选胎儿有核红细胞，对DYS基因进行扩增，并对扩增准确率进行分析。方法 应用流式细胞术(flow cytometry，FCM)从孕妇外周血分选胎儿有核红细胞(Nucleated red blood cells，NRBCs)，应用套式PCR特异性扩增DYSl4基因，琼脂糖凝胶电泳检测。结果 30例受检中：共有男婴18例，有核红细胞组DYSl4基因的检出率为50．0％(9／18)。结论 NRBCs分选技术的建立使非创伤性产前基因诊断成为可能，但如何进一步改进方法提高分选率，确保诊断的灵敏性，降低漏诊率，仍是需要进一步解决和完善的问题。     

母血中胎儿有核红细胞的分离及无创性产前基因诊断研究

目的 从母血循环中分离、富集、鉴定和提取胎儿有核红细胞，建立遗传病无创性产前基因诊断方法。方法 取２５名妊娠８～３６周的孕妇静脉血，加载在细胞分离液Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１．０７７上分离单个核细胞（ＭＮＣ）；用包被ＣＤ７１抗体的ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ－４５０ＣＤ２１免疫磁珠或包被ＣＤ４５抗体的ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ－４５０ＣＤ４５免疫磁珠富集ＭＮＣ中的胎儿有核红细胞：ａｎｔｉ－ξ－ｂｉｏｔｉｎ或ａｎｔｉ     

流式细胞术非侵入性检测胎儿血型的研究

目的　建立流式细胞术非侵入性检测胎儿ABO、Rh(D)血型的实验方法。方法　采用吸收放散试验 ,从人源血清中获得IgG抗 A、抗 B试剂。依据胎儿父母的血型 ,选择IgG的抗 A、抗 B和抗 D作一抗与孕妇外周血红细胞反应 ,以羊抗人IgGF(ab′) 2 FITC作二抗连接A、B、D抗体 ,同时用抗 i PE标记孕妇外周血中的胎儿红细胞。依据所获荧光标记 (FITC和PE)的孕妇和胎儿细胞的散点图格局 ,分析胎儿细胞的ABO和Rh血型。结果　应用所研究的流式细胞检测技术 ,对 6 9名妊娠 8～ 39周的孕妇检测 ,13名孕妇外周血中因未检出胎儿红细胞而无法鉴定 ,其余 5 6名孕妇均检出胎儿细胞 ,她们的胎儿血型产前检测结果与胎儿出生后的检测结果完全吻合。结论　流式细胞术方法能在产前准确和无损伤地检测胎儿血型 ,可用于怀孕期间的新生儿溶血病的诊断和预防工作     

CD8＋CD28-调节性T细胞在子痫前期患者外周血中的表达及意义

[目的]探讨子痫前期（PE）患者外周血CD8＋ CD28-调节性T细胞数量的变化及其临床意义.[方法]选择住院确诊的重度子痫前期（SPE）孕妇24例（A组）、轻度子痫前期（MPE）孕妇20例（B组）为研究对象,以30例正常妊娠晚期孕妇为对照组（C组）,采用流式细胞技术检测并比较三组外周血中CD8＋ T细胞表面CD28分子的表达.[结果]A组、B组孕妇外周血CD8＋ CD28-调节性T细胞表达水平均显著低于C组（P〈0.05）;而A组、B组CD8＋ CD28＋T细胞表达水平均显著高于C组（P〈0.05）.[结论]子痫前期患者体内存在外周血CD8＋ CD28-调节性T细胞的异常,其数量的减少使T细胞免疫抑制功能减弱,参与了PE的病理过程,导致PE的发生.     

超声引导羊膜腔穿刺术及脐带穿刺术在产前诊断胎儿地中海贫血中的应用

目的探讨超声引导羊膜腔穿刺术(AC)和脐带穿刺术(FBS)在产前诊断胎儿地中海贫血(MA)中的应用价值。方法将夫妇均为MA基因携带者的58例孕妇按孕周的大小分为两组,16～20孕周38例为AC组,21～36孕周20例为FBS组,分别抽取羊水标本和脐带血标本进行MA基因分析。结果AC组一针成功率为100%,穿刺经胎盘占21%,心动过缓发生率为零,标本母血污染率2.6%;FBS组一针成功率85%,穿刺经胎盘占48%,心动过缓发生率10%,标本送检成功率100%。结论AC操作简便,安全,而FBS虽风险较大,但标本送检成功率高,适用的孕周较长,可弥补AC的不足。AC和FBS在产前诊断MA中均发挥了重要的作用。     

骨科手术中回收血红细胞与患者麻醉前红细胞携氧能力的比较

[目的]比较骨科患者术中回收血红细胞与麻醉前红细胞携氧能力的差异.[方法]使用血液回收机对30例骨科手术患者行术中自体血液回收.取血液回收机处理后的回收血和麻醉前患者外周血各30份,检测两组血样的pH、根据公式计算血样的50%氧分压(P50),采用放射免疫法测定红细胞内2,3-二磷酸甘油酸浓度(2,3-DPG)、在血液...     

外周血淋巴细胞亚群、细胞因子在未足月胎膜早破孕妇中水平变化及与绒毛膜羊膜炎发生的相关性研究

目的探究外周血T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞亚群及细胞因子在未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membrane,PPROM)孕妇中水平变化及与绒毛膜羊膜炎发生的相关性。方法选取2018年1月—2019年12月于本院就诊的PPROM孕妇50例作为研究组,以同期未发生胎膜早破孕妇50例作为对照组。比较两组血清中淋巴细胞亚群(T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+、CD56,外周血B淋巴细胞亚群CD19+)和细胞因子[Th1型细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β),Th2型细胞因子白细胞介素-6(IL-6)]水平;记录所有患者并发绒毛膜羊膜炎情况,采用多元Logistic回归分析探讨PPROM患者发生绒毛膜羊膜炎的影响因素;采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析PPROM患者外周血淋巴细胞亚群和细胞因子对绒毛膜羊膜炎发生的预测价值。结果研究组CD4+、CD8+、CD19+及IL-6、IFN-γ、TNF-β水平较对照组高,CD56水平较对照组低,差异有统计学意义(P<0.01)。绒毛膜羊膜炎组羊水过少人数多于无绒毛膜羊膜炎组,CD4+、CD8+、CD19+、IL-6、IFN-γ、TNF-β水平较无绒毛膜羊膜炎组高,CD56水平较无绒毛膜羊膜炎组低,差异均有统计学意义(P<0.01)。CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β水平异常及羊水过少是PPROM患者并发绒毛膜羊膜炎的独立危险因素(P<0.05或P<0.01)。ROC曲线分析显示:CD4+、CD8+、CD19+、CD56、IL-6、IFN-γ、TNF-β联合检测诊断效能最佳。结论外周血T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、CD56)、B淋巴细胞亚群(CD19+)及细胞因子(IL-6、IFN-γ、TNF-β)水平在PPROM患者中异常表达,其为PPROM患者并发绒毛膜羊膜炎的独立危险因素,联合检测各指标可作为判断PPROM患者并发绒毛膜羊膜炎的指标。     

急性胎盘缺血时脐血流改变的实验研究

目的 研究在不同胎盘缺血情况下胎羊脐带动静脉血流信号的变化。方法 双胎妊娠母羊2只，分别对其胎羊进行结扎脐动脉，结扎胎盘小叶及螺旋脐带等处理，观察脐血流的改变。结果 结扎—根脐动脉使脐血流阻力增高，胎盘小叶被结扎60％时，脐动静脉血流均有改变。结论 胎盘代偿功能正常下出现胎盘缺血情况，胎羊通过一系列生理调节将脐血流维持在正常范围，胎盘功能失代偿时，先出现脐动脉血流变化，继而出现不可逆脐静脉血流变化。在胎盘缺血情况下，脐带螺旋易引起脐血流改变。