抑制Smad7的表达对肾小管上皮细胞的影响

目的:本研究旨在观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导肾小管上皮细胞Smad7表达变化,以及对其凋亡及增殖的影响。方法:大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E分别与终浓度为0(对照组)、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/LAngⅡ共培养24h。通过AnnexinV-FITC/PIKit用流式细胞仪检测细胞凋亡指数,用免疫组化的方法检测增殖性细胞核抗原(PCNA)和Smad7蛋白的表达,RT-PCR检测Smad7mRNA的表达水平。结果:随着AngⅡ浓度的增加,10-6mol/LAngⅡ组与对照组相比凋亡指数显著增加,分别为(27.06±1.14)%vs(3.09±0.73)%(P<0.001)。与对照组相比,Smad7的表达在含有AngⅡ组中均呈现出低表达水平,并在一定范围内随AngⅡ浓度的增加而逐渐受到抑制,并与细胞凋亡指数成负相关(r=-0.82,P<0.05)。结论:AngⅡ可以抑制肾小管上皮细胞Smad7的表达,同时促进细胞凋亡,二者具有密切关系。     

氯沙坦及培哚普利对高糖诱导NRK-52E细胞转分化作用研究

目的:探讨氯沙坦及培哚普利对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E转分化干预作用.方法:作用72 h后,Western blot检测空白组、高糖组、高糖氯沙坦干预组、高糖培哚普利干预组以及高糖氯沙坦培哚普利联合干预组中转化因子β1、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶2、α平滑肌肌动蛋白以及甲状旁腺素相关肽在NRK-52E细胞表达.活性氧含量应用CM2H2DCFDA检测.结果:高浓度葡萄糖能上调转化因子β1、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶2、α平滑肌肌动蛋白以及甲状旁腺素相关肽表达.氯沙坦及培哚普利能显著下调高浓度葡萄糖状态下转化因子β1、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶2、α平滑肌肌动蛋白和甲状旁腺素相关肽表达,以及降低活性氧含量.结论:氯沙坦及培哚普利可以抑制高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化.     

干细胞相关因子在大肠癌组织及SW620细胞株的表达

背景：肿瘤细胞有多种干细胞标记的表达,深入研究其表达规律有助于揭示肿瘤发病机制、完善肿瘤干细胞理论。目的：检测大肠癌实体组织中干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1与癌旁组织的表达差异,以及CD133免疫磁珠分选阳性与阴性SW620细胞中上述基因的表达差异。方法：选临床病理诊断清楚的29例大肠癌组织标本提取RNA,RT-PCR检测CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1在大肠癌组织与癌旁对照组织中的表达。CD133免疫磁珠分选SW620,提取CD133细胞与CD133阴性细胞RNA,RT-PCR检测分选后上述基因的表达差异。结果与结论：29例标本均诊断为低、中分化腺癌或黏液腺癌,干细胞相关分子标记癌组织与癌旁组织表达灰度相对值癌组织表达均高于癌旁组织（P〈0.05）。RT-PCR检测分选后CD133＋细胞CD133,CD166,Oct4,Sox2,C-myc,Klf4,Bmi-1表达,结果均高于CD133-细胞。提示,CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1相关干细胞标记可作为大肠癌肿瘤干细胞标记并有望用于诊断检测。     

干细胞相关因子在大肠癌组织及SW620细胞株的表达

背景:肿瘤细胞有多种干细胞标记的表达,深入研究其表达规律有助于揭示肿瘤发病机制、完善肿瘤干细胞理论。目的:检测大肠癌实体组织中干细胞相关分子标记CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1与癌旁组织的表达差异,以及CD133免疫磁珠分选阳性与阴性SW620细胞中上述基因的表达差异。方法:选临床病理诊断清楚的29例大肠癌组织标本提取RNA,RT-PCR检测CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1在大肠癌组织与癌旁对照组织中的表达。CD133免疫磁珠分选SW620,提取CD133细胞与CD133阴性细胞RNA,RT-PCR检测分选后上述基因的表达差异。结果与结论:29例标本均诊断为低、中分化腺癌或黏液腺癌,干细胞相关分子标记癌组织与癌旁组织表达灰度相对值癌组织表达均高于癌旁组织(P<0.05)。RT-PCR检测分选后CD133+细胞CD133,CD166,Oct4,Sox2,C-myc,Klf4,Bmi-1表达,结果均高于CD133-细胞。提示,CD133、CD166、Oct4、Sox2、C-myc、Klf4、Bmi-1相关干细胞标记可作为大肠癌肿瘤干细胞标记并有望用于诊断检测。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性.方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果与结论:人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性.结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.     

TGF—β1诱导肾小管上皮细胞转分化过程中对细胞骨架的影响

目的观察TGF-β1在诱导肾小管上皮细胞转分化过程中对细胞骨架的调节作用。方法选择正常大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E,经TGF-β1（15μg／L）体外诱导3天,RT-PCR检测细胞廿平滑肌动蛋白（α-SMA）评价细胞的转分化状态,观察细胞形态,同时检测细胞骨架成分β-actin、α—tubulin mRNA的表达;免疫荧光染色观察上述细胞骨架蛋白在细胞内的排列。结果培养的NRK52E细胞经TGF-81体外诱导3天后,细胞中α—SMAmRNA的表达水平明显增多,高于相应的对照组细胞（P〈0．001）,说明NRK52E上皮细胞出现了表型转化,此时培养细胞的形态也发生了改变,由典型的鹅卵石样变为成纤维细胞样,并有多个突起;细胞骨架蛋白β-actinmRNA的表达也明显增多（P〈0．05）;β—actin蛋白的排列也发生了改变,其在胞膜下形成的厚的板样结构消失,转而在胞浆中形成粗大的束状应力纤维,沿细胞长轴纵行排列,此外,β-actin尚在某些细胞边缘形成了片层样伪足和丝状伪足。微管成分α-tubulinmRNA的表达和分布与对照组比较无明显不同。结论TGF-β1能够诱导体外培养的NRK52E细胞转分化,在此过程中细胞形态发生了改变,骨架蛋白β-actin的表达增多并发生了重建,同时骨架蛋白α—tubulin未见明显变化。     

血管紧张素Ⅱ参与肾间质成纤维细胞自分泌TGF- β1 的实验研究

目的通过观察血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）对正常大鼠肾间质成纤维细胞株NRK．49F自分泌TGF- β1 的影响,探讨其参与肾小管间质纤维化的作用机制。方法用不同浓度Ang1I（10^-6,10^-7,10^-8, 10^-9mol／L）刺激NRK．49F（6h,12h,24h,和48h）。蛋白免疫印迹法检测TGF- β1 受体（T13RD的表达。ELISA方法检测细胞上清液中TGF-1的浓度。结果（1）AngⅡ（10^-7mol／L）能刺激NRK-49F细胞分泌TGF- β1 ,其表达量在刺激细胞6h后即开始增加,12h后达到峰值,24h和48h仍能维持较高的水平;（2）AngⅡ（10-9mol／L）能够上调NRK．49F细胞TBRI的表达。结论AngⅡ参与肾问质成纤维细胞自分泌TGF- β1 ,从而促进。肾小管问质纤维化的发生发展。     

两种人羊膜细胞的表型鉴定和分化潜能测定(英文)

本研究旨在分离、培养和表型鉴定两种人羊膜细胞并分析其多向分化潜能。羊膜中可分离出来源于外胚层的羊膜上皮细胞和来源于中胚层的羊膜间充质细胞。用流式细胞术和免疫荧光法对其进行表型鉴定,同时用免疫荧光法分析其多向分化潜能。结果表明:两种人羊膜细胞阳性表达HLA-A,B,C和间充质干细胞的标志(CD29,CD73,CD44,CD59,CD90,CD105,CH166),不表达造血干细胞的标志(CD31,CD34,CD45,HLA-DR),弱表达协同刺激分子(CD40,CD40L,CD80,CD86),且这些表型的表达量在第3-7代都维持稳定。免疫荧光法显示羊膜上皮细胞表达角蛋白19,不表达波形蛋白,而羊膜间充质细胞则相反。对其多向分化潜能测定显示,羊膜间充质细胞更好地向心肌细胞分化,而羊膜上皮细胞更好地向神经细胞分化。结论:从羊膜中可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞,两种细胞的表型相似,多向分化潜能却不同。羊膜上皮细胞具有更好的外胚层分化潜能,而羊膜间充质细胞更好地向中胚层分化。此结论对细胞治疗有很好的指导作用。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的探讨兔骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定的方法。方法全骨髓贴壁法提取兔骨髓中的间充质干细胞,流式细胞术检测细胞表面分子CD14、CD29、CD34、CD44、CD45和CD90等标志的表达以及不同代次兔BM-SCsDNA含量。通过定向分化检测兔BMSCs的多向分化潜能。结果兔骨髓间充质干细胞呈形态较为均一的小梭形、克隆样生长。流式细胞术检测结果显示,传代至第12代和20代的兔骨髓间充质干细胞检测对数生长期细胞的DNA含量结果显示细胞为正常二倍体细胞,无明显变异。细胞表面表达CD29（61.71%）、CD44（60.2%）,不表达CD14（0.4%）、CD34（0.34%）、CD45（0.64%）和CD90（0.04%）。兔BMSCs的定向分化结果显示其可向成骨细胞、脂肪细胞及成软骨细胞分化。结论成功获得具有多向分化潜能的兔骨髓间充质干细胞,其具有特定的细胞表面抗原,具有容易获取、增殖能力强等特点,是优良的组织工程种子细胞。     

尿酸钠结晶影响肾小管上皮细胞的紧密连接

背景：目前研究来看,尿酸性结石与紧密连接蛋白及肾间质纤维化的关系仍未明确。目的：观察尿酸钠结晶对肾小管上皮细胞紧密连接的影响。方法：配制单钠尿酸钠晶体。将正常大鼠肾小管上皮细胞随机分为对照组和尿酸钠结晶组,分别用无血清培养基和尿酸钠结晶进行培养。免疫荧光和RT-PCR方法检测24,48,72h紧密连接蛋白的表达。结果与结论：与对照组比较,尿酸钠结晶于不同时相刺激NRK-52E细胞后,紧密连接蛋白和mRNA表达下降（P〈0.05）,72h时下降显著（P〈0.01）,蛋白表达出现重新分布现象。说明尿酸钠结晶可破坏肾小管上皮细胞紧密连接蛋白的结构、功能及导致分布异常。     

去脂牛血清白蛋白超载对NRK-52E细胞葡萄糖调节蛋白78、氧调节蛋白150及细胞凋亡的影响

目的 探讨去脂牛血清白蛋白(d-BSA)超载大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)对内质网应激(ERS)经典标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、氧调节蛋白150(ORP150)及细胞凋亡率的影响.方法 以不同浓度(1、5、10、20、50 mg/ml)的d-BSA超载NRK-52E细胞为实验组,以正常培养的NRK-52E细胞为对照组,观察各组细胞GRP78、ORP150和细胞凋亡率的情况;观察作用时间(6、12、24 h)对d-BSA(20 mg/ml)超载的NRK-52E细胞GRP78、ORP150和细胞凋亡率的影响情况.通过免疫细胞化学法测定NRK-52E细胞GRP78的表达量,Western blot法测定ORP150的表达量,流式细胞术检测NRK-52E细胞的凋亡率情况.结果 (1)浓度为1 mg/ml的d-BSA孵育NRK-52E细胞24 h后GRP78、ORP150的表达量及细胞凋亡率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).(2)浓度为5 mg/ml的d-BSA孵育NRK-52E细胞24 h后,细胞内GRP78、ORP150表达量与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),且浓度为10、20、50 mg/ml的d-BSA组的表达量显著增加(P<0.01).(3)浓度为5 mg/ml的d-BSA孵育NRK-52E细胞12 h后,细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),且浓度为10、20、50 mg/ml的d-BSA组细胞凋亡率显著增加(P<0.01).(4)浓度为20 mg/ml的d-BSA孵育NRK-52E细胞6 h后,细胞内GRP78、ORP150表达量即有增加(P<0.05);12、24 h后,两者表达量与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01).(5)细胞凋亡率在浓度20 mg/ml的d-BSA孵育6 h后即升高,但与对照组相比无统计学差异;12、24 h后,细胞凋亡率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 d-BSA超载NRK-52E细胞可以促进细胞内GRP78、ORP150的表达;当d-BSA浓度过大或者孵育时间过久,细胞凋亡率升高.     

高糖上调肾小管上皮细胞Toll样受体2的表达

目的探讨葡萄糖对大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体2(TLR2)表达的影响。方法大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液传代培养。根据培养液葡萄糖浓度分组。培养24小时后用Western blot及RT-PCR方法检测各组肾小管上皮细胞TLR2蛋白及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达。结果肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)表达TLR2,高浓度葡萄糖可增加肾小管上皮细胞TLR2的表达。高浓度葡萄糖刺激肾小管上皮细胞表达MCP-1 mRNA显著上调。结论高浓度葡萄糖上调肾小管上皮细胞TLR2的表达,诱导炎症趋化因子增加。     

NADPH氧化酶抑制剂对高糖刺激大鼠近端肾小管上皮细胞中内质网应激的作用机制探讨

目的探讨在有或无还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂存在的条件下,高糖刺激大鼠近端肾小管上皮细胞中内质网应激蛋白GRP78及凋亡蛋白caspase-12表达的变化,从细胞和分子水平探讨糖尿病肾病中氧化应激和内质网应激的相互作用机制。方法大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)培养,使用高糖(30mmol/L)DMEM培养基刺激NRK52E细胞24 h,荧光显微镜检测细胞内活性氧ROX的产生量,Western-blot检测细胞内内质网应激蛋白GRP78及凋亡蛋白Caspase12的表达;并且使用NADPH氧化酶抑制剂DPI(10μM)预处理细胞,并观察其对细胞内ROX产生及GRP78和Caspase12蛋白的表达影响。结果高糖刺激24 h可明显增加细胞内ROS的产生,为正常对照组的2.5倍(P<0.05)。NADPH氧化酶抑制剂DPI(10μΜ)预处理后,高糖诱导的细胞内ROS产生明显受到抑制,较高糖刺激刺激组降低了43.69%(P<0.05)。高糖刺激NRK52E细胞24 h后可,细胞内内质网应激蛋白GRP78蛋白表达显著上调,为正常对照组的5倍(P<0.05)。与正常对照组相比,高糖刺激组NRK52E细胞凋亡相关蛋白caspase12的表达也显著增加(P<0.05)。NADPH氧化酶抑制剂DPI(10μΜ)预处理后并高糖刺激NRK52E细胞24 h,与高糖刺激组相比,DPI处理组NRK52E细胞内质网应激蛋白GRP78表达显著下调(P<0.05),凋亡相关蛋白caspase12的表达显著下调(P<0.05)。结论高糖刺激大鼠近端肾小管上皮细胞后,细胞内发生氧化应激与内质网应激反应,并且氧化应激可能作为上游信号诱导细胞内内质网应激反应的发生,并最终导致细胞凋亡的发生。     

黄芪甲苷孵育脂肪源性干细胞对顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

背景：干细胞移植用于治疗急性肾损伤的有效性已经被多个研究证实,但其对肾小管上皮细胞损伤的修复机制尚不明确。目的：观察黄芪甲苷孵育后的脂肪源性干细胞对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的保护作用及机制。方法：实验分为4组。2.5μmol/L顺铂诱导肾小管上皮细胞24 h,建立肾小管细胞损伤模型（顺铂损伤组）;将脂肪源性干细胞与损伤肾小管上皮细胞共培养（脂肪源性干细胞＋损伤肾小管上皮细胞组）;利用 Transwel小室将20 mg/L黄芪甲苷孵育脂肪源性干细胞48 h后与损伤肾小管上皮细胞共培养（黄芪甲苷孵育脂肪源性干细胞＋损伤肾小管上皮细胞组）;以正常肾小管上皮细胞做对照（正常对照组）。结果与结论：与肾小管上皮细胞损伤组相比,AV/PI和TUNEL结果均显示脂肪源性干细胞＋肾小管上皮细胞组和20 mg/L 黄芪甲苷脂肪源性干细胞＋肾小管上皮细胞组肾小管上皮细胞发生凋亡的比例和数量明显减少;ELISA结果表明20 mg/L黄芪甲苷脂肪源性干细胞＋肾小管上皮细胞组胰岛素样生长因子1分泌显著提高（P＆lt;0.05）;Western blot进一步显示20 mg/L 黄芪甲苷脂肪源性干细胞＋肾小管上皮细胞组caspase-3蛋白水平明显下降,而Bcl-2的表达量明显增加（P＆lt;0.05）。表明黄芪甲苷孵育的人脂肪源性干细胞对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有抑制作用,从而有利于肾小管损伤的早期恢复,其保护机制可能与增加胰岛素样生长因子1分泌,抑制caspase-3表达、上调Bcl-2水平有关。     

氧化应激对大鼠肾小管上皮细胞生物学行为的影响及L-EGCG的保护作用

[目的]探讨氧化应激对大鼠肾小管上皮细胞（NRK）生物学行为的影响及L -表没食子儿茶素没食子酸酯（L -EGCG）对NRK细胞氧化性损伤的保护作用.[方法]利用H2O2刺激离体培养的NRK细胞建立氧化损伤的模型,筛选H2O2对NRK细胞损伤研究的最适剂量与最佳时点.然后将培养细胞分EGCG正常对照组、H2O2组、不同浓度儿茶素组.MTT法检测细胞活力,流式细胞仪测定细胞凋亡,荧光探针JC-1测定线粒体膜电位.利用生物化学法检测各组NRK细胞培养上清中丙二醛（MDA）含量及乳酸脱氢酶（LDH）漏出量.[结果]①250 μmol/L H2O2作用6 h剂量组即可引起NRK细胞损伤;②L-EGCG能明显改善H2O2导致的细胞损伤,可使细胞存活率升高,LDH释放量降低,MDA生成减少,稳定了线粒体膜电位,减轻了细胞凋亡.[结论]氧化应激能导致大鼠肾小管上皮细胞活力下降,凋亡增加,L-EGCG可能是通过提高NRK细胞的抗氧化能力而提高其对H2O2损伤的保护及损伤修复能力.     

前列腺素E1对1-甲脲乙醇酸酐所致肾小管上皮细胞损害的保护作用

[目的]研究前列腺素E1 (PGE1)对1-甲脲乙醇酸酐所致肾小管上皮细胞凋亡的保护作用.[方法]人近端肾小管上皮细胞(HK2)分三组培养,A组正常对照组;B组1-甲脲乙醇酸酐组:培养基中加入0.5 mmol/L1-甲脲乙醇酸酐;C组PGE1+1-甲脲乙醇酸酐组:培养基中加入0.5 mmol/L 1-甲脲乙醇酸酐和PGE12μg/L.培养48 h后用MTT比色法测光密度(OD)值,并检测培养液NAG酶(N-乙酰-p氨基葡萄糖苷酶)活性;用Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测胞凋亡.[结果]B组HK-2细胞OD值较A组显著下降,NAG酶活性上升;C组较B组OD值显著上升而NAG酶活性下降;B组HK-2细胞凋亡率显著高于对照组,C组的凋亡率较B组显著下降,其差异均有统计学意义(P＜0.01).[结论]1-甲脲乙醇酸酐有促进肾小管上皮细胞凋亡的作用.PGE1对1-甲脲乙醇酸酐所致肾小管上皮细胞凋亡有一定的保护作用.