EV71-CA16肠道病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒的研制

目的研制一种能同时检测EV71,CA16肠道病毒的二联实时荧光定量PCR检测试剂盒,主要用于EV71,CA16肠道病毒的快速检测和流行病学监测。方法设计特异度的EV71型、CA16型基因的引物和探针,优化实时荧光定量PCR检测体系,并研究产品的灵敏度、精密度、稳定性和检测线性范围;同时对2014年5月份收集的26份样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒,线性范围在5*102 copies/μl～105 copies/μl,该范围内检测结果良好;优化后肠道病毒CA16上下游引物和探针浓度分别为0.48,0.24μmol/L,EV71上下游引物和探针浓度分别为0．40,0.20 μmol/L。敏感度达到500 copies/μl,重复性变异系数CV≤5％;该荧光定量PCR检测试剂盒稳定性强,在-20℃下可以保存一年,对EV71,CA16肠道病毒具有良好的特异度。用该方法检测20份临床阳性样品和6份阴性样品,阳性检出率为100％(20/20),阴性检出率为100％(6/6)。结论试验建立的EV71,CA16肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于EV71,CA16肠道病毒的临床诊断。     

荧光定量RT-PCR检测Rac1 mRNA基因及其与胃癌转移的关系

目的 探讨肿瘤转移相关基因Rac1水平与胃癌转移的相关性,并评价分析Rac1 mRNA基因在胃癌转移和区分胃良、恶性病变中的价值.方法 用荧光定量RT-PCR TaqMan探针技术,选择Rac1基因目的 片段,与pET-20b(+)载体连接构建重组质粒,建立Rac1 mRNA荧光定量RTPCR标准曲线,并用于检测52份胃癌、癌旁组织及12份胃良性病变组织标本中Rac1 mRNA的含量,分析评价其与胃癌转移的关系.结果 胃癌组织中Rac1 mRNA表达阳性率和含量为100.0%,7.41×103 (3.50×105 ～4.36×106)拷贝/μl,癌旁组织为46.2%,0(0～1.73×104)拷贝/μl,良性病变组织为33.3%,0(0～3.55×103)拷贝/μl,3组间阳性率和Rac1 mRNA含量水平差异均有统计学意义(x2=43.16,x2k-w=64.19,P均＜ 0.01).当ROC曲线确定荧光定量RT-PCR检测Rac1含量的最佳临界值为1.73×104 拷贝/μl时,诊断胃癌组织标本的敏感度为88.5%,特异度为100.0%;当最佳临界值为7.49×103 拷贝/μl时,诊断胃癌是否发生淋巴结转移的敏感度为57.9%,特异度为78.6%.结论 荧光定量RT-PCR检测Rac1 mRNA对鉴别胃良、恶性病变及评价胃癌转移均有参考价值.     

双重PCR快速检测百日咳杆菌

目的:以百日咳毒素S1亚基启动子ptxA-Pr基因和插入序列IS481为目的基因,建立敏感、特异的双重PCR快速检测百日咳杆菌方法.方法:运用百日咳杆菌ptxA-Pr和IS481基因序列特异性引物,采用双重PCR技术同时扩增百日咳杆茵的特异性基因ptxA-Pr和IS481.通过构建目的质粒获得阳性对照,测序并与GenBank比对序列验证扩增产物.百日咳标准茵株DNA 10倍系列稀释为模板.采用此方法扩增双基因,检测此方法敏感性.扩增肺炎克雷伯茵、肺炎链球茵、铜绿假单胞茵、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及阳性样本DNA,检测此方法特异性.结果:百日咳杆菌标准株和阳性样本均能同时扩增ptxA-Pr和IS481目标序列,分别为191、145 bp.构建质粒后测序结果与GenBank对比一致.每个反应体系能检测到的标准菌株核酸最小量为1.65×10<'-2>ng.其他菌株检测未出现非特异性扩增.结论:双重PCR扩增百日咳杆菌ptxA-Pr和IS481基因的方法可用采特异快速的检测百日咳杆菌.     

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的 建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。 方法 以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物, 以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。 结果 建立的定量标准曲线阈值循环数（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为10^{2 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。 结论 实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。}     

基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨基于TaqMan探针的幽门螺杆菌23SrDNA基因片段的实时荧光定量PCR检测的有效方法。方法根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价,并对2012年5月至10月收集的100份临床样本进行检测同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析。结果建立了检测23SrDNA的实时荧光定量PCR方法：107-102copies/ul范围内均有＂S＂型扩增曲线,最低检测浓度为102copies/ul,标准曲线相关系数为1。对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线。对100份样本进行检测,实时荧光定量PCR能检出31份阳性,而免疫组化方法能检出25份阳性,银染方法能检出28份阳性。结论实时荧光定量PCR方法可成功检测幽门螺杆菌,且该方法具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。     

实时定量PCR检测胃癌组织miR-20a及初步应用

目的建立检测人胃癌组织中miR-20a的实时荧光定量PCR方法。方法建立miR-20a标准曲线,评价该法检测的线性范围及灵敏度;对标准质粒扩增产物进行熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳检测以分析该法的特异性。取高、中、低3份不同浓度的标准质粒进行批内和日间变异系数(CV)的检测,分析该法的重复性。收集70例胃癌患者手术切除的癌组织和对应的癌旁组织,定量检测组织中miR-20a的表达水平。结果构建的实时荧光定量PCR法的灵敏度为101copies/μL,扩增的线性范围为101～109copies/μL;扩增产物的熔解曲线峰和电泳片段特异;3份不同浓度标准质粒定量检测的批内CV分别为6.33%、4.74%、5.89%,日间CV分别为9.45%、6.29%、7.48%。定量结果显示75.7%(53/70)胃癌组织中miR-20a的表达高于癌旁组织,差异有显著性(Z=-4.427,P<0.01)。结论建立的实时荧光定量PCR检测miR-20a的方法准确、快速、灵敏、特异,可用于胃癌组织中miR-20a的检测。     

实时荧光定量PCR检测人粪便中空肠弯曲杆菌方法的建立与评价

目的：建立一种快速检测人粪便样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR方法。方法根据空肠弯曲杆菌保守序列设计特异引物,建立空肠弯曲杆菌的实时荧光定量 PCR检测法。对该方法的线性范围、抗干扰能力进行考察。同时采用培养法和实时荧光定量 PCR法对150例粪便样本进行检测,以培养法检测结果作为参照标准,对实时荧光定量 PCR方法的灵敏度、特异度、准确度和重复性进行考察。采用 Kappa检验对两种检测方法的结果进行统计学分析。结果建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好Y＝-3.51 Log（X）＋37.09,相关系数为0.996,理论检测下限为102 CFU/ml。抗干扰能力强,仅空肠弯曲杆菌出现特异性扩增曲线。与培养法相比,其灵敏度、特异度、准确度分别为92.4％,95.8％和94％;检测结果重复性良好（CV％＜5％）。统计学分析显示两种方法检测结果具有一致性,且一致性强度为极强（Kappa＝0.88,P＜0.05）。结论实时荧光定量PCR法能准确快速检测粪便样品中的空肠弯曲杆菌。     

荧光定量PCR方法检测儿童下呼吸道感染的人博卡病毒

目的建立并应用检测儿童下呼吸道感染病人博卡病毒的荧光定量PCR方法。方法选择人博卡病毒的NS1基因作为目标基因,设计荧光定量PCR引物和检测探针,以重组质粒为标准品建立标准曲线,从而建立特异性检测人博卡病毒的荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价;应用该方法对下呼吸道感染患儿的痰或吸痰、咽拭子及血清标本进行定量检测。结果本研究以人博卡病毒NS1基因中85bp的特异性保守片段为目标基因建立荧光定量PCR检测方法,质粒标准曲线的相关系数为0.999,灵敏度可达到50拷贝;应用该方法对下呼吸道感染患儿的痰或吸痰、咽拭子和血清标本进行定量检测,在176例痰或吸痰标本中检测到7例阳性标本,阳性率达到3.98%(7/176),另64例咽拭子标本中未检测到阳性标本,总阳性率为2.92%(7/240),240例血清标本均未检测到阳性标本。结论建立的荧光定量PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的人博卡病毒进行定量检测。痰或吸痰标本较咽拭子或血清标本更适用于人博卡病毒感染的核酸检测。     

ROX参比荧光在实时荧光定量RT-PCR检测Nrf2mRNA中的应用

目的 建立大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法,评价ROX参比荧光在其分析中的归一化校正作用.方法 采用Taq Man探针法构建大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法;取大鼠混合cDNA的Nrf2 PCR产物,经凝胶电泳和测序鉴定反应特异性;取PCR标准品10个浓度梯度(2.0×109～2.0×100)各1份进行实时荧光定量RT-PCR检测,分析ROX参比荧光校正与否的标准曲线的线性范围的变化;取高、中、低值重组质粒样本各1份进行批内重复20次和批间连续20次实时荧光定量RT-PCR检测,分析ROX参比荧光校正与否的批内、批间重复性差异.结果 成功建立大鼠Nrf2 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法;大鼠混合cDNA的Nrf2 PCR扩增片段与预期122 bp相符,测序结果扩增片段序列正确,PCR特异性好;标准品PCR扩增结果的标准曲线线性范围未经ROX参比荧光校正为2.0×109～2.0×102拷贝/μl(R2＞0.99),校正后为2.0×109～2.0×100拷贝/μl(R2＞0.99),校正后线性范围变宽100倍.高、中、低值样本重复性分析结果显示未经ROX参比荧光校正批内Ct变异系数(CV)为4.1%、2.7%、2.1%,批间CV为4.3%、3.0%、2.4%,校正后批内CV为0.7%、0.5%、0.4%,批间CV为1.0%、0.8%、0.7%,ROX参比荧光校正后样本Ct离散程度均低于未校正组,批内、批间的高值、中值浓度样本(高值组批内和批间t值分别为4.843、2.566,中值组批内和批间t值分别为4.293、4.423,P均＜0.05),但低浓度组的Ct离散度的差异无统计学意义(低值组批内和批间t值分别为0.753、1.279,P均＞0.05).结论 在构建大鼠Nrf2实时荧光定量RT-PCR检测方法中,加入ROX参比荧光,可加宽PCR标准曲线的线性范围,提高检测重复性,为准确分析大鼠模型Nrf2 mRNA表达水平奠定了基础.     

禽流感病毒H7N9型 实时荧光定量RT-PCR检测方法的研究

目的 建立一种快速准确诊断禽流感病毒H7N9型的实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法 参照国家生物技术信息中心(NCBI)公布的H7N9基因HA序列,设计特异性引物及TaqMan探针; 构建阳性重组质粒,验证其最低检测拷贝数、重复性及特异度。结果 试验构建的阳性重组质粒,线性关系在6×10² copies/μl～6×10⁸ copies/μl范围内检测结果良好; 用该方法测得最低拷贝数为600 copies/μl,特异度和重复性(CV<1%)良好,无交叉反应; 用该荧光定量RT-PCR检测方法检测8份阳性样品和8份阴性样品,准确率为100%(16/16)。结论 实验建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于禽流感病毒H7N9型的快速检测。     

A DNA hybridization test for detection of Bordetella in nasopharyngeal specimens

A cloned Bam H1 fragment of genomic Bordetella pertussis DNA which recognized a frequently repeated sequence in the genome of B. pertussis was used as a probe in a DNA hybridization assay for the detection of Bordetella. Extensive studies on cross-reactivity were carried out in standardized strains and in cultured swab specimens from patients without suspected pertussis. Hybridizations of cultured clinical specimens from 142 patients with suspected pertussis were in complete agreement with the standard identification methods. The recovery rate of B. pertussis from nasopharyngeal swabs was less than 50%. Therefore the possibility to detect low numbers of B. pertussis in solution (nasopharyngeal aspirates) was investigated. The detection limit of direct hybridization by dot-blot technique was 5 x 10(3)-10(4) B. pertussis. Culturing bacteria on membranes placed on agar plates prior to hybridization showed that the detection limit could be lowered to 10(4), 10(2), and 10(1) cfu after 1, 2 and 3 days' culture, respectively. DNA hybridization under these conditions was found to be sufficiently sensitive and specific for further evaluation in clinical specimens for diagnosis of pertussis.     

建立实时荧光LAMPA法检测肺炎支原体

目的:建立实时荧光环介导等温扩增(LAMP)法检测肺炎支原体。方法:在LAMP体系中添加适量荧光染料SYTO-9,通过实时定量PCR仪监测LAMP反应结果。以肺炎支原体P1基因重组质粒制备一系列浓度标准品,分别使用实时荧光LAMP法和SYBR GreenⅠ染料LAMP法检测,比较2种方法的检出限。肺炎支原体M129标准株菌液以10倍梯度稀释,分别以实时荧光LAMP法和肺炎支原体荧光PCR试剂盒检测,比较2种方法灵敏度。以实时荧光LAMP法检测常见呼吸道感染病原体肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌基因组DNA,评估该方法特异性。采集疑似肺炎支原体感染患儿咽拭子标本,分别以实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测,比较2种方法检出率差异。结果:实时荧光LAMP法可以检出P1基因最低限为103 copies/μL,当基因拷贝数大于104 copies/μL时,反应30 min样本组即可出现明显荧光信号。SYBR GreenⅠ染料LAMP法可以检出P1基因最低限为104 copies/μL,反应需1 h才可获得足够产物用于显色。实时荧光LAMP法灵敏度高于实时定量PCR法100倍,且对常见呼吸道病原体DNA无扩增。实时荧光LAMP法和荧光PCR法检测疑似肺炎支原体感染咽拭子标本的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实时荧光LAMP法可以有效避免因开盖检测造成的气溶胶污染,反应时间短,灵敏度高,适于在基层医院中推广使用。     

建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法

目的 建立敏感、特异的普通聚合酶链反应(PCR)方法和TaqMan 荧光定量PCR方法对产气肠杆菌进行快速检测。方法 以产气肠杆菌组氨酸脱氢酶基因(hdc)为靶基因设计引物以及TaqMan FAM探针,建立对产气肠杆菌进行检测的普通PCR方法和TaqMan 荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性。结果 普通PCR和TaqMan 荧光定量PCR方法均能对产气肠杆菌进行特异检测;普通PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为 100 copies/l和1.0105 cfu/g,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为33 copies/l和1.0104 cfu/g;TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;在稳定性评价试验中,普通PCR方法的重复性良好,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品检测Ct值的组内差异为0.15%~0.98%,组间差异为0.55%~1.63%。结论 本研究建立的检测产气肠杆菌的普通PCR方法和TaqMan 荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于产气肠杆菌的快速检测。     

实时荧光PCR法和流式细胞术检测HLA-B27的结果分析

目的比较实时荧光PCR法和流式细胞术两种方法检测人类白细胞抗原B27(HLA-B27)的临床应用价值。方法分别采用实时荧光PCR法和流式细胞术两种方法检测225例疑似强直性脊柱炎患者血中HLA-B27,比较和分析两种方法的检测结果。结果 95.11%样本检测结果相同,差异不具有统计学意义(P0.05),将存在差异的标本进行基因测序后,结果与实时荧光PCR的检测结果一致。结论两种方法检测HLA-B27均具有较高的灵敏度和特异度,实时荧光PCR法在结果的准确性上更优于流式细胞术。     

一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

VIDAS CHL检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染

目的 探讨VIDAS CHL法用于性病患者尿道拭子标本以及男性首段尿（FCU）标本沙眼衣原体（CT)检测的可行性。方法 使用组织培养法（TC）、VIDAS CHL检测法和聚合酶链反应（PCR）平行检测男性和女性拭子标本中CT，以组织培养为金标准，对VIDAS CHL和PCR进行评价。结果 232例男性标本TC阳性49例；VIDAS CHL和PCR法用于男性尿道拭子标本的敏感性分别为95.9%、93.9%，特异性分别为95.6%、94．5％，差异无显著性；VIDAS CHL法用于男性FCU的敏感性和特异性分别为85．7％和96．7％，与拭子标本作自身配对比较，检测结果无差异。151例女性拭子标本，TC法阳性23例，VIDAS CHL和PCR法的敏感性分别为100％和95．7％，特异性分别为96.1%、93.8%，差异无显著性。结论 VIDAS CHL法用于性病患者男性和女性拭子标本的CT检测，具有很高的敏感性和特异性，用于男性患者FCU的CT检测也是可行的；对于CT阳性率较高的性病人群，VIDAS CHL可以不做阻抑证实试验。     

实时荧光定量聚合酶链反应在肺结核诊断中的应用

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)在肺结核诊断中的应用价值。方法应用FQ-PCR对临床诊断肺结核及其他肺部疾病患者的临床标本进行结核分枝杆菌DNA定量检测,同时与涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法作比对。结果 189例临床诊断肺结核患者FQ-PCR检测123例阳性,提示敏感度为65.1%(123/189),而涂片抗酸染色、BACTEC 960培养法分别为40.2%(76/189)、63.5%(120/189)。94例其他肺部疾病患者及20例健康对照者FQ-PCR检测均为阴性,特异度为100.0%。结论 FQ-PCR敏感度和特异度均高,检测过程简单、易标准化、全过程仅需4～5h,可用于结核病的快速诊断。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR检测人载脂蛋白A5基因方法的建立及评价

目的建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量聚合酶链反应(PCR),用于检测人载脂蛋白A5(apo A5)基因。方法针对人apo A5基因设计特异性引物和TaqMan-MGB荧光探针,以重组克隆质粒pPCR-Script-apo A5为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行灵敏度、重复性、特异性实验。结果建立的定量标准曲线阈值循环数(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为103拷贝/μL;扩增效率(E)为110.2%,且重复性好。结论成功建立检测人apo A5基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR。该法具有较好的灵敏度、特异性及重复性。     

梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立和初步临床应用

目的 建立一种利用MGB-Taqman探针的快速、灵敏、特异、准确定量检测梅毒螺旋体的方法。方法选择梅毒螺旋体的基因组的保守区域，设计合成引物和MGB-Taqman探针，构建质粒标准品pMD18-T-TP．优化定量PCR反应体系，并进行方法学评价。结果1）成功构建了重组质粒pMD18-T-TP。2）建立了利用MGB-Taqman探针的荧光定量PCR方法，其线性范围：10^1～10^10％opies／μl；灵敏度：10copies／μl；重复性：批内CV为2．02％，批间CV为2．83％，日间CV为4．23％；特异性：100％。3）初步临床应用证明：该方法比血清学检测方法灵敏度更高，假阳性率低。结论利用MGB-Taqman探针定量检测梅毒螺旋体的方法灵敏度高，特异性高，操作简便，适合临床检验诊断的要求。