小鼠骨髓内破骨细胞诱导形成的实验观察

目的:建立骨髓间充质干细胞诱导培养成为破骨细胞的培养方法并进行初步的形态观察,为破骨细胞学及与其相关疾病的发病机制的研究提供更有意义的手段。方法:采用小鼠骨髓间充质干细胞通过1,25-(OH)2D诱导分化为破骨3细胞的培养方法,并观察原代成骨细胞对该方法破骨细胞形成及其功能的影响。根据是否加原代成骨细胞,分成未加成骨细胞、加成骨细胞二组,未加成骨细胞组是骨髓间充质干细胞直接诱导培养,加成骨细胞组是骨髓间充质干细胞与原代成骨细胞共同培养。分别培养6,9,12及15d,各组细胞到培养时间后取出进行TRAP染色阳性的多核细胞计数、骨片甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察。结果:未加成骨细胞、加成骨细胞两组的骨髓间充质干细胞经培养后均出现破骨细胞,而且随着培养时间的延长,破骨细胞及骨片吸收陷窝的数目增多。培养相同时间的未加成骨细胞、加成骨细胞两组之间的破骨细胞及骨片吸收陷窝的数目差异无显著性意义。结论:通过1,25-(OH)2D诱导骨髓中的间充质干细胞培养破骨细胞的3方法是可行的,而且骨髓间充质干细胞诱导培养成破骨细胞时加入原代成骨细胞共同培养对破骨细胞的形成和骨吸收功能并无明显促进作用。     

两种方法培养大鼠破骨细胞的噬骨能力比较

背景：原代培养的破骨细胞数量少,而诱导培养产生的破骨样细胞数量多,能够满足一些研究骨代谢实验的要求.但是两种细胞在特异酶及噬骨能力方面是否具有相同的效果,到目前为止,还没有详尽的数据来支持.目的：比较大鼠原代分离的破骨细胞及诱导形成的破骨样细胞噬骨能力上的差异.方法：取24 h内新生Wistar大鼠四肢长骨,酶消化法分离培养破骨细胞,将破骨细胞培养过程中消化下来的骨髓单核细胞加入1,25（OH）2 D 3结果与结论：诱导第9天,破骨样细胞数目为破骨细胞数目的11倍,其形态与原代消化获得的细胞形态相同.抗酒石酸酸性磷酸酶染色呈阳性.甲苯胺蓝染色显示两组破骨细胞在骨片上培养时产生骨陷凹面积及深度差异无显著性意义.结果显示破骨样细胞的形态、特异酶及噬骨能力与破骨细胞无差异.诱导生成破骨样细胞.苏木精-伊红染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鉴定.用甲苯胺蓝染色共培养骨片比较两组破骨细胞噬骨能力.     

骨髓贴壁细胞向破骨细胞的分化

背景：一般认为采用贴壁分离法得到的小鼠骨髓中能够贴壁的细胞为间充质干细胞,并能分化成为成骨、成脂肪及成软骨细胞,其中贴壁的细胞是否有分化为破骨细胞的潜能尚不明确。 目的：检测贴壁分离法得到的小鼠骨髓中能贴壁的细胞是否能够分化为破骨细胞。 方法：采用贴壁法得到小鼠原代间充质干细胞,以及通过贴壁1-5d后得到不同时间贴壁的骨髓细胞。原代间充质干细胞及不同时间贴壁的骨髓细胞分别用普通培养基,及含m-csf和RANKL培养基,培养9 d后进行碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色。原代间充质干细胞传代后,第2代间充质干细胞分为4组,分别用普通培养基、含m-csf培养基、含RANKL培养基及含m-csf和RANKL的培养基培养,9 d后进行碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶染色。 结果与结论：贴壁法得到较均一的间充质干细胞,原代及传代贴壁细胞的联合诱导组抗酒石酸酸性磷酸酶染色均为阳性,说明原代和传代的贴壁骨髓细胞中均有可以分化为破骨细胞的细胞。不同时间贴壁的细胞诱导后碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶染色有差异,说明不同时间贴壁的细胞存在分化差异。     

补肾中药对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的:探讨补肾中药对破骨细胞(osteoclast,OC)骨吸收功能的影响。方法:取新生(出生24h内)SD乳鼠四肢骨髓分离培养OC,实验组加入不同(高、中、低)剂量的补肾中药血清,对照组采用无中药血清,采用酶动力学法测定培养上清中抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)的活性;利用甲苯胺蓝对骨吸收陷窝染色并在图像分析仪下测定骨吸收陷窝的面积和数目。结果:补肾中药高、中剂量组均降低TRACP活性,减少骨片上骨吸收陷窝的面积及数目,与空白对照组比较差异有显著性意义(P<0.01),高、中剂量组间比较差异有显著性意义(P<0.05),以中剂量组作用为明显。结论:补肾中药可降低破骨细胞培养上清中的TR ACP活性,减少骨吸收陷窝面积及数目,达到抑制破骨细胞的骨吸收功能目的。     

一氧化氮外源性供体L-arginine对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的:一氧化氮在维持机体多个系统的生理功能中起重要作用,许多慢性疾病可造成一氧化氮产生减少,此时一氧化氮供体是一种必要的补充。观察一氧化氮外源性供体L-arginine对体外培养破骨细胞增殖及骨吸收功能的影响。方法:实验于2005-06/2006-05在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成。选择出生1d的清洁级SD大鼠乳鼠,采用骨髓诱导法体外培养破骨细胞,培养液内分别加入0.3,0.6,1.0g/L不同浓度的L-arginine,并以等体积三蒸水作为对照。培养7d后,以抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞数目、形态,MIAS-2000图像分析仪检测骨片上骨吸收陷窝的数目和面积,并用扫描电镜观察不同浓度L-arginine对骨吸收陷窝的影响。结果:①破骨细胞的一般形态:破骨细胞较其他细胞大,形态不规则,呈油煎蛋形、长条形、腊肠形或漏斗形等,细胞内可见几个至几十个核不等。抗酒石酸酸性磷酸酶染色酶活性部分酒红色,颗粒状。②抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数:各组破骨细胞数目随着L-arginine浓度增加而减少(P<0.05)。③骨吸收陷窝的面积和数目:骨片培养7d,吸收陷窝计数的结果显示,0.3g/L以上浓度L-arginine对破骨细胞吸收功能均有明显抑制作用,并呈剂量相关性。0.3g/LL-arginine组陷窝面积为对照组的91%(P<0.05),0.6g/LL-arginine组为对照组的80%(P<0.05),1.0g/LL-arginine组为对照组的69%(P<0.01)。结论:采用骨髓诱导法培养的破骨细胞数量多、纯度高,且具有明显的骨吸收功能。L-arginine抑制破骨细胞增殖,抑制破骨细胞骨吸收功能,并呈剂量相关性。     

番茄红素对活性氧族介导破骨细胞骨吸收功能的影响

背景：研究表明，番茄红素能够促进成骨细胞的增殖和生长，增加其矿化能力。目的：实验拟验证抗氧化剂番茄红素影响活性氧族介导破骨细胞骨吸收功能的作用途径。设计、时间及地点：随机分组设计，对比观察，实验于2005-01／2006-12在山东省骨科研究所完成。材料：24h内出生的清洁级Wistar大鼠幼鼠30只，用于破骨细胞的培养；番茄红素由Sigma公司提供。方法：将24孔细胞培养板内细胞分为5组。空白对照组：所用培养液不含番茄红素：10^-7mol／L番茄红素组、10^-6mol／L番茄红素组、10^-5mol／L番茄红素组和10^-5mol／L维生素C组培养孔内预先置入盖玻片或薄骨片，对种植其上的破骨细胞分别用含有不同浓度番茄红素或维生素c的d．MEM培养基进行培养。主要观察指标：在分离培养的细胞玻璃爬片或骨片进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色、四唑氮蓝染色，最后对骨片进行扫描电镜照像并用image-proplus5．0图像分析软件分析骨吸收陷窝的数目和面积。结果：①抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性多核细胞镜下胞浆酸性磷酸酶活性部位呈紫红色，细胞核染色阴性或淡染，伪足清晰。②四唑氮蓝染色结果提示，10^-5mol／L的番茄红素明显抑制了破骨细胞产生活性氧族的能力。⑨扫描电镜结果显示，破骨细胞在骨片上形成形态不一的骨陷凹，10^-7mol／L的番茄红素部分抑制了骨吸收陷凹面积的增加，而10^-5mol／L的刮茄红素则几乎完全抑制了骨吸收陷凹的形成。结论：番茄红素在体外可以通过抑制破骨细胞产生活性氧族来抑制其骨吸收功能。     

异丙肾上腺素对大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞转化的影响

背景:交感神经系统在骨量的调控中发挥关键的作用,假设体外交感神经分泌的神经递质能够促进破骨细胞形成,无疑为破骨细胞诱导培养增加了新方法.目的:实验拟观察异丙肾上腺素对大鼠骨髓单核细胞向破骨细胞转化的影响.设计、时间及地点:横断面设计实验,于2007-03/06在沈阳医学院实验中心完成.材料:新生24h Wistar大鼠,体质量5.0～6.0g,雌雄不拘,用于分离培养大鼠成熟破骨细胞.异丙肾上腺素由武汉福鑫化工有限公司提供.方法:分离培养大鼠成熟破骨细胞为原代组,以异丙肾上腺素作用于骨髓单核细胞为肾上腺素组,无异丙肾上腺索为对照组,用苏木精-伊红染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色加以鉴定.主要观察指标:倒置显微镜观察第3,6,9天3组细胞的计数,扫描电镜观察破骨细胞在骨片上的嗜骨能力.结果:肾上腺素组破骨细胞数目为原代组数目的3倍.其形态与原代组消化获得的细胞形态相同,抗酒石酸酸性磷酸酶染色均阳性.扫描电镜显示肾上腺素组破骨样细胞在骨片上培养时产生骨陷凹.结论:在体外异丙肾上腺素对破骨样细胞形成有促进作用,形成的破骨样细胞在形态、特异酶及噬骨能力方面与经典分离培养的破骨细胞无差异.     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的超微结构改变

背景:目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察.目的:采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点.设计、时间及地点:观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成.材料:成年新西兰大白兔由自求恩国际和平医院实验动物中心提供.Hitachi S-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜.方法:从新西兰大白兔骼后上嵴处抽取骨髓.经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10-8 mmol/L地塞米松,50 mg/L维生素C.培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测.主要观察指标:光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点.结果:培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果.经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应.光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列.透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构.结论:骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构.     

掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响

目的:已有研究表明新型生物材料聚磷酸钙掺锶后能明显促进成骨细胞的增殖和分化.实验将掺锶聚磷酸钙与破骨细胞于体外复合培养,进一步从细胞的形态和生理功能两方面考察掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响.方法:实验于2006-10/2007-01在四川大学组织工程支架材料研究室及四川大学华西医学院生物医学工程重点实验室完成.将机械分离法获得的新生兔长骨破骨细胞分别种植于1 cm×1 cm×80 μm的骨片及由"湿式法"溶液反应法制备的φ2 mm×10 mm的掺锶聚磷酸钙样品上,以聚磷酸钙为对照,复合培养于24孔培养板中.复合培养7 d后,采用特异性抗酒石酸酸性磷酸酶染色方法鉴定实验细胞,通过扫描电镜观察骨片和掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙材料表面破骨细胞的形貌及骨吸收陷窝的形成情况.实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求.结果:①抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示试验细胞呈阳性.②骨片上形成的骨吸收陷窝多呈不规则形状,陷窝边界清晰,底面粗糙.证实所培养的细胞为破骨细胞.③复合培养7 d后,掺锶聚磷酸钙组材料表面陷窝形成的数量明显少于聚磷酸钙组材料.④复合培养7 d后,掺锶聚磷酸钙组材料表面破骨细胞的增殖度明显低于聚磷酸钙组材料.结论:掺锶聚磷酸钙由于锶元素的掺入能通过降低破骨细胞的活性,阻碍破骨细胞的增殖分化,从而显著地抑制其骨吸收能力.     

流动优化骨髓间充质干细胞的分化状况

背景：间充质干细胞在成体动物骨髓中含量极低。目的：观察成年大鼠骨髓间充质干细胞经生理范围流动切应力作用后,其体外生长规律、增殖及定向分化为成骨细胞及脂肪细胞的能力。方法：在体外取得SD大鼠骨髓原代间充质干细胞,利用平板流室系统加载1Pa切应力,对其进行培养及扩增,并分别向成骨细胞及脂肪细胞定向诱导。结果与结论：原代间充质干细胞为长梭形或多角形,集落样生长;经流动加载并传代后细胞生长速度加快,不以集落方式生长,而是均匀分布。细胞体积明显增大,多数为长梭形或多角形;生长曲线显示各代细胞有类似的生长规律;激光共聚焦显微镜显示CD44和CD90阳性,CD31及CD45阴性;向成骨细胞及脂肪细胞诱导14d后,VonKossa染色及油红O染色均为阳性,流动优化后骨髓间充质干细胞保持了体外大量增殖及多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞成骨分化过程中瞬时性受体电位香草精受体5的表达：

背景：目前,钙离子通道的研究仪限r肾脏、小肠、光滑卯母细胞中瞬时性受体电位香草精受体5所表现出来的电生理特性。目的：观察新掣钙离子通道瞬时性受体电位香草精受体5在大鼠骨髓间充质干细胞来源的成骨细胞中的表达及意义。方法：分离、提取、培养大鼠骨髓问充质干细胞,诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,用免疫组织化学法检测大鼠骨髓问充质干细胞诱导分化的成骨细胞中瞬时性受体电位香草精受体5的表达。结果与结论：实验成功将体外培养大鼠骨髓间充质干细胞诱导培养为成骨细胞。碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测结果显示,诱导分化的成骨细胞中胞浆中可见紫黑色和红色的矿化结节。免疫组织化学染色结果显示,诱导的成竹细胞中瞬时性受体电位香革精受体5呈强阳性表达。结果证实,大鼠骨髓间充质千细胞来源的成骨细胞中存在瞬时性受体电位香草精受体5钙离子通道,此通道可能成为调节成骨细胞增殖和分化的候选通道。     

骨髓间充质干细胞定向诱导条件下向脂肪细胞和成骨细胞诱导分化的关系

目的：观察骨髓间充质干细胞在定向诱导分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞分化的特征及相互关系。方法：实验于2004-10／2005-04在泸州医学院心肌电细胞实验室完成。日本大耳兔10只，经兔髂嵴无菌抽取骨髓，采用Percoll液进行梯度离心法和体外细胞贴壁分离培养法相结合对兔骨髓间充质干细胞进行分离、纯化，将获得的原代和传代培养的骨髓间充质干细胞，分别用含成脂诱导剂和含成骨诱导剂的改良的伊格尔培养基进行实验组（向脂肪细胞和成骨细胞的定向诱导培养，对诱导培养后的细胞进行生长形态学特征观察），对照组（采用不加成脂、成骨诱导剂的伊格尔培养基），两组进行成脂及成骨诱导后的苏丹脂肪染色、碱性磷酸酶活性检测、胞外矿化基质测定，并进行细胞成脂和成骨率比较。结果：从10只实验动物中均成功提取到骨髓间充质干细胞，其中有2只动物的骨髓间充质干细胞在原代培养时出现污染，8只获得成功进入结果分析。①在经过2ld成脂诱导培养后实验组的许多细胞胞浆内均出现较多的高折光性的脂滴，苏丹脂肪染色呈橘红色，同时Kossa法也检测出少许成骨分化，其比例为70％（28／40）干细胞可转化为含有脂滴的脂肪细胞；10％（4／40）干细胞转化为含有钙结节的成骨细胞。②经过21d向成骨诱导培养后实验组出现一些细胞基质逐渐堆积、并出现基质矿盐沉积，Von Kossa法测定形成的钙结节，同时苏丹脂肪染色也检测出少许向脂肪细胞分化，其比例为40％（16／40）干细胞可转化为成骨细胞，20％（8／40）骨髓间充质干细胞可转化为脂肪细胞。③对照组用苏丹脂肪染色后显示5％（2／40）骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞，用Von Kossa法测定矿化结节形成比例和碱性磷酸酶活性测定结果成骨率10％（4／40）。结论：在适当诱导条件下骨髓间充质干细胞可一部分转化为脂肪细胞，另一部分转化为成骨细胞，两者分化存在一定关系：分化的脂肪细胞多，则成骨细胞少；分化的成骨细胞多，则脂肪细胞少。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07／2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0．1μmol／L地塞米松、10mmol／L β-甘油磷酸钠、50μmol／L维生素C对第3代骨髓间充质于细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。主要观察指标：相差强微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显做镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延艮，局部细胞呈重叠牛长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14d可形成倒置显做镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节争黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞作为良好的种子细胞,将其复合于生物支架治疗骨缺损取得了良好的进展,是当今研究的一大热点。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨样细胞分化的效果。方法：采用贴壁筛选法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为2组,对照组细胞仅用DMEM/F12培养基培养;实验组以含成骨诱导剂的DMEM/F12培养基培养。结果与结论：全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或多角形贴壁生长;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈圆形或卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组（P〈0.01）;茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组有明显增加（P〈0.01）;骨钙素ELISA定量分析较对照组明显升高（P〈0.01）。提示全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化

目的诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，将其分为对照组和诱导组两组。诱导组加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸，诱导成骨。采用免疫荧光染色的方法检测碱性磷酸酶（AKP）和骨桥蛋白（0PN）的表达；并通过RT-PCR检测骨桥蛋白mRNA的表达；利用硝酸银染色和茜素红染色两种特殊染色方法检测钙盐沉积。结果经诱导，诱导组细胞在呈典型的成骨细胞形态并有钙结节形成；免疫荧光染色结果显示诱导组细胞AKP和OPN均为强阳性表达，RT-PCR结果也显示诱导组细胞骨桥蛋白mRNA表达；两种特殊染色结果显示诱导组细胞有大量的钙盐沉积。而对照组细胞无上述形态改变和表达。结论人骨髓间充质干细胞在一定的诱导条件下能向成骨细胞分化。     

脂肪间充质干细胞的基本生物学特性及其向成骨细胞分化的特征

背景：最早研究的是骨髓来源的间充质干细胞。由于脂肪组织与骨髓同为中胚层起源的组织，那么能否从脂肪组织中获得间充质干细胞，而且也具有多分化潜能呢?目的：研究脂肪间充质干细胞的基本生物学特性以及在特定培养条件下向成骨细胞分化，探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。设计：以细胞为研究对象的随机对照实验。单位：北京大学第三医院骨科。对象：实验于2002—10／2004—01在北京大学第三医院骨科完成，实验对象为从Lewis大鼠脂肪组织中提取的间充质干细胞。方法：取3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫，消化法获得脂肪间充质干细胞，分别用脂肪诱导培养基和成骨诱导培养基诱导其向脂肪细胞与成骨细胞分化，组织化学染色、免疫细胞化学染色和Western blotting检测细胞分化的情况。主要观察指标：脂肪间充质干细胞的形态学和生物学特性，以及成骨诱导后成骨细胞特异性标志。结果：从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞，体外培养呈成纤维细胞样，能大量稳定增殖传代。原代脂肪间充质干细胞能自发分化为脂肪细胞，传代细胞在胰岛素和地塞米松的作用下生成脂滴，过氧化物酶体增殖物激活受体1表达增强，向脂肪细胞分化；在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下，碱性磷酸酶活性检测显示诱导组与对照组差异有显著性意义(P&;lt;0．01)，yon Kossa染色出现钙结节，骨桥蛋白免疫细胞化学染色阳性，Western blotting检测到诱导后细胞骨桥蛋白的表达。结论：从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞，经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞，有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多表明细胞功能活跃。     

低渗结合自然沉降法分离兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

背景：骨髓间充质干细胞数量极少,10万个骨髓有核细胞中才有1个骨髓间充质干细胞,如何成功分离并鉴定骨髓间充质干细胞是研究中的关键工作。目的：建立完善的骨髓间充质干细胞体外分离培养体系,从细胞的形态、表型和功能方面鉴定骨髓间充质干细胞。方法：低渗原理去除杂细胞,结合自然沉降分离骨髓间充质细胞,并对其形态学特征进行光镜观察。对骨髓间充质细胞的表型进行流式细胞仪检测。并将骨髓间充质细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行诱导分化,行形态学观察和碱性磷酸酶、Vonkossa、Ⅰ型胶原、油红O染色检测。结果与结论：实验分离获取的骨髓间充质细胞经表型鉴定为：CD29（＋）,CD45（-）;向成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶、矿化结节染色及Ⅰ型胶原检测均为阳性;向脂肪细胞诱导后,油红O染色阳性。结果表明实验分离的骨髓间充质细胞为类成纤维细胞样非造血类干细胞,此类细胞具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的功能。     

山羊骨髓间充质干细胞向纤维软骨分化的形态学改变简

背景：前期初步研究发现,碱性成纤维细胞生长因子可诱导骨髓间充质干细胞向颞下颌关节盘细胞方向分化,且碱性成纤维细胞生长因子10μg/L诱导组合成胶原量明显高于5μg/L诱导组。目的：观察经不同浓度碱性成纤维细胞生长因子诱导后的骨髓间充质干细胞的超微结构变化。方法：原代分离培养山羊骨髓间充质干细胞,选P3,P4细胞,用5,10μg/L碱性成纤维细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞,以未加碱性成纤维细胞生长因子培养的骨髓间充质干细胞做对照。倒置相差显微镜观察细胞生长状况,用第7,14,21天的细胞爬片行蕃红O、天狼猩红和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,并观察第21天细胞的超微结构。结果与结论：经不同浓度碱性成纤维细胞生长因子诱导后,骨髓间充质干细胞可向颞下颌关节盘成纤维细胞样细胞形态分化,10μg/L组细胞更像关节盘成纤维细胞样细胞。提示骨髓间充质干细胞有向颞下颌关节盘细胞方向分化的形态学基础。     

类风湿关节炎关节液来源的间充质干细胞分离鉴定及其对破骨细胞发育的影响

为了研究炎性微环境对于间充质干细胞生物学特性的影响,从类风湿性关节炎病人关节液中分离得到间充质干细胞,以流式细胞术测定其免疫学表型,以成骨和成脂肪诱导检测其多向分化能力,将其与CD14^＋的单核细胞共同培养并以抗酒石酸的酸性磷酸酶染色检测对破骨细胞的调控作用。结果表明：类风湿性关节炎病人关节液中分离得到的间充质干细胞高达CD105,CD73,CD29,CD44,CD166和HLA—ABC,低表达CD34,CD45,CD31,HLA—DR,CD80和CD86;与健康人骨髓间充质干细胞相比,其向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力下降,而且其支持更多的破骨细胞生成（P〈0．05）。结论：类风湿性关节炎病人关节液中存在的间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的表型,但是其多向分化能力下降,更有意义的是其支持破骨细胞生成的能力增强。本研究结果有助于了解病理微环境中的间充质干细胞生物学特性。