抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆和表达

目的：克隆抗人CD16单克隆抗体重，轻链可变区（VH，VL）基因并合成单链抗体（ScFv)基因。方法：从分泌抗人CD16单克隆抗体的杂交瘤细胞B88－9中提取总RNA，应用RT－PCR技术获得抗CD16单克隆抗体的VH，VL基因，用连接肽（Linker)肽VH和VL连接成具有VH－Linker-VL结构的ScFv基因，将其克隆到表达载体pcDNA3.1( )，并转杂COS－7细胞。结果：VH基因长度为354bp，属于鼠抗体可变区重链基因家族I（B）亚群，VL基因长度为333bp，属于鼠抗体可变区kappa轻链基因家族Ⅲ亚群，采用夹心ELISA方法检测到ScFv的表达。结论：抗人CD16单克隆抗体VH与VL基因的克隆和ScFv基因的构建为基于CD16的导向免疫治疗奠定了基础。     

抗人CD154单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析

目的:克隆抗人CD154抗体轻重链可变区基因,并分析其核苷酸序列,为基因工程抗体的构建奠定基础。方法:从分泌能抑制免疫反应的抗人CD154单克隆抗体杂交瘤细胞株 7E8中提取总RNA,合成cDNA第一链后,经PCR扩增获得抗人CD154单抗轻链可变区 (VL)和重链可变区 (VH)基因,分别克隆入pUC18载体,并进行序列分析。结果:①抗体的轻链可变区基因全长为 341bp,编码113个氨基酸,归属于Ig的Vκ2基因,氨基酸序列分析结果显示轻链可变区含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区,在第 2 3位和第 93位氨基酸为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两个特征性氨基酸;②抗体的重链可变区基因全长为 354bp,编码118个氨基酸,归属于小鼠IgVH基因,D、J区基因分别属于DSP2.9和JH2,氨基酸序列分析结果显示,重链可变区含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区,在第 2 3和第 97位氨基酸为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两个特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别为抗体的轻、重链可变区基因.     

抗人小细胞肺癌单抗2F7人-鼠嵌合Fab片段基因的构建和表达

目的：通过基因工程抗体改造获得具有与人小细胞肺癌有特异性反应的人－鼠嵌合抗体2F7 Fab片段，方法：采用RT－PCR技术从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆该抗体的重，轻链可变区基因，将2F7单抗的重，轻链可变区基因装入带有人恒定区基因的表达载体pSW1-Fab中，构建得到pSW1-2F7 Fab，转化受体菌E.coil XL1-Blue,IPTG诱导表达，经Western blot和ELISA鉴定表达蛋白的活性。结果：从抗人小细胞肺癌单克隆抗体2F7杂交瘤中克隆获得了抗体重、轻链可变区基因，测序证实2F7单抗的重链（VH）可变区基因全长362bp，编码120个氨基酸，轻链（VL）可变区基因全长319bp，编码105个氨基酸，构建的2F7人－鼠嵌合Fab表达载体诱导后获得了目的蛋白的表达，主要分泌在菌液的上清中，表达量较高且稳定，具有与NCI－H128细胞特异性结合的活性。结论：构建和表达了抗人小细胞肺癌单抗2F7人－鼠嵌合Fab片段，表达产物具有与抗原结合的特异性，为进一步研究和应用打下了基础。     

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达

目的：克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法：从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2F4）中提取总RNA，利用RT-PCR技术，克隆该抗体重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL），通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-ALI，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。结果：VH基因序列全长369碱基对，编码123个氨基酸，VL基因序列全长339碱基对，编码113个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FRs）、3个抗原互补决定区（CDRs）及抗体特征性的两个半胱氨酸残基。ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。结论：成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中，为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础。     

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的：从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区（V）基因，构建bFGF单链抗体（scFv），并进行可溶性表达。方法：从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA，用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因（VH）和轻链的可变区基因（VL）；再通过重叠延伸拼接（SOE）PCR方法，在VH和VL基因之间引入linker（Gly4Ser）3，构建bFGF scFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB 5E中，选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达；经SDS—PAGE检测抗体表达水平，ELISA鉴定其抗原结合活性。结果：测序分析结果显示，VH基因序列全长375碱基对，编码125个氨基酸，VL基因序列全长399碱基对，编码133个氨基酸，二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有4个框架区（FR）、3个抗原互补决定区（CDR）及抗体特征性的2个半胱氨酸残基；构建的scFv全长789碱基对，编码263个氨基酸，连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达，表达产物主要位于周质腔中，表达产物的Mr为27000，与理论预期值相符；间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论：成功地克隆bFGF mAb可变区基因，并构建表达bFGF scFv，为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。     

具有GPX活性的单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5,克隆其mAb体的可变区基因。方法提取杂交瘤细胞的总RNA ,分离mRNA ,反转录合成cDNA。经PCR扩增VH 基因和VL 基因 ,将VH 基因和VL基因与载体 pGEM T连接后 ,进行酶切鉴定和序列分析。结果构建了2个分别含有VH 和VL 基因的重组质粒。序列分析表明 ,VH 和VL 分别属于mouscheavychainsubgroupIII和mouselightchainsubgroupV亚群 ,长度为372和324bp ,编码124和108个氨基酸 ,在高变区分别有4和2个丝氨酸。结论克隆的VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,为将来制备具有GPX活性的单链抗体提供了可靠的基因材料。     

抗人CD25分子单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的:构建和表达抗人CD25分子单链抗体(scFv)蛋白,并测定其生物学活性。方法:用RT-PCR方法从能分泌特异性抗CD25单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗CD25分子scFv的基因。将scFv基因克隆至pMD18T,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将scFv基因连接到pBAD/gⅢA表达载体,转化Top10表达菌。阳性克隆用左旋阿拉伯糖诱导4 h,SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度,竞争抑制ELISA实验检测其活性。结果:scFv基因长度约为700 bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(GGGGS)3-VH(但其中349位G突变为A,使Linker其中一位Gly→Ser)。其VH隶属于小鼠Ig重链可变区Ⅲ(C)亚类,全长351 bp,可编码117个氨基酸;其VL隶属于小鼠Igκ轻链可变区Ⅳ亚类,全长318 bp,可编码106个氨基酸。TOP10中表达的scFv抗体加上同时融合表达的两个标签6×His和C-mycMr约为31 000,结果符合scFv的Mr。竞争抑制细胞ELISA实验显示表达的scFv具有活性。结论:此scFv基因的表达产物具有一定的特异结合活性。为抗CD25 scFv的临床应用打下了基础。     

抗人红细胞H抗原单链抗体基因克隆和表达

目的 克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达.方法 从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2FA中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗原单克隆抗体的VH、VL基因;利用重叠引物延伸法(splicing by overlap extension,SOE)将轻重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker)编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因,将其克隆到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,IPTG诱导表达;获得的目的蛋白经纯化后,用SDS-PAGE与Westem blotting对目的蛋白进行鉴定,间接EHISA、竞争ELISA和免疫荧光法检测目的蛋白的活性.结果 克隆的VH基因长度为351 bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I(B)亚群;VL基因长度为339 bp,属于鼠抗体可变区轻链基因家族I亚群;SOE法克隆的单链抗体基因为750 bp;构建的含原核表达载体的菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting法检测到Mr 32 000的目的蛋白(表达的ScFv);ScFv纯化后,经免疫荧光法、间接与竞争HLISA法检测到该ScFv蛋白具有生物结合活性.结论 成功地克隆了抗人红细胞H抗原单克隆抗体VH与VL基因和ScFv基因,构建ScFv基因的表达载体,实现了ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞中的活性表达,为基于红细胞H抗原的免疫检测技术建立奠定了基础.     

米尔比霉素肟化物ScFv噬菌体展示抗体库的构建

目的构建具16元大环内酯共性结构小分子物质的特异性抗体库。方法免疫原MILO-BSA免疫小鼠后从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增得到全套抗体重链可变区基因(VH)及轻链可变区基因(VL),SOE-PCR将VH、VL片段拼接扩增得到单链抗体可变区基因片段(ScFv)。将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化感受态大肠杆菌,辅助噬菌体超感染得到上清液即为噬菌体抗体库。结果RT-PCR扩增出长360bp左右的抗体重链可变区基因(VH)及340bp左右的轻链可变区基因(VL),SOE-PCR扩增得到750bp左右的ScFv基因片段,成功构建了库容量为2.4×106,滴度为2.0×1012pfu/mL的噬菌体单链抗体库。结论构建的抗体库目的片段连接率较高,多样性较好,为下一步16元大环内酯类小分子物质高特异性抗体的筛选奠了基础。     

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的: 克隆并分析抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体(mAb)VH及VL基因。方法: 从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株 (AL1 )中提取总RNA。利用RT- PCR技术,克隆抗溶藻弧菌独特型mAbVH 和VL基因, 并将其重组入PMD18 Tvector中进行测序分析。结果: VH基因序列全长为369bp, 编码 123个氨基酸; VL基因序列全长为 339bp, 编码113个氨基酸。通过国际联机检索及Kabat库分析, 二者均符合小鼠IgGV区基因的特征, 含有 4个框架区 (FR), 3个抗原互补决定区 (CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸残基。结论: 抗溶藻弧菌独特型mAb的VH和VL基因的克隆成功,为抗溶藻弧菌独特型mAb基因工程疫苗的构建奠定了基础。     

应用组织芯片研究Pim-3、p-STAT3在胰腺癌中的表达及临床意义

目的 探讨Pim-3、p-STAT3蛋白在胰腺导管腺癌组织中的表达情况及生物学行为意义.方法 应用组织芯片和免疫组化的方法,检测88例人胰腺导管腺癌组织和11例非癌组织中Pim-3、p-STAT3蛋白的表达,并分析其与临床病理特征及患者预后的关系.结果 在88例胰腺癌组织中Pim-3、p-STAT3的阳性表达率分别为76.1%和75.0%,在非癌胰腺组织内均为阴性表达.Pim-3在肿瘤细胞的胞质内表达,p-STAT3在肿瘤细胞的胞核与胞质内表达,两者的表达与胰腺癌的临床分期、淋巴结转移相关(P<0.01),与患者年龄、性别、肿瘤大小、位置和病理学分级无关(P>0.05),且其之间成正相关(r=0.416,P<0.01).Kaplan-Meier生存分析结果显示,胰腺癌组织中Pim-3、p-STAT3表达阳性的患者生存时间缩短.Cox多因素相关分析表明Pim-3和p-STAT3阳性表达是影响患者生存期的独立预后因素(分别P=0.003和P=0.015).结论胰腺癌中Pim-3、p-STAT3的阳性表达与肿瘤临床分期和淋巴结转移密切相关,且两者均可作为胰腺癌患者预后不良的判断因子.     

STAT3在溃疡性结肠炎患者肠黏膜的表达及活化增强

目的 检测溃疡性结肠炎（UC）患者结肠黏膜STAT3、pSTAT3蛋白及STAT3 mRNA的表达及与UC疾病活动度的关系。方法 47例UC患者根据内镜及临床活动度进行分级，收集正常对照结肠黏膜标本13例；用免疫组织化学法检测STAT3、pSTAT3在结肠黏膜的定位；用Western blot及RT-PCR法检测STAT3、pSTAT3蛋白及STAT3 mRNA在结肠黏膜的表达。结果 ⑴ STAT3为胞质着色；pSTAT3主要为胞核着色，胞质中也有表达，二者均主要表达于大量浸润的单个核细胞，且二者在UC患者黏膜的阳性细胞数及染色强度均有随病变的加重逐渐增加的趋势；⑵UC患者肠黏膜STAT3、pSTAT3蛋白的表达量高于对照者，且随着病变分级逐渐增加。⑶UC患者肠黏膜STAT3 mRNA的表达与蛋白表达一致。结论 UC患者结肠黏膜中STAT及pSTAT3的表达随病变程度逐渐增加，在一定程度上可以反映疾病的活动度。     

稳定表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞株的建立及其免疫原性分析

目的:建立表皮生长因子突变体Ⅲ胞外区(EGFRvⅡ-Iex)的NIH3T3稳定细胞系并分析其免疫原性。方法:将编码EGFRvⅢex基因的表达质粒pLNCX2-EGFRvⅢex转染NIH3T3细胞后,用G418筛选阳性克隆,得到多个细胞克隆。采用免疫组化和Western blot法鉴定这些细胞克隆。选取高表达EG-FRvⅢex的细胞株(命名为3T3-vⅢex)免疫BALB/c小鼠,制备抗血清。用ELISA、Western blot和免疫荧光分别检测抗血清的效价和特异性。结果:成功地构建了真核表达载体pLNCX2-EGFRvⅢex并获得了稳定高表达EGFRvⅢex的NIH3T3细胞系3T3-vⅢex。用3T3-vⅢex免疫小鼠所获得的抗血清效价为10-5。Western blot和免疫荧光鉴定证明抗血清可以与EGFR-vⅢex特异结合。结论:人EGFRvⅢex可在NIH3T3细胞内获得稳定表达,以其免疫小鼠可以获得高效价、高特异性的抗血清。     

PNPLA3基因表达以及干扰腺病毒的构建及鉴定

目的 构建糖脂代谢和脂肪肝相关基因PNPLA3过表达以及干扰腺病毒载体并加以鉴定.方法 根据PNPLA3基因序列设计过表达以及干扰序列引物,定向克隆人穿梭载体pAdTraek-CMV的Bgl Ⅱ和Xho I位点,干扰序列克隆人pAdTrack-U6穿梭载体,Pme I酶切线性化穿梭质粒与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共转化E.coli BJ5183感受态细菌产生重组腺病毒载体,用Pac I酶切线性化的回收质粒转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察293A细胞绿色荧光蛋白的表达,并初步观察其感染小鼠原代细胞的效率.结果 测序、酶切鉴定证实,构建出了PNPL43基因过表达及干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.5×10<'11>VP/mL.以120感染复数感染小鼠肝脏原代细胞,感染效率可达到90%以上,干扰效率超过80%以上.结论 成功构建了PNPLA3基因的过表达以及干扰腺病毒载体.     

神经肽Y促进3T3L1前脂肪细胞的增殖和分化

目的:观察神经肽Y对3T3L1前脂肪细胞增殖和分化的影响,并对其机制进行初步探讨。方法:3T3-L1细胞由3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IB-MX)、胰岛素和地塞米松联合诱导分化,2 d后将细胞分为空白对照组(未加任何诱导剂组)、经典诱导组(胰岛素诱导)和NPY干预组(10-8、10-9、10-10mol/L NPY)。培养的第7、12天用相差显微镜观察各组细胞形态的变化,培养第12天用油红O染色观察脂肪细胞分化程度。MTT检测细胞增殖。Western blot检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)、CAAT/增强子结合蛋白-α(CCAAT/enhancer-bind-ing protein-α,C/EBP-α)蛋白的表达。结果:10-8mol/L NPY能促进3T3-L1细胞的分化。10-9mol/L NPY,10-8mol/L NPY均能促进3T3-L1细胞增殖。10-8mol/L NPY增加C/EBPα、PPARγ的表达。结论:NPY促进3T3L1前脂肪细胞的增殖和分化,其机制可能与上调PPARγ、C/EBPα的表达有关。     

DD3基因与前列腺癌研究进展

目前还没有预测前列腺病程进展或是否可能发生的癌转移合适标志物。虽然前列腺癌相关标志物PSA、PSMA等已广泛地用于临床诊断，但其监测前列腺癌的进展和复发的能力还有争议。近年研究发现前列腺特异基因DD3（differential display code 3 for prostate cancer，DD3^Pca3）用于前列腺癌的诊断优于PSA，且能更好地进行预后判断，其敏感性和特异性均90％，可作为前列腺癌早期诊断和判断预后的有前途的标志物。     

转染小鼠CXCR3基因的B16-mCXCR3细胞在体内外迁移和致瘤作用研究

目的:建立稳定表达小鼠CXCR3基因的B16细胞株,研究CXCR3分子在肿瘤形成及转移过程中的作用。方法:采用PCR方法从pMD19-T/mCXCR3质粒中扩增CXCR3基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染小鼠黑色素瘤细胞B16;G418加压筛选阳性克隆,分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中CXCR3在mRNA和蛋白水平的表达。采用Transwell系统检测B16-mCXCR3细胞在其配体IP-10介导下的迁移能力。将B16-mCXCR3细胞分别通过皮下和眼静脉注射接种于BALB/c小鼠,观察在小鼠体内的成瘤率及肿瘤转移情况。结果:构建了表达小鼠CXCR3基因的真核表达载体pIRES2-EGFP/mCXCR3,转染该载体后获得了稳定表达CXCR3的B16-mCXCR3细胞。B16-mCXCR3细胞(1×105个),在20μg/L IP-10作用下迁移的细胞数为3 208个,与B16组和B16-mock组相比均具有统计学意义(P<0.01)。于小鼠皮下接种B16-mCXCR3细胞、B16细胞和B16-mock细胞,第20天成瘤率均为100%。于小鼠眼静脉注射B16-mCXCR3细胞,第21天时50%的小鼠在肺部出现肉眼可见的黑色肿瘤转移灶,B16细胞组和B16-mock细胞组肺部未见肿瘤转移灶,B16-mCXCR3组与B16组和B16-mock组相比均具有统计学意义(P<0.01)。结论:转染CXCR3基因的B16-mCXCR3细胞,在IP-10介导下可定向迁移,并可增加在小鼠体内的转移率。     

FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建FLK1265-2493与C3d3融合基因真核表达质粒，并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增FLK1265—2493片段，将该片段插入到pMDT-18载体中后，亚克隆至真核表达载体pSG．SS．C3d3．YL，构建FLD1265-2493与C3d3融合基因表达质粒。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后，将重组质粒pSG．SS．FLK1265—2493．C3d3．YL转染Hela细胞，检测其体外表达。结果免疫印迹和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞上清液和胞浆内均有目的分子的存在。结论构建的DNA疫苗可在真核细胞内正确表达，这为进一步的动物实验打下了基础。     

Machado--Joseph的研究进展病基因检测及新突变位点

马查多-约瑟夫病（Machado—Josephdisease,MJD）也被称为脊髓小脑性共济失调3型（spinocerebellarataxia3,SCA3）,是最常见的遗传性脊髓小脑性共济失调亚型。发病机制尚不清楚,复杂的病情一直是临床工作者极大的挑战。得益于分子细胞遗传学迅猛发展,MJD症状前诊断及基因诊断成为现实并还在继续向前发展。逐步用于疾病诊断、鉴别诊断及治疗中,同时为遗传咨询提供科学依据。为寻求新突破,该文集中总结该疾病ATXN3突变致病机制及基因检测应用研究现状。更好地理解这些复杂的分子机制,探讨基因检测以及新基因突变位点的发现对这一致命性疾病的诊断及治疗意义。     

人源分子佐剂hC3d3促进人免疫活性细胞协同刺激分子表达及对hCGβ抗原的反应性

目的探讨分子佐剂hC3d3与hCGβ的融合蛋白hCGβ-hC3d3对人外周血单个核细胞（PBMC）中的B细胞与T细胞表面协同刺激分子表达及对hCGβ抗原反应性的影响。方法从人肝细胞cDNA文库克隆hC3d基因片段；构建pCI-gs-signal-6His-hCGβ及pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3真核表达质粒，表达和纯化重组蛋白抗原hCGβ及hCGβ-hC3d3融合蛋白。实验分组：将B细胞、B＋T细胞组或PBMC，分别应用hCGβ、hCGβ-hC3d3或美洲商陆（PWM）等抗原进行体外处理48h。用流式细胞术分析培养后的上述淋巴细胞表面的CD80、CD86、CD154、CD25等协同刺激分子的表达；用ELISA检测培养上清中IL-2的含量。结果本研究成功克隆了hC3d基因，构建了真核表达质粒pCI-gs-signal-6His-hCGβ及pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3；经转染CHO细胞，获得了目的蛋白高效分泌表达。经鉴定及纯化成功获得了较高纯度的目的蛋白hCGβ及hCGβ-hC3d3。hCGβ-hC3d3蛋白能够显著上调B细胞表面CD80、CD86分子的表达，尤其是CD86分子的表达（P〈0．01）；能明显增强T细胞表面CD154、CD25分子的表达（P〈0．05）。hCGβ-hC3d3蛋白提高B细胞抗原提呈能力及T细胞活化后分泌IL-2的能力（P〈0．05）。结论人源分子佐剂hC3d3明显促进人免疫活性细胞协同刺激分子表达及对hCGβ抗原的反应性。