肾上腺脑白质营养不良患者ABCD1基因第6外显子突变的初步分析

目的 检测肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy，ALD)(MIM300100)患者编码ALD蛋白的ABCD1基因[ATP-结合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族中D亚家族1]突变。方法 提取无亲缘关系的14例中国ALD患者及其中2例患者父母基因组DNA。聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)扩增ABCD1基因的第6外显子，以琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，PCR产物纯化后DNA直接测序。结果 证实3个患者的ABCD1基因第6外显子有突变，其中1例患者为5’末端上游第6个碱基C缺失(1489-6 del C)，推测该突变可能导致剪切错误；1例患者为错义突变1559T→A(L520Q)，这两例患者的母亲均为杂合突变。另1例患者为1548G→A(L516L)的同义突变。结论 首次报告了中国大陆ALD患者ABCD1基因突变．第6外显子无大片段缺失和重组突变。同一血缘族中可有不同的表型存在，提示是否有其它遗传或环境因素参与表型的表达。通过DNA测序方法亦证实其中2例患者之母为ABCD1基因的杂合子。     

3个肾上腺脑白质营养不良家系的基因突变分析

目的　对 3个肾上腺脑白质营养不良 ( adrenoleukodystrophy,AL D) ( MIM# 30 0 10 0 )家系进行基因突变分析。方法　从 3个 AL D患儿及其主要家系成员的外周血白细胞 ,提取总 RNA和基因组 DNA。应用逆转录聚合酶链反应技术 ,对 3个家系的 ABCD1基因编码区 ,分 4个片段进行 PCR扩增并对 PCR产物直接测序。同时应用 PCR-限制性酶切或扩增阻滞突变系统分析相应的基因组 DNA,进一步确证ABCD1基因的突变位点。结果　 3名患儿的 ABCD1基因上均存在错义突变 ,其中患儿 1的 ABCD1基因第 5 34位密码子发生 CCC→ CGC改变 ,使脯氨酸被精氨酸取代 ( P5 34R) ;患儿 2的 ABCD1基因第 2 6 6位密码子发生 GGG→AGG改变 ,使甘氨酸被精氨酸取代 ( G2 6 6 R) ;患儿 3母亲的 ABCD1上一个等位基因第 6 17位密码子发生 CGC→ GGC改变 ,使精氨酸被甘氨酸取代 ( R6 17G) ,另一个等位基因未发生突变。结论　在中国人 AL D患者中发现 1个新的 ABCD1基因突变 ( P5 34R) ,并首次在中国人 AL D患者中检测到G2 6 6 R、R6 17G突变     

一个眼牙指发育不良家系的基因突变分析

目的 旨在报道一个罕见的中国汉族眼牙指发育不良家系,并对该家系进行基因突变分析.方法 采用PCR及测序方法检测该家系先证者GJA1基因编码区及其侧翼序列的突变,然后在家系成员中验证,并通过Weblogo软件对可疑变异位点进行保守性分析;同时利用PCR、电泳及测序分析方法,检测HOXD13基因突变,排除患者由HOXD13基因突变致病的可能.结果 该家系内患者均携带GJA1基因的杂合突变c.605 C>T,正常个体均无此突变;该突变导致Cx43蛋白第202位氨基酸由精氨酸变成组氨酸(p.R202H);HOXD13基因未见异常.结论GJA1基因c.605 C>T(p.R202H)突变是该中国汉族眼牙指发育不良家系的致病突变,该突变为中国人群中首次报道.     

4个肾上腺脑白质营养不良家系的基因诊断

目的对4个肾上腺脑白质营养不良家系进行基因突变分析。方法应用RT-PCR技术,对4个患者的AB-CD1基因编码区,分4个片段进行扩增并对PCR产物直接测序。应用变性高效液相色谱技术、PCR-限制性酶切等方法分析相应的基因组DNA,进一步确证ABCD1的突变位点。结果在3名肾上腺脑白质营养不良患者的ABCD1基因上,存在2个不同的碱基置换(807G>A和2113T>C)和1个碱基插入(1126insGCCATCG),分别造成2个错义突变(A141T和L576P)和1个移码突变(fsI246);在患儿1母亲的一个ABCD1等位基因上存在1801-1802位碱基缺失,造成移码突变(fsE471),另一个等位基因未发现突变。结论在中国人ALD患者中发现2个新的ABCD1基因突变(fsI246、L576P)。不同家系具有不同的突变位点,且突变类型和表型之间无特殊的相关性。     

一个中国人裂手足伴并指趾畸形家系的表型和基因型分析

目的 确定一个中国人裂手足家系的致病性基因突变,探讨基因型-表型关系.方法 收集患者及其家庭成员的外周血,提取基因组DNA.采用PCR扩增P63基因和HOXD13基因的外显子,对PCR产物进行双向测序检测基因突变.结果 在所有患者中检测到P63基因第7外显子的杂合型956G→A突变,导致蛋白产物第280位的精氨酸被组氨酸取代(R280H).在正常家庭成员中未检测到该突变.结论 该家族中的患者以对称性裂手足伴并指趾为主要特征,由P63基因的R280H突变所致.     

一例17α-羟化酶/17,20-碳链裂解酶缺陷症患儿的CYP17A1基因突变分析

目的 对1例17α-羟化酶/17,20-碳链裂解酶缺陷症(17α-hydroxylase/17,20-lyase deficiency,17OHD)的患儿进行CYP17A1基因突变分析,同时分析中国17OHD患者的CYP17A1基因突变特点.方法 收集患者的临床资料,应用PCR和DNA测序技术对患者进行CYP17A1基因的突变检测.结果 患者临床表现较典型:高血压、低血钾、性激素和皮质醇明显低于正常、促肾上腺皮质激素升高.患者的CYP17A1基因第6外显子上发现c.987C＞A(p.Y329X)以及c.985del(p.Y329TfsX89)复合杂合突变,分别生成包含328和417个氨基酸的截短蛋白.结论 在患者的CYP17A1基因上发现了c.985del和c.987C＞A复合杂合突变.我国患者中最常见类型为错义突变,且集中于第6和第8外显子.     

眼皮肤白化病研究的新途径及 TYR基因2种新突变的分析

目的: 探讨自眼皮肤白化病(OCA)患者毛发提取DNA对OCA分型研究的可行性及TYR基因2种新突变的致病性。方法: 应用毛发压片镜检,PCR扩增毛发DNA中OCA相关基因各外显子、外显子-内含子交界区及启动子区,直接以序列测定技术分析患者基因突变,明确患者的基因型。对于发现的新突变,采用突变等位基因频率等方法对其进行深入研究。结果: 3个家系的先证者均为1型OCA。家系1的先证者为c.715C>T (p.R239W)和c.929insC (p.P310PfsX7)突变的复合杂合子;家系2的先证者为c.896G>A (p.R299H)的纯合子;家系3的先证者为c.1362+3A>T和c.650G>C (p.R217P)突变的复合杂合子。其中,c.1362+3A>T和c.650G>C (p.R217P)突变为至今尚未报道的新突变,通过对新突变进行分析,推测其极可能为病理性新突变。结论: 本实验成功证实从毛发中提取DNA的方法对OCA分型研究的可行性,同时确定了2种致病性新突变,为今后OCA研究开拓了新的思路和途径。     

一个中国人Liddle综合征家系的SCNN1G基因新突变及其临床特征

目的 分析2个Liddle综合征家系上皮细胞钠通道编码基因SCNN1B及SCNN1G的基因突变.方法 收集2个临床诊断为Liddle综合征的家系,抽取先证者及其家系成员外周血基因组DNA,PCR扩增上皮细胞钠通道β亚单位编码基因SCNN1B和γ亚单位编码基因SCNN1G第13外显子,产物直接DNA测序进行基因突变检测.结果 例1 SCNN1B基因第13外显子的扩增片段经双向测序显示第564密码子存在CGA-TGA(R-X)杂合无义突变,其家系成员均未发现这一基因突变;例2 SCNN1G基因第567密码子存在CAG-TAG(Q-X)杂合无义突变,2个家系成员携带此突变基因,这一突变位点尚未在国内外报道过,50名无关正常人中未发现此突变基因.结论 对临床诊断的Liddle综合征患者及其亲属,进行基因突变检测有助于确定诊断及早期筛查出家系中的其他患者.编码人类肾小管上皮细胞钠通道γ亚单位基因SCNN1G第13外显子第567密码子CAG-TAG(Q-X)杂合无义突变可能会导致Liddle综合征.     

X-连锁的肾上腺脑白质营养不良患者ABCD1基因突变分析

目的　分析我国 X-连锁的肾上腺脑白质营养不良 (X- linked adrenoleukodystrophy,X- AL D)患者 ABCD1基因突变。方法　提取 2 5例 AL D患者外周血基因组 DNA,用 PCR扩增和 DNA直接测序的方法 ,分析 AL D患者 ABCD1基因突变。结果　 2 5例患者中发现 18例有 17种不同的 ABCD1基因突变 ,突变存在于除 4、9和 10以外的每一个外显子 ,错义突变为最常见的类型。10例患者有 10种不同的错义突变 ,其中4种错义突变是国际首次报道 ;3例患者有 3种不同的无义突变 ;1例患者有碱基缺失导致移码突变 ;1例患者有剪切部位的碱基缺失 ;2例患者同时具有两个相同的同义突变。结论　我国 AL D患者大部分存在ABCD1基因突变 ,无突变热点。不同个体常有不同的突变点 ,检测到的突变率约为 70 %。突变类型和表型之间无特殊的相关关系。     

应用双侧扩增阻滞突变系统排除肾上腺脑白质营养不良分子诊断中假基因的干扰

目的应用扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS）排除ABCD1假基因的干扰，对肾上腺脑白质营养不良（adrenoleukodystrophy，ALD）家系进行基因突变分析。方法按ARMS引物设计原则设计上游引物（正常引物、突变引物）和下游公共引物，对家系成员的基因组DNA分别进行PCR扩增。结果R617C突变患者及其母亲的突变引物均扩增出特异性条带（107bp），患者父亲和对照则未见条带，在基因组DNA水平证实了R617C突变的存在。结论双侧ARMS方法可以快速、有效地排除假基因干扰。     

肾上腺脑白质营养不良的产前分子诊断

目的对2名来自不同家系的肾上腺脑白质营养不良携带者所怀胎儿进行产前分子诊断。方法在采用STR位点分析方法排除母体基因组DNA污染后，应用扩增阻滞突变系统和DNA斑点杂交的方法对胎儿1羊水基因组DNA进行检测，应用PCR-RFLP和DNA序列测定对胎儿2羊水基因组DNA进行分析。结果在针对R617G突变的扩增阻滞突变系统中，当使用突变引物时，从胎儿1羊水DNA、胎儿1母亲基因组DNA均扩增出185bp的预期特异性条带，而胎儿1父亲和对照则未扩出。在斑点杂交反应中，应用R617G突变型探针时，只有胎儿1羊水细胞及其母亲外周血基因组DNA出现特异性显色斑点。在第2个家系中，先用PCR扩增出横跨P534R突变位点的基因组DNA片段（506bp），应用HoeⅡ酶切此产物，胎儿2以及其父亲、无关对照均未见切割，其母亲的部分产物被切割成396bp和110bp两个片段。对此PCR产物进行DNA序列测定，未在胎儿2中检测出P534R突变。结论胎儿1带R617G突变，为肾上腺脑白质营养不良半合子；胎儿2不带P534R突变，为正常半合子。     

Decreased expression of ABCD4 and BG1 genes early in the pathogenesis of X-linked adrenoleukodystrophy

Childhood cerebral adrenoleukodystrophy (CCER), adrenomyeloneuropathy (AMN) and AMN with cerebral demyelination (AMN-C) are the main phenotypic variants of X-linked adrenoleukodystrophy (ALD). It is caused by mutations in the ABCD1 gene encoding a half-size peroxisomal transporter that has to dimerize to become functional. The biochemical hallmark of ALD is the accumulation of very-long-chain fatty acids (VLCFA) in plasma and tissues. However, there is no correlation between the ALD phenotype and the ABCD1 gene mutations or the accumulation of VLCFA in plasma and fibroblast from ALD patients. The absence of genotype-phenotype correlation suggests the existence of modifier genes. To elucidate the mechanisms underlying the phenotypic variability of ALD, we studied the expression of ABCD1, three other peroxisomal transporter genes of the same family (ABCD2, ABCD3 and ABCD4) and two VLCFA synthetase genes (VLCS and BG1) involved in VLCFA metabolism, as well as the VLCFA concentrations in the normal white matter (WM) from ALD patients with CCER, AMN-C and AMN phenotypes. This study shows that: (1) ABCD1 gene mutations leading to truncated ALD protein are unlikely to cause variation in the ALD phenotype; (2) accumulation of saturated VLCFA in normal-appearing WM correlates with ALD phenotype and (3) expression of the ABCD4 and BG1, but not of the ABCD2, ABCD3 and VLCS genes, tends to be correlated with the severity of the disease, acting early in the pathogenesis of ALD.     

X-连锁肾上腺脑白质营养不良产前诊断探讨

目的探讨X-连锁肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy,ALD)产前诊断的方法。方法应用气相色谱-质谱联用法对17例ALD高危孕妇进行了18次羊水细胞中极长链脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)水平测定,其中8例胎儿出生后或引产后进行了血浆VLCFAs水平检测。应用PCR和测序方法对8例胎儿羊水细胞或生后外周血细胞DNA进行了基因突变分析(其中4例羊水细胞VLCFAs水平增高,4例VLCFAs正常)。应用Western杂交对同一家系的两例胎儿羊水细胞进行了ALD蛋白(ALD protein,ALDP)的检测(两例胎儿VLCFAs均增高,1例女性,1例男性)。结果18例胎儿中,11例羊水细胞VLCFAs水平正常,7例增高(3例男性,4例女性)。8例胎儿出生后或引产后血浆VLCFAs水平检测,3例增高,5例正常,与产前诊断结果相一致。其中4例羊水细胞VLCFAs水平增高的胎儿,均有ABCD1基因突变,4例羊水细胞VLCFAs水平正常者,均未发现突变。VLCFAs增高的男性胎儿,未检测到ALDP,VLCFAs增高的女性胎儿,可检测到ALDP。结论羊水细胞中VLCFAs水平检测可以准确地进行X-ALD产前诊断,结合基因突变分析及ALDP的测定,可进一步保证产前诊断的准确性。     

X-linked adrenoleukodystrophy in Spain. Identification of 26 novel mutations in the ABCD1 gene in 80 patients. Improvement of genetic counseling in 162 relative females

In this study, we analyzed the ABCD1 gene in 80 X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) patients from 62 unrelated families. We identified 53 different mutations, of which 26 are novel and two are non-pathogenic sequence variants (L516L and 3'UTR, 2246C/G) that have been previously described. The Spanish population had significant allelic heterogeneity, in which most of the mutations were exclusive to a single family 47/53 (88.7%). Only six mutations (Y174S, G277R, FsE471, R518Q, P543L, and R554H) were found in more than one family. Mutations G277R, P543L, and R554H were the most frequent, each of them being found in three patients (5%). Intra-familiar phenotype variability was observed in most of the families, but in one, with the novel mutation R120P, only the adult mild phenotype was present (five hemizygous family members). We detected 80 heterozygous women by mutation analysis, but only 78 of them showed increased very-long-chain fatty acid levels. In conclusion, this study extends the spectrum of mutations in X-ALD and facilitates the identification of heterozygous females. Our results are also consistent with previous studies reporting the difficulty of predicting genotype-phenotype correlation.