基因芯片快速检测结核分枝杆菌katG基因突变及其与异烟肼耐药相关性

目的了解结核分枝杆菌katG基因S315突变与异烟肼（isoniazid,INH）耐药相关性,建立快速简便的katG基因S315突变基因芯片检测方法。方法采用二倍稀释法检测123株结核分枝杆菌临床分离菌株对INH的耐药性。PCR及测序确定上述结核分枝杆菌katG基因S315位点突变率及突变类型。根据PCR及测序结果,设计Cy3荧光标记探针并制备katG基因S315位点突变检测基因芯片。基因芯片检测结果与PCR及测序结果进行对比分析。结果 123株结核分枝杆菌临床菌株中,39.0%（48/123）菌株对INH敏感,61.0%（75/123）菌株对INH耐药。结核分枝杆菌H37Rv株及所有临床菌株均能扩增出katG基因片段。75株INH耐药菌株中,69.3%（52/75）菌株katG基因出现S315位突变,其中25株突变类型为S315N（AGC→AAC）、12株为S315T（AGC→ACC）、7株为S315I（AGC→ATC）、各有3株分别为S315T（AGC→CGC）和S315R（AGC→AGA）、2株为S315G（AGC→GGC）。所制备的基因芯片对123株结核分枝杆菌katG基因S315野生型或突变型检测结果与PCR及测序结果完全一致。结论结核分枝杆菌katG基因S315突变与INH耐药密切相关。本研究中制备的基因芯片可快速、简便、准确、敏感和特异地检测结核分枝杆菌katG基因S315突变及其类型。     

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药相关基因突变研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG、inhA、ahpC、kasA及oxyR基因突变特点。方法对144株结核分枝杆菌临床分离株(耐异烟肼菌株101株;异烟肼敏感株43株)的katG、inhA、kasA、ahpC及oxyR基因进行DNA片断扩增及DNA序列分析,与GeneBank中结核分枝杆菌标准序列进行比较。结果(1)耐异烟肼菌株中未发现katG完全缺失,81株耐药株(80.2%)katG存在点突变、缺失或插入,其中16个突变位点未见报道;39株(38.6%)耐药株第315位点突变,低耐药菌株(1μg/ml)第315位点突变率显著高于高耐药菌株(10μg/ml;χ2=9.31,P<0.05);58株(57.4%)耐药株第463位点突变。23株(53.3%)敏感株第463位点突变。(2)5株(4.9%)耐药株inhA发生突变。敏感株inhA无突变。(3)3株(2.9%)耐药株ahpC发生突变。敏感株ahpC无突变。(4)17株(16.8%)耐药株kasA发生突变。敏感株中3株菌株Gly312Ser突变。(5)在全部菌株中未发现oxyR基因突变。(6)综合本项研究中各基因的突变情况,共有91株耐异烟肼菌株发生与异烟肼耐药相关的突变。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG、inhA、ahpC及kasA基因突变之间的关系,并且提示还有其他机制参与异烟肼耐药。     

华东地区耐药结核分枝杆菌katG基因的变异

目的了解我国华东地区结核分枝杆菌中与异烟肼耐药相关的katG基因的变异情况，提供我国异烟肼耐药相关的基因谱。方法对429株结核杆菌行核酸抽提后先以限制性酶切片段多态性方法检测有无最常见的耐药相关S315T突变，对未发现S315T突变的异烟肼耐药株取部分行katG全基因测序以了解其他位点的变异情况。结果耐药结核分枝杆菌中76．9％（166／216）存在katG基因$315T突变。发现有2株异烟肼高度耐药株中存在katG基因片段的缺失。48株异烟肼耐药株测序结果发现katG基因突变特点如下：突变率较高的有315、463、234位点，其余突变位点较多而分散。315位密码子的突变中除S315T外，S315N突变形式也较常见，占8．7％。结论结核分枝杆菌耐药机制复杂，了解耐药相关基因的变异情况是建立可靠的耐药性分子检测方法的基础。     

结核分枝杆菌katG S315T突变频率及突变株特征的研究

近年来分子遗传学研究表明，异烟肼（INH）耐药机制复杂，涉及多个基因，至少包括katG、inhA、kasA以及ahpC等基因。研究表明，INH耐药与编码过氧化氢酶．过氧化物酶的katG基因突变的联系最强，其中katG基因的一种特定替换，315位密码子的AGC→ACC（Ser→Thr，或katG S315T）颠换报道最多。该突变可降低INH耐药菌株中过氧化氢酶活性，但可保持足够水平的该酶的过氧化物酶活性，后者为细菌解毒所必需。世界各地结核分枝杆菌菌株中，katG S315T突变的流行率一般为26．0％～93．6％，结核病高发区流行率高。在俄罗斯圣彼德堡地区，该突变还与耐多药性有关，在荷兰该突变亦与高水平耐药、耐其他药物有关。研究我国农村耐多药结核病（MDR-TB）高发地区INH耐药分离株中katG S315T突变的发生频率与突变株特征有利于耐药结核病的防治。     

高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测

目的评价高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve,HRM)检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法 1)通过传统比例法药敏实验对本实验室保存的49株结核分枝杆菌进行异烟肼耐药性分析。2)进一步对该结核分枝杆菌进行异烟肼耐药相关基因KatG基因和inhA基因进行异烟肼耐药决定区测序分析,筛查突变位点。3)根据筛查到的突变位点设计高分辨率熔解曲线分析所用的特异性引物,对异烟肼耐药基因耐药决定区进行高分辨率熔解曲线分析检测DNA突变,评估用高分辨率熔解曲线分析技术对结核分枝杆菌异烟肼耐药性检测的效率。结果 1)比例法药敏结果显示,49株实验菌株中20株为异烟肼耐药株,29株为异烟肼敏感株。2)测序分析结果显示:(1)KatG基因出现了4种突变形式,分别是234单位点突变;234、315双位点突变;234、463双位点突变;234、315、463三位点联合突变。(2)inhA基因检测到3种突变,即-8位、-15位、-152位。3)(1)对耐药株的基因突变进行分析发现:20株异烟肼耐药株中11株存在KatG基因第315位密码子的突变、占异烟肼耐药株的55%;6株存在inhA基因-15(4株)位碱基、-8(1株)位碱基、-152(1株)位碱基的突变,共占异烟肼耐药株的30%;2株同时存在基因KatG315密码子和inhA-15位碱基的突变,占异烟肼耐药株的10%;1株均未检测到KatG基因和inhA基因的突变,占异烟肼耐药株的5%。通过基因突变检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感性为95%、特异性为100%。(2)用高分辨率溶解曲线检测实验菌株耐药基因突变的结果显示,18株存在基因突变,24株不存在基因突变,检测的灵敏度为94.7%、特异性为80%。(3)以高分辨率熔解曲线检测到突变为耐药的判断标准,检出19株为耐药株,24株为敏感株。以比例法药敏结果为参照,检测的灵敏度为95%、特异性为82.76%。结论高分辨率溶解曲线用于结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的检测具有较好的灵敏度,耗时短,在异烟肼耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。     

重庆地区结核分枝杆菌异烟肼和丙硫异烟胺耐药及其交叉耐药相关基因突变研究

目的 研究结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)和丙硫异烟胺(Pto)的耐药情况,分析INH耐药相关基因(katG、inhA、ahpC、kasA)及与Pto交叉耐药相关基因的突变特点。方法 对233株INH耐药MTB临床分离株(37株对Pto同时耐药)的katG、inhA、ahpC、kasA基因进行扩增及序列分析。结果 耐异烟肼菌株中未发现katG完全缺失,223株 (96.5%)耐药株katG存在点突变、插入,其中 2个突变位点未见报道。195株 (83.6%)耐药株的第 315位点突变;189株 (81.1%)耐药株第463位点突变(R463L),其中166株 (71.2%)与第 315位点联合突变;在其他位点发生突变的菌株4株,包括D448G 1株、D419H 1株和2株同义突变。 11株(4.72%) INH耐药菌株中inhA点突变,包括S94A 1株、I194T 1株,C-15T 9株。37株Pto耐药的菌株中,8株点突变且均为inhA C-15T(4株为inhA单基因点突变C-15T,4株发生katG S315T和inhA C-15T的双基因联合突变)。全部耐药菌中有1株为ahpC基因突变,未发现有kasA基因突变。结论 进一步证实katG315和inhA-15基因位点突变与MTB对INH耐药密切相关;INH与Pto存在着交叉耐药,但耐药率较低,Pto耐药的发生与inhA-15位点突变密切相关。     

六安地区结核分枝杆菌耐药基因katG 和rpoB 的突变特征

目的 分析临床分离的结核分枝杆菌katG 和rpoB 基因的突变情况与耐药之间的关系,了解六安地区耐药结核分枝杆菌的基因突变特征。方法 采用比例法对六安地区65 株结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验;通过特异性引物,对目的基因片段katG 和rpoB 进行扩增、测序后进行分析。结果 60 株结核分枝杆菌中分别有有9 株耐异烟肼和14 株耐利福平,其中同时耐异烟肼和利福平的6株。9 株耐异烟肼菌株中,4 株katG 在315（Ａ GC→ACC 或ACA）位点发生突变,占44.4％;14 株耐利福平菌株中,11 株rpoB 分别在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC 或TAC)和531(TCG→TTG)位点发生突变,占总耐药菌株的78.6％;6 株同时对利福平和异烟肼耐药,其中5 株katG 或rpoB 基因发生突变,占83.3％。结论 六安地区结核分枝杆菌耐异烟肼和耐利福平分别主要是由katG 和rpoB 基因突变引起,其中耐异烟肼主要在315（AGC→ACC 或ACA）位,而耐利福平在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC或TAC)和531(TCG→TTG)位,都发生了突变。     

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变及其分子流行病学调查研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG基因突变特点以及Spoligotyping分型和结核病流行关系。方法对123株结核分枝杆菌临床分离株，其中有药敏结果的98株，（耐异烟肼菌株45株；异烟肼敏感株53株）的katG基因进行DNA片断扩增然后进行SSCP分析；同时对其中的121株菌株进行Spoligotyping分型。结果45株耐INH结核杆菌株中，27株（60％）第315位点突变，低耐药菌株（1mg／L）第315位点突变率显著高于高耐药菌株（10mg／L；53株敏感株中无KatG基因315位密码子突变。对121株临床株的Spoligotyping DNA指纹分析，1型，（北京型）103株占84％（103／121），其它基因型18株，分散在13种基因型中。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG基因突变之间的关系；北京型感染是北京地区结核病流行的重要原因。     

福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因突变特征初步分析

目的 了解福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因的突变特征,为异烟肼耐药快速检测方法的建立提供一定的科学依据。方法 对来源于福建省结核病耐药性监测30个监测点纳入的75株耐多药和10株全敏感结核分枝杆菌分离株,进行katG、inhA、oxyR-ahpC基因片段PCR扩增并测序分析,用RD105缺失基因检测法进行北京家族基因型鉴定,使用卡方检验分析相关性。结果 10株全敏感株未检测到突变。75株耐多药结核分枝杆菌检测到72株katG、inhA、oxyR-ahpC发生单一或联合基因突变,突变率为96.0%(72/75)。其中,65株(86.7%,65/75)发生katG突变,涉及5个位点,最常见位点突变的密码子是315,突变率为82.7 %(62/75),最常见突变形式为Ser315Thr(77.3%,58/75);8株(10.7%,8/75)发生inhA突变,突变形式均为C(-15)T;5株(6.7%,5/75)发生oxyR-ahpC突变,突变形式为C(-39)T或C(-46)A。katG、inhA和oxyR-ahpC 在北京家族基因型菌株和非北京家族基因型菌株中的突变率分别为83.9 %(47/56)、12.5%(7/56)、7.1 %(4/56)和94.7 %(18/19)、5.3 %(1/19)、5.3 %(1/19),差异无统计学意义(P值分别为0.23、0.38、0.78)。结论 福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药性相关基因突变绝大多数发生在katG、inhA和oxyR-ahpC基因位点,且以katG突变为主。初步分析显示北京家族基因型菌株流行与异烟肼耐药基因突变特征无关。     

应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性

目的 应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)对利福平和异烟肼的耐受性,评价其临床应用价值。方法 应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增-基因芯片杂交的方法检测经常规药敏实验证实的30株Mtb利福平和异烟肼敏感株和50株耐利福平和异烟肼分离株的rpoB基因及katG和inhA基因突变,同时以PCR-直接测序法为对照。结果 应用PCR-基因芯片与基因测序方法检测30株Mtb利福平敏感株rpoB基因和异烟肼敏感株katG基因和inhA基因均为野生型。50株Mtb利福平耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析3株rpoB基因均为野生型,41株均为突变型;6株PCR-基因芯片与基因测序结果不一致。50株Mtb异烟肼耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析16株katG基因和30株inhA基因均为野生型,31株katG基因均为315位密码子突变,7株inhA基因均为15位突变型,其中2株为katG和inhA双重突变;3株katG和13株inhA PCR-基因芯片与基因测序结果不一致。结论 应用PCR-基因芯片方法可快速、有效地检出大多数Mtb耐多药分离株,指导临床用药。     

Mtb耐异烟肼基因变异株的体外最小抑菌浓度研究

目的 研究Mtb耐INH临床分离株katG基因、inhA基因、ahpC基因突变对其体外最小抑菌浓度（MIC）的影响。方法 对临床分离的耐INH的160株Mtb及对INH敏感的40株Mtb进行耐药基因芯片检测;并对所有标本进行INH MIC测定,比较不同变异株的MIC结果,其数据采用t检验进行比较,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果 Mtb耐INH株katG 315基因变异占68.8%（110/160）,katG 315基因变异株的MIC为（20.20±19.46 μg/ml）,高于inhA变异株（0.73±0.82 μg/ml）（t′=10.9171,t′_α=1.9807,P＜0.05）;低于katG 315+inhA变异株（69.33±32.45 μg/ml）,（t′= 7.164,t′_α= 2.0627,P＜0.05）。结论 Mtb耐INH基因有不同的突变模式,各模式存在不同的耐药程度,此可以给临床用药进一步提供参考。     

Molecular analysis of isoniazid, rifampin and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from patients with tuberculosis in Düzce, Turkey

The aim of this study was to use DNA sequencing analysis to analyze the mutations in the most commonly targeted genes (katG, inhA, rpoB, rpsL) in isoniazid (INH)-, rifampin (RIF)- and streptomycin (SM)-resistant Mycobacterium tuberculosis strains obtained from subjects in Duzce, Turkey. Four isolates were found to be INH-resistant, 3 were RIF-resistant and 5 were SM-resistant, out of a total of 52 M. tuberculosis strains. In 3 of the 4 INH-resistant strains, a mutation in the katG gene in codon 315 appeared as AGC-->ACC (Ser-->Thr), and the other INH-resistant strain showed a mutation in the katG gene in codon 314 as ACC-->CCC (Thr-->Pro). There were no mutations in the inhA gene in INH-resistant isolates. Two of the 3 RIF-resistant strains were found to have mutations in the rpoB gene in codon 516 appearing as GAC-->GTC (Asp-->Val), and the other RIF-resistant strain has a mutation in the rpoB gene in codon 531 as TCG-->TTG (Ser-->Leu). These 3 RIF-resistant strains are also INH-resistant. All 5 SM-resistant strains have mutations in the rpsL gene in codon 43 appearing as AAG-->AGG (Lys-->Arg). Thus, we found common gene mutations that bring about the resistance of M. tuberculosis to antituberculosis drugs in all of our isolates from Duzce. To the best of our knowledge, the ACC-->CCC (Thr-->Pro) mutation in the katG gene in codon 314 has not been previously defined.     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变微通道电泳检测方法的建立

目的 建立一种用微通道电泳芯片分析系统检测结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变的方法。方法 以丙烯酰胺及其衍生物的聚合物溶液作为筛分介质，溶液中掺入微量的吖啶橙作为荧光标记物，对结核分支杆菌的异烟肼耐药相关的katG和inhA基因进行单链构象多态性(SSCP)分析，检测其与耐药性相关的突变。对于突变部位附近没有二级结构的inhA基因，设计了特别的引物使扩增产物增加一个能与突变部位配对的区域，从而使野生型片段呈现独特的构象。结果 此方法可实现对katG基因野生型片段与315位密码子突变型片段的区分，以及对inhA基因调节序列野生型与突变型片段的区分。30个临床分离株中的23个耐药株有22个被检出，效率达95％。结论 微通道电泳方法用于结核杆菌耐药基因突变检测，具有快速、灵敏的优点，可望将之应用于临床耐药性检测。     

Multiple mutations in katG and inhA identified in Thai isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates

A total of 29 Thai multi-drug-resistant/isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates were analyzed for mutations in katG from codons 254 to 549, inhA promoter and inhA open reading frame by DNA sequencing and single strand conformation polymorphism. Twenty-five multi-drug resistant isolates exhibited single point mutations (17 isolates at Ser315Thr plus Arg463Leu, 1 at Thr308Pro plus Arg463Leu, 7 at either Ser315Thr or Arg463Leu) while the other 4 isoniazid-resistant isolates had single point mutation only at Arg463Leu. Seven of 25 multi-drug-resistant isolates [4 at C(-15)T, 1 at T(-8)C; 1 at C(-15)T plus Ser94Ala and 1 at Ile21Val] and 2 of 4 isoniazid-resistant isolates [1 at C(-15)T, 1 at C (-15)T plus Ile21Thr] had mutations in inhA promoter and open reading frame, while the other 20 isolates had no mutation at any position. No frame shift mutation was observed in any tested isolates. This is the first report of two mutations, Trp308Pro of katG and T (-8)C of inhA in Mycobacterium tuberculosis isolates.