利用荧光偏振技术检测耐异烟肼结核分枝杆菌KatG 315点突变

目的 应用模板指导的荧光染料终止物掺入反应-荧光偏振检测技术(templatedirected dye-terminator incorporation with fluorescence polarization detection，TDI-FP)分析结核分枝杆菌KatG 315点突变与异烟肼耐药性的关系，并建立一种准确、快速的诊断结核分枝杆菌异烟肼耐药性的新方法。方法 对临床82例耐多药结核病患者所感染的结核分枝杆菌菌株进行常规培养和药敏实验；提取结核分枝杆菌DNA，并经聚合酶链反应(PCR)扩增271bp的KatG基因片段，PCR产物经消化处理清除残余dNTPs和引物，进行TDI反应，应用Victor2测定荧光偏振值，分析所有样品的KatG基因315位点的基因型。结果 29例异烟肼高度耐药患者的结核分枝杆菌中有15例发生KatG 315的G→C突变，其中4例为KatG 315突变和未突变的混合感染，突变率为52％；32例异烟肼低度耐药患者的结核分枝杆菌中有15例为KatG 315突变和未突变的混合感染，突变率为47％；21例异烟肼敏感患者的结核分枝杆菌未发现KatG 315突变。结论 KatG 315突变与结核分枝杆菌对异烟肼产生耐药性密切相关；应用TDI-FP技术检测KatG 315突变具有准确、快速、简便以及高通量等优点，在结核分枝杆菌耐异烟肼的临床诊断中有着广阔的应用前景。     

福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因突变特征初步分析

目的 了解福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因的突变特征,为异烟肼耐药快速检测方法的建立提供一定的科学依据。方法 对来源于福建省结核病耐药性监测30个监测点纳入的75株耐多药和10株全敏感结核分枝杆菌分离株,进行katG、inhA、oxyR-ahpC基因片段PCR扩增并测序分析,用RD105缺失基因检测法进行北京家族基因型鉴定,使用卡方检验分析相关性。结果 10株全敏感株未检测到突变。75株耐多药结核分枝杆菌检测到72株katG、inhA、oxyR-ahpC发生单一或联合基因突变,突变率为96.0%(72/75)。其中,65株(86.7%,65/75)发生katG突变,涉及5个位点,最常见位点突变的密码子是315,突变率为82.7 %(62/75),最常见突变形式为Ser315Thr(77.3%,58/75);8株(10.7%,8/75)发生inhA突变,突变形式均为C(-15)T;5株(6.7%,5/75)发生oxyR-ahpC突变,突变形式为C(-39)T或C(-46)A。katG、inhA和oxyR-ahpC 在北京家族基因型菌株和非北京家族基因型菌株中的突变率分别为83.9 %(47/56)、12.5%(7/56)、7.1 %(4/56)和94.7 %(18/19)、5.3 %(1/19)、5.3 %(1/19),差异无统计学意义(P值分别为0.23、0.38、0.78)。结论 福建省结核分枝杆菌异烟肼耐药性相关基因突变绝大多数发生在katG、inhA和oxyR-ahpC基因位点,且以katG突变为主。初步分析显示北京家族基因型菌株流行与异烟肼耐药基因突变特征无关。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG的检测

目的探讨结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药的分子机制,建立快速检测结核分枝杆菌INH耐药性的方法。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测105株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因,运用DNA测序和生物信息分析比对进行验证。结果以H37Rv标准株为对照,34株敏感株中5株(14.7%)存在KatG基因异常,105株耐药株中55株(52.4%)存在KatG基因异常。结论结核分枝杆菌对INH耐药与KatG基因突变有关,PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对INH的耐药性。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的价值北大核心CSCD

目的分析南京市结核分枝杆菌(MTB)感染患者的耐药情况,评价荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性的临床价值,探究RFP和INH耐药相关基因突变的特征。方法对鉴定为MTB的780株菌株同时进行绝对浓度法药物敏感性试验和荧光PCR熔解曲线法检测对RFP和INH的耐药性。以绝对浓度法药物敏感性试验结果为标准,分析熔解曲线法检测RFP和INH的灵敏度、特异度、符合率和一致性(Kappa检验)。结果780株MTB中,22株(2.82%)为RFP单耐药,62株(7.95%)为INH单耐药,143株(18.33%)为耐多药。以绝对浓度法药敏试验结果为标准,荧光PCR熔解曲线法检测MTB对RFP和INH耐药性的灵敏度分别为98.18%和85.85%,特异度分别为95.28%和97.39%,符合率分别为95.90%和94.36%,Kappa值分别为0.88和0.85。RFP分子耐药菌株中全部检测出rpoB基因位点突变,其中以rpoB 529~533位点为最常见的突变(63.87%,122/191),突变位点为rpoB 507~512的20株菌株中只有7株表型耐药,rpoB基因双位点突变的18株菌株全部表型耐药;INH分子耐药菌株中最常见的突变为katG 315位点(66.49%,127/191),其次是inhA启动子区(17.80%,34/191),90%以上的INH分子耐药菌株为表型耐药。结论南京市结核耐药情况严重,以耐多药结核病为主。荧光PCR熔解曲线法与药敏试验结果高度一致,且弥补了药敏试验对于低度耐药突变株菌检测的局限性。耐药相关基因突变位点的检测有利于结核病的及时诊断和个体化治疗的实施。     

耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药相关基因突变研究

目的阐明结核分枝杆菌耐异烟肼临床分离株katG、inhA、ahpC、kasA及oxyR基因突变特点。方法对144株结核分枝杆菌临床分离株(耐异烟肼菌株101株;异烟肼敏感株43株)的katG、inhA、kasA、ahpC及oxyR基因进行DNA片断扩增及DNA序列分析,与GeneBank中结核分枝杆菌标准序列进行比较。结果(1)耐异烟肼菌株中未发现katG完全缺失,81株耐药株(80.2%)katG存在点突变、缺失或插入,其中16个突变位点未见报道;39株(38.6%)耐药株第315位点突变,低耐药菌株(1μg/ml)第315位点突变率显著高于高耐药菌株(10μg/ml;χ2=9.31,P<0.05);58株(57.4%)耐药株第463位点突变。23株(53.3%)敏感株第463位点突变。(2)5株(4.9%)耐药株inhA发生突变。敏感株inhA无突变。(3)3株(2.9%)耐药株ahpC发生突变。敏感株ahpC无突变。(4)17株(16.8%)耐药株kasA发生突变。敏感株中3株菌株Gly312Ser突变。(5)在全部菌株中未发现oxyR基因突变。(6)综合本项研究中各基因的突变情况,共有91株耐异烟肼菌株发生与异烟肼耐药相关的突变。结论本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG、inhA、ahpC及kasA基因突变之间的关系,并且提示还有其他机制参与异烟肼耐药。     

华东地区耐药结核分枝杆菌katG基因的变异

目的了解我国华东地区结核分枝杆菌中与异烟肼耐药相关的katG基因的变异情况，提供我国异烟肼耐药相关的基因谱。方法对429株结核杆菌行核酸抽提后先以限制性酶切片段多态性方法检测有无最常见的耐药相关S315T突变，对未发现S315T突变的异烟肼耐药株取部分行katG全基因测序以了解其他位点的变异情况。结果耐药结核分枝杆菌中76．9％（166／216）存在katG基因$315T突变。发现有2株异烟肼高度耐药株中存在katG基因片段的缺失。48株异烟肼耐药株测序结果发现katG基因突变特点如下：突变率较高的有315、463、234位点，其余突变位点较多而分散。315位密码子的突变中除S315T外，S315N突变形式也较常见，占8．7％。结论结核分枝杆菌耐药机制复杂，了解耐药相关基因的变异情况是建立可靠的耐药性分子检测方法的基础。     

耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因katG突变分析

异烟肼(isoniazid, INH)是一种重要的抗结核药物,其在细菌体内被过氧化氢酶-过氧化物酶KatG氧化为乙酰异烟肼自由基和活性氧自由基等活性物质,进而攻击结核分枝杆菌多个靶位点来发挥杀菌作用。Zhang等通过Southern印迹杂交（Southern blot）发现结核分枝杆菌katG基因缺失和异烟肼耐药相关。研究表明,异烟肼耐药与许多基因相关,发生频率最高的为katG编码区和inhA启动子区的突变,katG315位突变最常见,有30%～94%的耐药株发生该突变,但国内对于该基因其他位点的突变研究较少。本研究通过对河南省耐多药(multidrug resistant,MDR)结核分枝杆菌katG编码区全长突变进行分析,进一步分析异烟肼的耐药机制。     

31株结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因检测及序列分析

目的了解贵阳地区分离的结核分枝杆菌katG基因、inhA启动子和oxyR-aphc间隔区基因突变特征。方法对31株结核分枝杆菌临床分离株（异烟肼耐药株17株,异烟肼敏感株14株）的katG基因、inhA启动子和oxyRaphc间隔区进行DNA片段的PCR扩增,并进行测序分析。结果 17株异烟肼耐药菌株中有16株检出katG基因突变,其中70.5%（12/17）为315位密码子变异,且变异类型均为AGC→ACC,敏感株未发现315位点突变。11株敏感菌和4株耐药菌在463位密码子发生变异,变异类型均为CGG→TGG,变异率分别为78.6%（11/14）和23.5%（4/17）,差异无统计学意义。有12株耐药株的变异类型为katG基因双重位点突变,其中10株为katG315（AGC→ACC）和463（CGG→TGG）位变异,463（CGG→TGG）和299（GGC→AGC）变异及463（CGG→TGG）和419（GAC→CAC）位变异各1株。2株异烟肼耐药菌检出oxyR-aphC启动区G32A突变,其中1株为联合katG463和299位突变。结论贵阳株结核杆菌菌株异烟肼耐药基因突变具有多态性,主要的变异类型为katG315位点突变。     

结核分枝杆菌部分耐药相关基因的突变特点

目的分析结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特点，评价DNA序列分析用于结核分枝杆菌快速耐药性检测的应用价值。方法利用DNA序列分析检测结核分枝杆菌的KatG、rpoB和gyrA基因片段。结果8681％（79／91）异烟肼耐药株存在katG基因的点突变和／或单碱基插入，最常见的突变形式为R463L，占76．92％（70／91）。90．38％（94／104）的利福平耐药株rrpoB基因耐药决定区（RRDR）发生突变，突变类型有26种，涉及11种氨基酸，突变集中在密码子507～533位。70．49％（86／122）氧氟沙星耐药株在gyrA基因耐药决定区（QRDR）发生突变，突变主要形式为A90V、D94Y、D94N、D94H及S91P。结论耐药相关基因突变的检测可作为临床快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法之一。     

两种分子检测技术对结核分枝杆菌临床分离株耐药性诊断价值的评价

目的评价荧光PCR探针熔解曲线方法和线性探针技术检测结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼耐药性突变的应用价值。方法回顾性分析2013年12月-2014年3月广州市胸科医院荧光PCR探针熔解曲线及线性探针检测142例结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼耐药突变情况,以表型药敏试验结果为标准,评价上述两种分子检测技术的检验效能。结果 142份结核分枝杆菌临床分离株中,以表型药敏试验结果为标准,荧光PCR熔解曲线法检测利福平耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为92.86%、96.49%和95.77%;对异烟肼敏感度、特异度和符合率分别为72.09%、100.00%和91.55%。以表型药敏试验结果为标准,线性探针法检测142份结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药性的敏感度、特异度和符合率分别为82.14%、98.25%和95.07%;对异烟肼敏感度、特异度和符合率分别为67.44%、100.00%和90.14%。荧光PCR熔解曲线法和线性探针方法对利福平和异烟肼耐药性的检测结果比较,差异无统计学意义(P0.05)。荧光PCR熔解曲线法与表型药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的Kappa值为0.87,对异烟肼耐药性的Kappa值为0.72。线性探针法与表型药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的Kappa值为0.84,对异烟肼耐药性的Kappa值为0.67。结论荧光PCR探针熔解曲线方法和线性探针方法在检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性方面,具有同等的检验效能,可以早期快速诊断耐药结核病。     

Mtb耐异烟肼基因变异株的体外最小抑菌浓度研究

目的 研究Mtb耐INH临床分离株katG基因、inhA基因、ahpC基因突变对其体外最小抑菌浓度（MIC）的影响。方法 对临床分离的耐INH的160株Mtb及对INH敏感的40株Mtb进行耐药基因芯片检测;并对所有标本进行INH MIC测定,比较不同变异株的MIC结果,其数据采用t检验进行比较,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果 Mtb耐INH株katG 315基因变异占68.8%（110/160）,katG 315基因变异株的MIC为（20.20±19.46 μg/ml）,高于inhA变异株（0.73±0.82 μg/ml）（t′=10.9171,t′_α=1.9807,P＜0.05）;低于katG 315+inhA变异株（69.33±32.45 μg/ml）,（t′= 7.164,t′_α= 2.0627,P＜0.05）。结论 Mtb耐INH基因有不同的突变模式,各模式存在不同的耐药程度,此可以给临床用药进一步提供参考。     

重庆地区结核分枝杆菌异烟肼和丙硫异烟胺耐药及其交叉耐药相关基因突变研究

目的 研究结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)和丙硫异烟胺(Pto)的耐药情况,分析INH耐药相关基因(katG、inhA、ahpC、kasA)及与Pto交叉耐药相关基因的突变特点。方法 对233株INH耐药MTB临床分离株(37株对Pto同时耐药)的katG、inhA、ahpC、kasA基因进行扩增及序列分析。结果 耐异烟肼菌株中未发现katG完全缺失,223株 (96.5%)耐药株katG存在点突变、插入,其中 2个突变位点未见报道。195株 (83.6%)耐药株的第 315位点突变;189株 (81.1%)耐药株第463位点突变(R463L),其中166株 (71.2%)与第 315位点联合突变;在其他位点发生突变的菌株4株,包括D448G 1株、D419H 1株和2株同义突变。 11株(4.72%) INH耐药菌株中inhA点突变,包括S94A 1株、I194T 1株,C-15T 9株。37株Pto耐药的菌株中,8株点突变且均为inhA C-15T(4株为inhA单基因点突变C-15T,4株发生katG S315T和inhA C-15T的双基因联合突变)。全部耐药菌中有1株为ahpC基因突变,未发现有kasA基因突变。结论 进一步证实katG315和inhA-15基因位点突变与MTB对INH耐药密切相关;INH与Pto存在着交叉耐药,但耐药率较低,Pto耐药的发生与inhA-15位点突变密切相关。     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变微通道电泳检测方法的建立

目的 建立一种用微通道电泳芯片分析系统检测结核分支杆菌异烟肼耐药基因突变的方法。方法 以丙烯酰胺及其衍生物的聚合物溶液作为筛分介质，溶液中掺入微量的吖啶橙作为荧光标记物，对结核分支杆菌的异烟肼耐药相关的katG和inhA基因进行单链构象多态性(SSCP)分析，检测其与耐药性相关的突变。对于突变部位附近没有二级结构的inhA基因，设计了特别的引物使扩增产物增加一个能与突变部位配对的区域，从而使野生型片段呈现独特的构象。结果 此方法可实现对katG基因野生型片段与315位密码子突变型片段的区分，以及对inhA基因调节序列野生型与突变型片段的区分。30个临床分离株中的23个耐药株有22个被检出，效率达95％。结论 微通道电泳方法用于结核杆菌耐药基因突变检测，具有快速、灵敏的优点，可望将之应用于临床耐药性检测。     

124例耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌相关基因的突变特征进行分析。方法对124例耐多药结核分枝杆菌以及50株敏感株的耐药相关基因(包括异烟肼inh A、kat G、oxyR-ahp C间隔区以及利福平rpo B)进行序列测定,分析其基因突变情况。结果异烟肼耐药inh A基因突变率为14.5%;kat G基因突变率为70.2%(87/124),主要位于315位;oxyR-ahp C间隔区突变率为15.3%;inh A、kat G两种基因同时突变率75.0%,三种基因同时突变率为89.5%。利福平rpo B基因突变的检出率高达95.2%,突变主要发生在531、526、516位点。结论我省耐多药菌异烟肼耐药相关基因最常见突变为kat G 315、inh A C-T(-15)、axyR-ahp C间隔区(-10)C-T,利福平为rpo B531、526、516。结合MDR-TB耐药相关基因的特征分析,可以建立一种快速、准确、特异的适合于我省的检测结核菌耐多药性的新方法。     

基因芯片技术检测贵州省结核分枝杆菌耐药基因KatG和inhA

目的 了解本地区结核分枝杆菌(MTB)异烟肼(INH)相关耐药基因katG和inhA的突变特征,评价基因芯片法对MTB INH耐药性检测的临床应用价值。方法 应用基因芯片法对经PCR-荧光探针法鉴定为MTB阳性的2 738例病人标本进行INH耐药性检测,分析其相关耐药基因katG和inhA的突变特征,同时应用比例法检测上述同期送检的相同病人的同类型标本经罗氏培养MTB阳性菌株的INH耐药性,比较两种方法的检测结果。结果 2 738例MTB核酸阳性标本经基因芯片法检测,INH耐药465例,耐药率16.98%,其中以katG 315(AGC→ACC)突变为主,基因突变率为78.06%,其次为inhA -15(C→T),katG 315(AGC→AAC),突变率分别为16.13%和5.59%。上述病人同期送检的同类型标本有1 493例经罗氏培养MTB阳性,比例法检测,INH耐药255例,耐药率17.08%,对应的基因芯片法检测结果为INH耐药249例,耐药率16.68%。以比例法结果为判断标准,基因芯片法测定INH耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及准确性分别为85.49%、97.50%、87.55%、97.03%和95.45%。结论 本地区INH耐药以katG 315(AGC→ACC)和inhA -15(C→T)突变类型为主;基因芯片对MTB INH耐药性检测具有高敏感性、特异性、准确性和快速性,可用于本地区MTB INH耐药性的快速检测。     

结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药水平与其耐药基因突变的相关性研究

目的 探讨Mtb耐药相关基因katG、inhA、oxyR-ahpC突变与对INH的耐药水平及rpoB突变与对RFP的耐药水平的关系。 方法 采用微孔板Alamar blue显色法分别检测59株耐INH的Mtb临床分离株对INH和30株耐RFP菌株对RFP的最低抑菌浓度（the minimum inhibitory concentration,MIC）,同时用直接测序法检测对INH耐药菌株katG、inhA、oxyR-ahpC和对RFP耐药菌株rpoB的突变情况。 结果 INH MIC为0.2500~1.0000 μg/ml（低水平耐药菌株）和 MIC≥2.0000 μg/ml（高水平耐药菌株）的INH耐药株,inhA启动子突变率前者高于后者［53.8% (7/13),4.3% (2/46)］,katG 315突变率前者低于后者［15.4% (2/13),76.1% (35/46)］,χ²值分别为15.57和13.48,P值均为0.000。RFP MIC为0.5000～16.0000 μg/ml和MIC≥32 0000 μg/ml的RFP耐药株,rpoB 531和526位总突变率前者低于后者［62.5% (5/8),95.5%(21/22)］,P_确切概率＝0.048。 结论 INH耐药菌株inhA启动子突变与INH低水平耐药有关,katG 315突变与INH高水平耐药有关;rpoB 531和526位突变与RFP高水平耐药有关。     

Molecular characterization of rifampicin- and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Kazakhstan

Kazakhstan is one of the 14 countries with a high rate of morbidity due to multidrug-resistant tuberculosis (MDR TB) in WHO European region. The aim of our study was to characterize mutations associated with drug resistance to rifampicin and isoniazid in Mycobacterium tuberculosis isolates from Kazakhstan. M. tuberculosis strains were isolated from TB patients in different regions of Kazakhstan. A drug susceptibility test was performed on Lowenstein-Jensen medium using the absolute concentration method. Sequencing analysis was performed of the rpoB rifampicin resistance-determining region and the katG gene, the oxyR-ahpC intergenic region, and the inhA promoter region in 259 MDR M. tuberculosis isolates, in 51 isoniazid-resistant isolates, and in 13 rifampicin-resistant isolates. The mutational analysis revealed that the most frequent mutations associated with rifampicin and isoniazid resistance in M. tuberculosis are the substitutions at codons 531 (82.7%) and 315 (98.4%) in the rpoB and katG genes, respectively. In addition, we have found mutations with lower frequency at codon 526 (8.4%), 533 (1.5%), and 516 (1.1%) in the rpoB gene. In 6.2% of the isolates, no mutations were found in the rpoB gene. The findings of this study provide useful data for a better understanding of the mutation spectrum of isoniazid and rifampicin resistance among strains isolated from patients in Kazakhstan. Our results are also useful for the development of diagnostic tests of MDR M. tuberculosis.     

Study of resistance to anti-tuberculosis drugs in five districts of Equatorial Guinea: rates, risk factors, genotyping of gene mutations and molecular epidemiology.

SETTING: Five districts in Equatorial Guinea, March 1999 to February 2001. OBJECTIVES: To determine tuberculosis drug resistance among new and previously treated cases, the risk factors associated with resistance, and the mutations associated with isoniazid and rifampicin (katG, inhA and rpoB genes) resistance, and to genotype resistant strains. RESULTS: A positive culture identified as Mycobacterium tuberculosis complex was obtained in 240/499 patients. Susceptibility testing was performed in 236 strains. The overall resistance rate in new cases was 16.9% compared to 41.6% in previously treated cases. Isoniazid resistance was the most frequent (respectively 12.5% and 16.6%) in the two groups, while multidrug resistance was observed in 1.7% and 25% of new and previously treated cases, respectively. Female sex was statistically associated with resistance in new cases. Of 41 isoniazid-resistant strains, 33 (80.5%) had mutations in the inhA gene; none had mutations in the katG gene and eight had no mutations in either gene. All strains had low-level isoniazid resistance. Of eight strains resistant to rifampicin, six had mutations in the rpoB gene. Genotyping defined seven clusters. CONCLUSIONS: Moderate resistance was found in new cases. Low-level isoniazid resistance predominated among mutations in the inhA gene, with a high percentage of clustering in resistant strains.