紫外线对HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达的影响

目的 观察紫外线照射对人角质形成细胞系HaCaT细胞表达结合珠蛋白的影响。方法 用逆转录-聚合酶链反应法检测长波紫外线UVA、中波紫外线UVB照射后HaCaT细胞各时相结合珠蛋白mRNA表达水平。结果 UVA12J/cm²照射后HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达明显升高。照射后20min结合珠蛋白mRNA表达已开始升高,6h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后2h、4h、6h、24h、48h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)UVB30mJ/cm²照射HaCaT细胞后结合珠蛋白mRNA表达也出现时相变化:4h达第一高峰,48h出现第二高峰。照射后20min、2h、4h、6h、12h、48h、72h组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 紫外线UVA、311nmUVB上调HaCaT细胞结合珠蛋白mRNA表达,随照射时间,结合珠蛋白mRNA表达呈时相变化。     

UVA对成纤维细胞和HaCaT细胞形态及诱导型一氧化氮合成酶产生水平的影响

目的 比较5 J/cm2长波紫外线（UVA）照射对人皮肤成纤维细胞和HaCaT细胞形态、数目和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生的影响。方法 5 J/cm2 UVA分别照射人成纤维细胞和HaCaT细胞后24 h，48 h和72 h，倒置相差显微镜下观察细胞形态和数目变化，并用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和细胞免疫组化方法检测两种细胞iNOS mRNA和蛋白表达的情况。结果 人成纤维细胞在照射后3个时间点细胞均出现皱缩，24 h细胞数目即明显低于照射前（P < 0.05），iNOS mRNA和蛋白在照射后24 h有高峰表达；HaCaT细胞在3个时间点细胞形态未见明显改变，细胞数目在照射后48 h才明显低于照射前（P < 0.05），且iNOS mRNA和蛋白在照射后48 h有高峰表达。结论 5 J/cm2 UVA照射后人成纤维细胞比HaCaT细胞更易受到损伤，iNOS高峰表达出现更早，且持续时间更长。     

1320nm激光对成纤维细胞增殖和分泌碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子β1的影响

目的 探讨非剥脱性1320nm激光对体外培养的人真皮成纤维细胞增殖和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子(TGF-β1)的影响.方法 体外培养人真皮成纤维细胞,用1320nm波长激光15J/cm²,20J/cm²和24J/cm²三个能量分别照射3次.于照射后0、24、48和72 h ELISA法检测上清液bFGF和TGF-β1的分泌水平,并计算细胞总数.结果 20J/cm²以上能量激光照射后成纤维细胞计数增加,与未照射的对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).激光照射后bFGF分泌的量,在20J/cm²和24J/cm²能量组增加,尤以20J/cm²为著,24 h达高峰(P<0.01),与对照组比较,差异有统计学意义.TGF-β1分泌的量在照射的各能量组均下降,能量越高,下降越明显,24h达峰谷,与对照组比较,高能量组P<0.01,其他2个能量组P<0.05.结论 1320nm波长激光使成纤维细胞分裂增殖加速,并促进bFGF分泌,抑制TGF-β1分泌.     

长波紫外线照射对HaCaT细胞iNOS/NO表达的影响

目的 探讨不同剂量长波紫外线 （UVA） 照射HaCaT细胞后不同时间点诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）的表达情况。方法 1 J/cm2、5 J/cm2和10 J/cm2 UVA照射HaCaT细胞后继续培养24 h、48 h和72 h,倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化;分别用RT-PCR、Western印迹和Griess法检测HaCaT细胞iNOS mRNA、蛋白及NO的表达。结果 所有UVA剂量组HaCaT细胞iNOSmRNA在光照后24 h有表达,48 h达高峰,72 h后下降,各时间点间表达量差异有统计学意义（P < 0.05）;1 J/cm2 UVA照射后3个时间点均未见iNOS蛋白表达,而5 J/cm2和10 J/cm2 UVA照射后iNOS蛋白在24 h增加,48 h达高峰且显著高于24 h（P < 0.05）,照射后72 h无iNOS蛋白表达。所有UVA剂量组HaCaT细胞NO表达量在24 h升高,48 h显著升高,72 h平稳升高,3个时间点NO表达量均比正常对照组明显增加（P < 0.05）。对照组HaCaT细胞无iNOS mRNA和蛋白表达,NO表达量低。结论 HaCaT细胞iNOS和NO的表达变化与UVA照射存在时间和剂量关系。     

低剂量长波紫外线诱导培养的人皮肤黑素细胞适应性反应观察

目的 探讨低剂量长波紫外线(UVA)诱导培养人皮肤黑素细胞适应性反应的程度及特点。方法 以具有致死作用的86.4J/cm²UVA照射经7.2J/cm²低剂量UVA单次或多次预照射的培养人皮肤黑素细胞.光镜、电镜观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的比例,单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的程度。结果 单次或多次7.2J/cm²UVA预照射处理后的培养皮肤黑素细胞使随后86.4J/cm²UVA照射诱导的形态学上的毒性反应减轻,细胞凋亡的比例下降,DNA链断裂减少及修复加快,与未经预处理86.4J/cm²UVA照射的相应细胞比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);单次7.2J/cm²UVA预照射诱导培养皮肤黑素细胞的适应性反应在预照射12h后消失,而当低剂量UVA预照射的累积剂量达到28.8J/cm²以上时,预照射的培养细胞即使是14d后对86.4J/cm²UVA照射仍有明显的防护作用。结论 低剂量UVA照射可诱导培养的皮肤黑素细胞出现对随后高剂量UVA照射的适应性反应,其效应滞留期及强度与低剂量UVA的累积剂量有关。     

长波紫外线照射和基因甲基化状态对HaCaT细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的:研究长波紫外线(UVA)照射和基因甲基化状态改变对HaCaT细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法:5 J/cm<'2>UVA照射HaCaT细胞后24 h、48 h和72 h及1μmol/L 5-氮杂胞苷(5-azaC)处理HaCaT细胞24 h、72 h和120 h后,采用反转录(RT)-PCR、Western blot方法和巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction,N-PCR)分别检测iNOS mRNA、蛋白和cDNA的表达情况.结果:HaCaT细胞正常对照组无iNOS mRNA、蛋白和cDNA的表达;5 J/cm<'2> UVA照射后,HaCaT细胞的iNOS mRNA、蛋白和cDNA表达在24 h时出现,48 h达高峰,且明显高于24 h(P<0.05),72 h无表达:5-azaC处理HacaT细胞24 h后,仅有iNOS cDNA表达,72 h和120 h有iNOS mRNA、蛋白和cDNA表达,且120 h表达量强于72 h(P<0.05).结论:HaCaT细胞iNOS表达与UVA照射存在一定的时间关系,iNOS基因甲基化状态的改变可以影响其表达.     

芦荟甙对中波紫外线辐射HaCaT细胞表达诱导型一氧化氮合酶及核因子κB的影响

目的 探讨芦荟甙对中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞诱导核因子kB(NF-KB)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的抑制作用。方法 采用MTT法测定HaCaT细胞的增殖变化,生化比色法检测培养细胞上清液中NO含量,RT-PCR法检测HaCaT细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达变化,免疫荧光细胞化学染色测定NF-kB P65的激活表达。结果 30 mJ/cm² UVB辐射HaCaT细胞,细胞的增殖明显下降,NO的合成分泌增加,iNOS mRNA表达显著增加,同时NF-kB被激活,从细胞浆易位到细胞核。芦荟甙对HaCaT细胞的增殖有显著促进作用。用不同浓度芦荟甙预处理HaCaT细胞,可以显著抑制UVB辐射诱导的NF-kB激活,下调iNOS mRNA表达及NO合成分泌。经统计学分析,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 芦荟甙通过抑制UVB辐射诱导的NF-kB P65激活,下调iNOS mRNA表达,减少NO合成分泌,发挥防护紫外线辐射损伤的作用,在炎症性皮肤病防治中可能发挥重要作用。     

苯甲酸雌二醇及UVA辐照对体外培养的人皮肤成纤维细胞胶原合成的影响

目的探讨苯甲酸雌二醇对体外培养的人成纤维细胞增殖、胶原合成及其对UVA抑制胶原合成的影响。方法在培养的人成纤维细胞中分别加入不同剂量的苯甲酸雌二醇,继续培养48h,用MTT法测定细胞的增殖情况,同时应用RT-PCR方法检测经不同剂量苯甲酸雌二醇及10J/cm²UVA处理后人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达情况。结果MTT法检测结果显示,苯甲酸雌二醇对体外培养的成纤维细胞增殖无明显促进作用。RT-PCR结果提示,苯甲酸雌二醇处理组两型前胶原的表达水平明显上调(P<0.05),而UVA照射后两型前胶原的表达显著下降,苯甲酸雌二醇可在一定水平对抗其作用(P<0.05)。结论苯甲酸雌二醇对体外培养的成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原的合成有一定的促进作用,并可对抗紫外线抑制胶原合成的作用。     

核因子-κB反义寡核苷酸抑制紫外线诱导的HaCaT细胞反义分泌白介素6

目的 探讨核因子-κB(NF-κB)反义寡核苷酸转染体外培养的HaCaT细胞反义株HaCaT后,对紫外线(UV)诱导的HaCaT细胞反义分泌炎症因子白介素6(IL-6)的抑制作用。方法 蛋白质印迹方法测定不同剂量中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞反义后NF-κBp65的变化;逆转录-聚合酶链反应测定NF-κBp65反义寡核苷酸转染后p65m RNA表达的变化;酶联免疫吸附测定法测定NF-κBp65反义寡核苷酸转染后紫外线辐射的HaCaT细胞反义分泌IL-6水平。结果 10、20、30mJ/cm² UVB辐照HaCaT细胞反义后均可显著促进NF-κBp65表达(P<0.05),不同浓度的NF-κBp65反义寡核苷酸转染后对30mJ/cm² UVB诱导的p65mRNA表达和IL-6分泌均有显著抑制作用(P<0.05)。结论 脂质体介导的NF-κBp65反义寡核苷酸转染HaCaT细胞反义,可以抑制UV辐射诱导的HaCaT细胞反义产生IL-6,表明UV诱导HaCaT细胞反义产生IL-6可能是通过UV激活NF-κBp65的表达产生的。     

黄芩甙对中波紫外线照射HaCaT细胞后光产物的影响

目的 探讨黄芩甙对UVB照射后HaCaT细胞光产物环丁烷嘧啶二聚体(CPD)的产生和清除的影响.方法 以一定剂量UVB照射HaCaT细胞,在照光后不同时间点采用免疫组织化学法检测CPD的产生和清除;以黄芩甙预先孵育HaCaT细胞,再观察黄芩甙对CPD的影响.结果 HaCaT细胞损伤程度随UVB照射剂量增大而加重.30mJ/cm²UVB照射后HaCaT光产物CPD的产生在0.5h左右达到高峰,同时细胞开始清除CPD,照射后4h内清除速率较快,至24h时基本清除CPD.黄芩甙预处理组UVB照射后细胞的CPD产生少于非加药组(U=2.324,P<0.05).结论 UVB照射对HaCaT细胞光损伤程度呈剂量递增性,HaCaT细胞对CPD的清除存在快速清除期及慢速清除期;黄芩甙可减少光产物生成.     

白藜芦醇对UVA照射人角质形成细胞株的保护作用及机制探讨

目的 研究白藜芦醇对UVA照射后人角质形成细胞的保护作用及其机制。方法 5 J/cm2 UVA照射人角质形成细胞株HaCaT细胞后,立即予以0.01、0.1 mmol/L白藜芦醇干预,噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性,半定量RT-PCR和Western印迹方法检测细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA和蛋白的表达,电镜观察细胞形态学方面的改变。结果 UVA照射组HaCaT细胞的增殖活性（A490为0.542 ± 0.004）较未照射对照组（A490为0.889 ± 0.083）明显下降,iNOS mRNA和蛋白的表达水平（1.532 ± 0.041和1.331 ± 0.046）较未照射对照组显著增加,电镜下可见典型的凋亡细胞。HaCaT细胞经UVA照射加0.01、0.1 mmol/L白藜芦醇处理后,细胞的增殖活性升高,A490为分别为0.753 ± 0.435和0.892 ± 0.173,iNOS mRNA和蛋白的表达水平分别为0.853 ± 0.038/0.809 ± 0.018和0.392 ± 0.033/0.412 ± 0.026,与单独UVA照射组相比,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而且0.1 mmol/L白藜芦醇组作用效果更明显。另外,电镜观察UVA + 白藜芦醇组未见凋亡细胞及明显的细胞坏死征象。结论 白藜芦醇对UVA照射损伤的HaCaT细胞有保护作用,其机制可能与白藜芦醇抑制UVA诱导的iNOS表达有关。     

The effect of amniotic membrane extract on the expression of iNOS mRNA and generation of NO in HaCaT cell by ultraviolet B irradiation

BACKGROUND/PURPOSE: Amniotic membrane (AM) is the innermost fetal membrane, which contains several proteinase inhibitors and expresses several growth factors. Nitric oxide (NO) has been implicated in the pathogenesis of various inflammatory diseases including sunburn and ultraviolet induced erythema. The expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) is up regulated by UVB irradiation and inhibited by TGF-beta and EGF-beta. We evaluated the effect of AM extract on the expression of iNOS mRNA by UV irradiation in HaCaT cell (immortalized human keratinocyte cell line). METHODS: HaCaT cells were irradiated UVB 30 mJ/cm2 and AM extract was added. The iNOS mRNA was isolated by RT-PCR and NO production was assessed by spectrophotometric method based on Griess reaction. RESULTS: The expression of iNOS mRNA was induced by UVB irradiation in HaCaT cell and the expression of iNOS mRNA was higher at 48 h than that at 24 h. AM extract down regulated the induction of iNOS mRNA in HaCaT cell by UVB irradiation. NO generation was increased by UVB irradiation, but down regulated by AM extract treatment in HaCaT cells. CONCLUSION: These results assured that the expression of iNOS mRNA and generation of NO are up regulated by UVB irradiation and showed that AM extract down regulated the induction of iNOS mRNA and decreased generation of NO by UVB irradiation.     

中波紫外线激活HaCaT细胞炎症信号通路的实验研究

目的 探讨中波紫外线(UVB)对角质形成细胞(KC)炎症信号通路的影响.方法 UVB(40 mJ/cm²)照射永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞,分别于照射后0、10、30、60、120、240min收集细胞蛋白和核蛋白,蛋白质印迹法检测NF-κB信号传导通路中的重要分子-磷酸化IκB-α(P-IκB-α)、IκB-α和NF-κB p65蛋白的动态变化,以及MAPK家族的蛋白分子ERK1/2、p38、c-JNK等磷酸化激活的动态变化.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,UVB照射后0.5h IκB-α开始发生磷酸化和降解,在第2、4小时时更加明显;细胞核蛋白p65的量在照射后0.5h开始升高,在随后的2h时达到高峰.UVB照射后10 min HaCaT细胞内的ERK1/2、p38、c-JNK蛋白的磷酸化就开始增加.结论 UVB照射KC可激活细胞内的NF-κB及MAPK信号传导通路.     

UVA辐射对HaCaT细胞分泌和表达趋化因子CXCL11/I-TAC的影响

目的 探讨UVA对IFN-γ和TNF-α诱导的HaCaT细胞分泌和表达CXCL11/I-TAC的影响。方法 用ELISA检测不同剂量UVA（2、4、8 J/cm2）照射后培养24 h的HaCaT细胞上清中CXCL11/I-TAC分泌水平。用实时荧光定量PCR检测CXCL11/I-TAC mRNA表达水平。结果 正常培养的HaCaT细胞仅分泌和表达微量的CXCL11/I-TAC蛋白或mRNA。当用10 μg/L的IFN-γ和TNF-α联合刺激后,HaCaT细胞分泌或表达的CXCL11/ I-TAC显著升高。UVA在2、4、8 J/cm2呈剂量依赖性抑制CXCL11/I-TAC的分泌或表达。结论 UVA照射抑制角质形成细胞分泌和表达CXCL11/I-TAC,从而在一定程度上降低了对Th1/Tc1细胞的趋化。     

Gene expression profiles of TNF-alpha, TACE, furin, IL-1beta and matrilysin in UVA- and UVB-irradiated HaCat cells

BACKGROUND/PURPOSE: It is known that solar ultraviolet (UV) irradiation exerts multiple effects on mammalian skin tissues, one of which is the induction of local and systemic immunosuppression as well as inflammation. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) and other cytokines are suggested to play a role in these responses. Quantitative real-time polymerase chain reaction (TaqMan RTPCR) was used to elucidate the effect of UVA and UVB irradiation on the expression of genes coding for TNF-alpha, IL-1beta, IL-10, FasL, matrilysin, TACE and furin in HaCaT cells over a 48 h period (IL-1beta, interleukin-1beta; FasL, Fas ligand). METHODS: Cultured HaCaT cells were either sham irradiated (control) or exposed to UVA (2000 and 8000 J/m2) or UVB (200 and 2000 J/m2) radiation. RNA was extracted from cells at 0, 4, 8, 12, 16, 24, 48 h post-irradiation and reverse transcribed to generate cDNA for subsequent real-time PCR amplification. RESULTS: Significant increases in the mRNA levels for all genes tested were detected in both UVA- and UVB-irradiated HaCaT cells compared with control (sham-irradiated) cells. TNF-alpha mRNA levels were immediately up-regulated (0 h) after irradiation, with maximal induction at 8 h post 2000 J/m2 UVA and 200 J/m2 UVB irradiation, at 4 h post 8000 J UVA irradiation and at 48 h post 2000 J/m2 UVB irradiation. No correlation was observed between TNF-alpha, TACE and furin mRNA induction in the different irradiated cohorts. CONCLUSION: Results suggest that time-distinct gene induction of TNF-alpha, furin, IL-1beta and matrilysin may be involved in UV-induced cellular responses, but not for TACE. In general, mRNA induction was dose dependent at some time points post-irradiation, but not throughout the whole time course tested. Our results show that quantitative real-time PCR is a useful tool in the analysis of quantitative changes of mRNA levels in cultured HaCaT cells after UV exposure.