乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变及其临床意义

目的探讨利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)前C区/BCP区基因突变方法的临床价值及前C区/BCP区基因突变的临床意义。方法应用基因芯片技术检测95例慢性乙型肝炎患者的HBV前C区G1896A(nt1896G→A)、A1814C(nt1814A→C)及HBV C基因启动子(BCP)T1762A、G1764A(nt1762A→T、nt1764G→A)四位点突变,同时检测血清HBV DNA含量及ALT、AST水平。结果95份血清标本中,有91份分别检测到了HBV前C区/BCP区基因突变,阳性率95.8%,其中61896A突变33例(36.3%),A1762T G1764A联合突变64例(70.3%),G1896A A1762T G1764A联合突变22例(24.2%),未检测到A1814C突变毒株。抗-HBe阳性的慢性乙肝患者HBV前C区/BCP区突变率较HBeAg阳性的患者明显增高。G1896A突变后血清ALT水平与未变异组比较有显著性差异(P<0.05),而其他各组的肝功能无显著变化。G1896A A1762T G1764A联合突变后,血清HBV DNA水平较未变异组降低(P<0.05),其他各组间则无显著变化。结论应用基因芯片法测定HBV特定变异位点,可一次同时检测多个突变位点,具有一定的临床应用价值。HBV前C区/BCP区突变对血清HBVDNA水平和肝功能有一定的影响。     

慢性乙型肝炎C基因启动子1762/1764双位点和前C区1896位点变异的检测

目的了解慢性乙型肝炎病毒C基因启动子1762/1764双位点变异和前C区1896位点变异的情况以及对血清学的影响,并观察出现1762/1764双位点变异后拉米夫定治疗疗效.方法采用微板核酸杂交-ELISA方法和PCR法检测162例慢性乙型肝炎C区基因启动子1762/1764双位点变异和前C区1896位点变异,35例慢性乙型肝炎患者服用拉米夫定抗病毒治疗,观察肝功能、HBV复制指标、病毒变异等变化.结果慢性轻型乙肝,慢性中、重型乙肝和肝硬化3组1762/1764双位点变异率分别为14.9%,40.7%和39.0%,1896位点变异率分别为11.9%,40.7%和65.9%;HBeAg＋和HBeAg-2组1762/1764变异率分别为31.1%和28.4%,1896变异率分别为5.4%和60.2%;10例出现1762/1764双位点变异的患者接受拉米夫定治疗12月末,2例复发,并检测出变异株和YMDD变异,其中1例发展为重型肝炎并死亡;24月末,4例复发,并检测出变异株.结论HBV CP1762/1764变异与病情轻重有一定关系,不能完全中止HBeAg的复制,不同于前C区1896位点对血清学的影响;拉米夫定治疗可以抑制变异株,但随着疗程的延长,变异株又会重新出现.     

乙肝病毒核心启动子区和前C区突变与肝细胞自噬的关系

目的：探讨乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）核心启动子区和前C区突变与肝细胞自噬的关系。方法构建前C区和C启动子区突变的1.3mer HBV质粒G1613A、A 1762T/G1764A、,G1896A;HepG2细胞分别转染GFP-LC3质粒和突变的HBV质粒。免疫荧光染色法检测HBV感染的细胞LC3荧光颗粒表达水平,免疫印迹法分析内源性LC3表达水平,实时定量PCR检测转染后细胞内自噬相关基因Atg5、Atg7和Beclin-1 mRNA的转录水平。结果免疫荧光显示,转染HBV G1613A、A 1762T/G1764A、G1896A质粒的细胞LC3荧光颗粒表达水平分别为（12.5±0.2）%、（11.7±0.2）%、（8.5±0.2）%,低于转染野生型HBV质粒的细胞[（14.5±0.2）%],差异有统计学意义（P﹤0.05）。实时定量PCR显示,自噬相关基因Atg5 mRNA在转染HBV G1613A、A 1762T/G1764A、G1896A质粒的细胞中的转录水平均明显低于野生型HBV （P﹤0.01）,Atg7和Beclin-1在转染G1896A HBV质粒细胞中的基因转录水平低于野生型HBV转染的细胞,且Beclin-1的降低具有统计学意义（P<0.05）。结论 HBV前C区和C启动子区G1613A、A 1762T/G1764A、G1896A突变能够降低HBV感染的肝细胞自噬。     

肝脏疾病进展与乙型肝炎病毒前 C／C 区突变

目的：研究慢性乙型肝炎患者前C/C区突变位点与肝脏疾病进展的临床意义。方法应用实时荧光定量PCR及直接测序法检测HBeAg阴性慢性乙型肝炎30例、HBeAg阳性慢性乙型肝炎20例,分析前C/C区变异位点与患者病情进展的相关性。结果肝硬化组前C/C区变异位点T1762/A1764、A1896发生率（86.3％,54.5％）明显高于慢性肝炎组（32.1％,35.7％）,差异均有统计学意义（ P ＜0.05）。慢性肝炎组与肝硬化组HBV载量差异无统计学意义（ P ＞0.05）;HBeAg阴性患者T1762/A1764,T1766/A1768,A1896变异位点发生率较HBeAg阳性患者显著增高（ P ＜0.05）。结论 T1762/A1764,A1896突变率的增加会促使肝脏疾病进展至肝硬化;HBeAg阴患者T1762/A1764,T1766/A1768,A1896变异位点的频率增加会促进肝脏疾病的进展。     

慢性HBV感染患者bcp/pc区点突变模式、pres区缺失及其临床意义

目的阐明HBV(hepatitis B virus,HBV)感染患者不同临床阶段bcp/pc(basic core promoter,BCP/precore,PC)点突变模式及pres区缺失突变规律,并探讨其临床意义。方法慢性HBV感染患者180例,其中,无症状HBV携带者13例,慢性乙型肝炎者75例,HBV相关肝硬化及肝癌分别为62、30例。Qiagen法提取血清HBV-DNA,常规PCR扩增目的基因,纯化PCR产物ABI377DNA自动测序仪直接双向测序。直接测序失败者,回收目的 DNA与PMD-18T载体连接,克隆质粒双向测序。DNAStar软件包的SeqMan软件进行生物信息分析。结果 Bcp/pc区点突变包括nt1753、nt1762、nt1764、nt1776、nt1803、nt1846、nt1896。HBV携带者、慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及肝癌患者nt 1762(nt 1764)点突变率分别为7.7%、68.0%、72.7%(68.0%)及90.9%(81.8%),肝癌患者G1896A突变频率占54.6%。A1762T+G1764A联合突变占36%;A1762T、G1764A、G1896A联合突变占11%;T1753A/C、A1762T、G1764A、G1896A发生率为7%。克隆测序显示,肝硬化及肝癌患者bcp区起始点A1727G点突变率分别为72%、63%。HBeAg阴性患者存在更多的基因变异(P=0.022),G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素(P<0.05)。Bcp区点突变与HBeAg阴性无明显关系。肝硬化和肝癌患者pres基因缺失突变频率最高,肝癌及肝硬化患者pres1、pres2及pres1+s2缺失频率分别为7.1%、71.4%、7.1%及41.2%、58.8%、29.4%(P<0.05)。结论 A1727G、A1762T、G1764A及A1762T/G1764A联合突变、pres缺失在HBV相关肝硬化及肝癌患者多见,可能是肝脏疾病进展的危险因素,G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素。Bcp/pc点突变及pres区缺失可能为肝癌发生的早期预测因素,值得进一步研究。     

乙型肝炎病毒X区T^1762－A^1764和前C区A^1896变异对干扰素治疗的影响

目的：研究乙型肝炎病毒(HBV)基因组X区和前C区热点变异对干扰素(IFN)治疗的影响。方法：采用半套式聚合酶链反应(HN-PCR．)结合限制性片段长度多形态(RFLP)技术检测20例慢性乙型肝炎患者IFN治疗前病毒核苷酸序列的突变。结果：A^1896变异株不影响治疗结束时应答率，6／8例T^1762-A^1764变异株感染者为应答者。停药后12mo时，l例T^1762-A^1764变异株感染者由无应答者变为应答者：在复发者中，既有T^1762-A^1764变异株感染者，又有A^1896变异株感染者，或两者同时存在。结论：T^1762-A^1764变异者近期疗效好，而A^1896变异者不影响近期疗效；T^1762-A^1764变异者远期疗效还有待进一步观察。     

HBV多基因位点变异与肝细胞癌相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒前C区和C基因启动子基因变异与肝细胞癌发生的关系。方法采用实时荧光PCR检测29例慢性乙型肝炎（CHB）,27例乙型肝炎肝硬化（LC）,26例HBV相关肝细胞癌（HCC）患者血清HBV前C区G1896A和BCP区A1762T／G1764A的变异情况。结果HCC组和LC组前c区G1896A和BCP区A1762T／G1764A变异率均显著高于CHB组（P≤0．005）,HCC组和LC组间无显著差异（P〉0．05）。结论乙型肝炎病毒C基因启动子和前c区基因变异与肝细胞癌、肝硬化的发生密切相关。     

乙型肝炎病毒特定变异位点的结果分析

目的检测HBV基因多态性,从而有助于抗病毒药物的选择及疾病预后的判断。方法通过基因芯片技术,将HBV DNA进行PCR扩增,然后进行扩增产物尽杂交,芯片显色,结果分析。结果包括前C区1896位、BCP区1762/1764位、P区528/552位的突变普遍存在。①160例标本中,在HBeAg( )组中G1896A突变为7例(14.3%),在HBeAg(-)组中G1896A突变为56例(46.3%);②160例标本中,慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化、乙肝肝癌组中A1762T/G1764A的突变率为36.7%(40/109)、51.4%(19/37)、91.7%(11/12);③30例用拉米呋定抗HBV治疗的慢性乙型肝炎患者中,治疗前用基因芯片法检测都为野生株,经治疗后血清HBV DNA滴度下降而转阴,但随着治疗时间延长出现血清HBV DNA反跳8例,其中552位突变1例,528位突变7例。结论基因芯片法结果准确高效,具有推广价值;HBV DNA位点的变异对于疾病的进展、预后、临床用药有重要作用。     

乙型肝炎病毒基本核心启动子和前C基因序列分析

目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子(BCP)区及前C(Pre C)区基因的变异情况,并且分析其发生频率、分布规律及其与临床病情的关系.方法 应用套式PCR扩增nt1660-1935的HBV DNA片段及PCR产物直接测序的方法检测BCP区及Pre-C区基因的变异情况.结果 130例乙型肝炎患者标本中,BCP区nt1762/nt1764发生双突变者75例(57.69%),Pre-C区nt1896发生突变者20例(15.38%),并且这两种突变在重型肝炎组(75.00%)及肝硬化组(72.22%)所占比例均明显高于慢性肝炎组(52.56%);此外,在BCP区及Pre-C/C区还发现了一些突变频率较高的其他突变位点(如nt1753,nt1766,nt1846,nt1899,nt1915),其中nt1753突变仅发生于有nt1762/1764双突变的患者,与重型肝炎及肝硬化的发生有一定关系;在BCP区有4处核苷酸突变共存者10例,其中重型肝炎组(12.50%)及肝硬化组(13.88%)所占比例明显高于慢性肝炎组(5.12%).结论 HBV BCP区nt1762/nt1764双突变和Pre-C区nt1896突变与肝炎的活动、重型化及肝硬化的发生有关;BCP区其他位点的突变共存对肝炎病情的进展也有重要影响.     

BCP区和前C区突变检测在慢加急性肝衰竭中的临床价值

目的 探讨检测乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）相关慢加急性肝衰竭（acute–on–chronic liver failure,ACLF）患者基本核心启动子区（basic core promoter,BCP）A1762T/G1764A和前C区G1896A突变的临床价值。方法 选取2010年9月至2020年10月中国科学院大学宁波华美医院收治的403例慢性HBV感染患者,根据患者是否发生ACLF将其分为慢性乙型肝炎（chronic hepititis B,CHB）组（369例）和ACLF组（34例）,并根据预后将ACLF组患者再分为缓解组和恶化组。采用多因素Logistic回归分析筛选发生ACLF的独立影响因素,并构建联合预测模型。绘制受试者操作特征曲线以评价该模型的诊断价值。结果 ACLF组患者的年龄、总胆红素（total bilirubin,TBiL）、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、甲胎蛋白、凝血酶原时间均显著高于CHB组（P<0.05）,乙型肝炎e抗原阳性率、白蛋白（albumin,ALB）均显著低于CHB组（P<0.05）。ACLF组和CHB组患者A1762T/G1764A突变率比较差异无统计学意义（P>0.05）,ACLF组患者G1896A突变率显著高于CHB患者（P<0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示,年龄、TBiL、ALB、G1896A突变均是发生ACLF的独立影响因素（P<0.05）。以上4项指标联合诊断ACLF的曲线下面积为0.950,敏感度和特异性分别为88.24%和93.22%;缓解组和恶化组患者的A1762T/G1764A、G1896A突变率比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 HBV相关ACLF患者的前C区G1896A突变率显著增高是ACLF发病的独立危险因素,而BCP区A1762T/G1764A突变与ACLF发病的关系可能并不紧密。     

酒精对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变影响研究

目的：探讨酒精对HBV DNA多位点基因变异的影响,为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法:选取45例慢性乙肝患者为研究对象,分为嗜酒组和非嗜酒组,采用DNA芯片技术, 检测HBV DNA前C区1896及1814位点、BCP区1762及1764位点、P区528及552位点的基因变异。结果:嗜酒组在BCP区1762 、1764位点的变异率明显高于非嗜酒组(P均＜0.05)。在前C区1896、1814位点,P区528、552位点变异率差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论:酒精可导致乙肝病毒BCP区1762 、1764位点发生基因突变,BCP区基因变异可促进HBV在人体内的复制表达,加重慢性乙型肝炎患者的病情。     

乙型肝炎病毒核心基因启动子变异对HBeAg表达及病情的影响

目的:研究乙型肝炎病毒核心基因启动子(HBVBCP)变异对HBeAg表达及病情的影响。方法:采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对176例HBV慢性感染者血清进行检测HBVBCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764G→A联合突变。采用ELISA检测技术,检测患者血清HBV标志物。结果:在176例HBV慢性感染者中检出HBVBCP区T1762A1764G变异者73例,HBVBCP变异的阳性率为41.5%,HBVBCP变异在HBeAg阴性病例的阳性率为49.4%,显著高于HBeAg阳性病例的阳性率33.3%。HBVBCP双变异在慢性乙型肝炎轻、中、重度组,肝炎肝硬化组,慢性重症肝炎组和原发性肝癌组的阳性率分别为28.0%、31.4%、34.2%、39.4%、60.0%和70.0%。各型肝病与HBVBCP变异的阳性或阴性进行相关分析,结果有显著性差异。结论:本组病例HBVBCP变异的阳性率为41.5%,变异可引起HBV感染者的HBeAg阴转。HBVBCP变异与HBV慢性感染的临床类型呈正相关,随着病情加重,BCP变异的阳性率有增高趋势。     

乙型肝炎病毒基本核心启动子T1762A1764 联合突变的临床意义

目的:研究乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子(BCP)T^1762A^1764联合突变情况及其临床意义。方法:采用聚合酶链反应(PCR)与限制性长度片段多态性分析(RFLP)相结合，检测130例乙型肝炎患者BCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764碱基G→A联合突变。结果：HBeAg( )和HBeAb( )两组患者中BCP T^1762A^1764联合突变率的不同频率分别为慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B，CHB)40．0％和85．7％，无症状携带者(Asymptomatic carrier，ASC)22．2％和65．0％，献血员为5％。BCP T^1762A^1764双点联合突变组HBV-DNA≥10^5 cps／ml检出例数81例(96．4％)，非突变组HBV-DNA≥10^5 cps／ml检出例数25例(54．3％)。结论：BCP T^1762A^1764联合突变与乙型肝炎的发生、发展以及预后有关，可能是CHB与ASC患者HBeAg(-)的原因之一，可促进乙肝病毒繁殖。对慢性乙型肝炎患者检测HBV BCP T^1762A^1764联合突变有一定的临床意义。     

Distribution of hepatitis B virus genotype and cancer predicting precore and basal core promoter mutations

Background

Chronic hepatitis B (CHB) infection which is associated with an increased risk of developing liver disease including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Viral factors that may increase the risk for HCC development include HBV DNA level, genotypes, and naturally occurring mutations such as hepatitis B virus precore (PC) (G1896A) and basal core promoter (BCP) A1762T/G1764A double mutations. HBV genotypes and subgenotypes can significantly influence HBeAg seroconversion rates, viremia levels, mutational patterns that could significantly influence the heterogeneity in clinical manifestations and even response to antiviral therapy.

Method

94 CHB infected individuals with detectable serum HBV DNA levels were studied. HBsAg, HBeAg, anti-HBc IgM antibody estimations were done by ELISA. HBV DNA estimation was done. The HBV genotypes were determined by TSP-PCR and 10 samples randomly selected for DNA sequencing. PC and BCP mutations were determined by DNA sequence analysis of core region.

Result

Of 94 study participant samples with detectable serum HBV DNA levels, 75 were successfully genotyped and sequenced for BCP/PC region. 30/75 (40%) harbored PC and BCP mutations. The total Double mutations of BCP at A1762T/G1764A nucleotide positions, and PC mutation at G1896A nucleotide position were seen in 29.3% and 21.3%, respectively. All 75 isolates were subtype D using TSP-PCR. However, by sequencing 2/10 were subtype A, while 8 were subtype D.

Conclusion

Our study reinforces that D is the predominant genotype in Indian population. It reveals that Indian CHB subjects have increased prevalence of BCP & PC mutations, which possibly may lead to development of HCC.     

治疗基线乙型肝炎病毒BCP区和PC区变异对拉米夫定耐药预测的探讨

目的探讨慢性乙型肝炎患者治疗基线乙型肝炎病毒(HBV)BCP区和PC区基因变异对拉米夫定耐药的影响。方法收集接受拉米夫定(100mg/片)初治2年内耐药的26例(耐药组)和2年内无耐药的16例(对照组)慢性乙型肝炎患者治疗基线的血清标本,采用型特异性多引物对巢式PCR法检测HBV基因型,用PCR产物直接测序技术检测治疗基线HBV的BCP区、PC区和P区变异位点,对发生频率较高的两组位点变异进行统计学分析。结果两组病人无1例发生P区rt204/180变异;在HBV BCP/PC区突变中,耐药组与对照组在点突变A1762T(38.48%vs 68.75%,P>0.05)、G1764A(26.92%vs50.00%,P>0.05)和G1896A(19.23%vs 18.75%,P>0.05)差异无统计学意义;对照组在点突变C1799G(43.75%vs 0,P<0.05)、T1802C(18.75%vs 0,P<0.05)、G1838A(25.00%vs 0,P<0.05)、A1846C(37.50%vs 0,P<0.05)、C1856T(31.25%vs 0,P<0.05)、G1888A(25.00%vs 0,P<0.05)明显高于耐药组。结论治疗基线HBV BCP区的A1762T/G1764A变异和PC区的G1896A变异对拉米夫定的2年疗效影响不大;治疗基线HBV BCP区的C1799G、T1802C、G1838A、A1846C的变异和PC区的C1856T、G1888A的变异可能是接受拉米夫定初始治疗获得长期维持应答的预测因素之一。     

HBV BCP区1762/1764和1896突变位点检测新技术研究

目的：利用错配扩增和荧光PCR原理,建立一种针对HBV BCP区1762/1764和前C区1896突变位点的新型检测方法---错配扩增突变分析PCR法（MAMA-PCR）,并对该方法进行临床评价。方法：a）MAMA-PCR突变检测方法性能评估：以野生和突变性阳性参考品作为模板检测3次,分析该方法稳定性;将突变型和野生型质控品梯度比例混合,分析该方法检测混合感染的检测效率。b）测序法、商品化试剂盒与本方法同时检测样本并对MAMA-PCR方法做出评价。结果：MAMA-PCR 3次检测重复性良好,CV值均小于5%,且可稳定检出含1%突变含量的混合样本。132例HBV样本中,1762/1764双突变位点测序法检出67例,ARMS-PCR试剂盒检出69例,MAMA-PCR检出69例,突变检出率分别为50.8%、52.3%和52.3%;1896突变测序法检出39例,ARMS-PCR试剂盒检出41例,MAMA-PCR检出42例,突变检出率分别为29.5%、31.1%和31.8%。结论：MAMA-PCR 检测方法性能稳定,突变检出率高于测序法,与商用试剂盒基本一致,可用于临床乙肝患者 BCP区1762/1764双突变和前C区1896突变位点的快速检测。     

乙型肝炎病毒家族聚集性感染者基因型分布及基础核心启动子和C区变异的研究

目的 探讨家族聚集性乙肝感染者HBV基因型和基础核心启动子（BCP）、前C/C区变异的特征,及其临床意义。方法 选择家族聚集性慢性乙型肝炎（CHB）98例（来自38个家族）作研究组和非家族聚集性CHB 110例作对照组;应用型特异性引物巢式PCR法检测HBV感染者的HBV基因型,PCR测定BCP、前C/C区核苷酸序列,并且检测患者血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBIL）、白蛋白（ALB）、乙型肝炎两对半和HBV-DNA载量等临床指标。结果 家族性乙肝母亲和（或）父亲与子女感染组以C基因型为主（52.9%）,家族水平成员感染组和对照组以B基因型为主（分别为73.3%、67.3%）,仅检测到少数B/C和B/D混合型（共8.7%）,并且乙肝家族中母亲和（或）父亲与子女感染组C基因型所占百分比高于家族水平成员感染组及非乙肝家族（P＜0.05）。家族内HBV聚集感染的基因型基本相同,不一致者为混合型。HBV C基因型的家族CHB患者比非乙肝家族具有更高的HBV-DNA载量,更高的BCP区A1762T/G1764A双突变率（P＜0.05）。结论 家族聚集性CHB患者HBV基因型可能与传播途径有关,C基因型更易发生垂直传播。家族聚集性HBV C基因型感染的患者更易发生BCP区A1762T/G1764A双突变,HBV C基因型感染并且BCP区A1762T/G1764A双突变可能是家族聚集感染者病情进展的危险因素。