雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1)的cDNA全长克隆及表达分析

目的:克隆得到雷公藤一型4α-甲基氧化酶(Tw SMO1)(Gen Bank KX987126)全长基因,并对其进行序列分析及初步的功能验证。方法:根据雷公藤转录组数据,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1),并利用相关软件对所得核酸序列及其所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞,用实时荧光定量(RT-PCR)的方法分析诱导不同时间点后雷公藤悬浮细胞中的TwSMO1基因的相对表达量。结果:克隆所得的TwSMO1基因cDNA全长1505 bp,开放阅读框900 bp,编码299个氨基酸,在线预测其所编码蛋白分子量为34.55 k Da,理论等电点为6.89。多重序列比对结果显示其与其他物种的SMO1氨基酸序列有较高同源性,且包含SMO1基因家族的3个保守域,系统进化树将其归为4α-甲基氧化酶第一家族基因,遂将其命名为TwSMO1。RT-PCR结果表明MeJA诱导后TwSMO1基因在1 h后表达量达到最高,约是对照组的450倍。结论:本研究首次克隆得到雷公藤TwSMO1基因,并对其进行生物信息学分析及MeJA诱导表达分析,为深入研究此基因功能及阐述雷公藤甾醇生物合成途径奠定基础。     

雷公藤TwCYP88A1基因全长cDNA克隆与表达分析

目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆Tw CYP88A1基因。方法:采用c DNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤Tw CYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱。结果:Tw CYP88A1 c DNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 k Da,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点。植物组织表达分析表明Tw CYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量最高,根中最低。结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Tw CYP88A1基因全长c DNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础。     

雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析

目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径。本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因c DNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析。方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因c DNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果:根据分析结果Tw MO基因全长为2 193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 k Da,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwMO的表达量明显增加,并在48 h达到最高,提示Tw MO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关。结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析

根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(Sm KOL)全长c DNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(Me JA)诱导丹参毛状根不同时期的Sm KOL表达水平。克隆得到的Sm KOL全长c DNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 k Da,等电点p I 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受Me JA诱导后,表达水平在36 h时达到最大值。从丹参毛状根中克隆得到1条Sm KOL全长c DNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因。     

雷公藤乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA克隆及表达分析

研究根据雷公藤悬浮细胞转录组数据库设计引物,对雷公藤悬浮细胞乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase)基因TwAACT进行全长cDNA(GeneBank:KP297934)克隆以及生物信息学分析和基因表达分析。克隆得到TwAACT cDNA全长为1 704 bp,编码405个氨基酸,等电点为6.10,相对分子质量为41.20 kDa,在线预测表明TwAACT具有2个催化活性位点。雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MeJA)外源诱导后,通过荧光定量PCR表明,TwAACT相对表达量明显增加,在24 h达到最高。研究首次克隆得到雷公藤AACT基因,为进一步阐述雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0~72 h TwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。     

雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1797bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到最高。此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

雷公藤PTEN基因全长克隆及表达分析

目的获得雷公藤Tripterygium wilfordii磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸肌醇3-磷酸酶(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase,PTEN)基因的c DNA全长,并预测其生物学功能。方法根据雷公藤转录组数据设计引物,对雷公藤PTEN(TwPTEN)基因进行全长克隆;通过生物信息学方法对得到的TwPTEN基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等。结果根据分析结果 TwPTEN基因全长为2 247 bp,共编码614个氨基酸,等电点为5.84,相对分子质量为66 900,多重序列比对显示其与其他植物的PTEN基因具有较高的同源性。雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,实时荧光定量结果显示,TwPTEN的表达量明显增加,并在12 h达到最高,提示PTEN基因与植物的次生代谢产物的产生有关。结论本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到PTEN基因,为进一步研究TwPTEN基因的功能奠定基础。     

太子参玉米黄质环氧化酶基因的克隆与表达分析

玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase,ZEP)在植物脱落酸(abscisic acid,ABA)生物合成间接途径中发挥着重要调节作用。该研究根据太子参转录组数据,克隆获得太子参的Pseudostellaria heterophylla玉米黄质环氧化酶基因,命名Ph ZEP。对其序列进行生物信息学分析,结果表明Ph ZEP的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 263 bp,编码420个氨基酸,预测其蛋白的相对分子质量为47.34 k Da,等电点(theoretical p I)为6.64;具有脂质蛋白附着点和黄素蛋白单加氧酶的特征性结构域,且在N端含有分泌信号肽。实时荧光PCR分析发现,Ph ZEP在叶片中表达量最高,其次是茎和须根;Ph ZEP在盛花期后10,40 d块根中的表达量较高;ABA处理后Ph ZEP表达量与对照组相当,经氟啶酮处理后Ph ZEP的表达量显著高于对照组。该研究从太子参中分离鉴定了ZEP基因,对后续研究其基因的功能特点和解析ABA在太子参生长发育过程的遗传调控提供研究基础。     

雷公藤牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的获得及生物信息学分析

该研究利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条GGPPS全长c DNA(Gene Bank:KM978333),并对其进行多重序列比对、蛋白结构预测及构建系统进化树等生物信息学分析。所克隆的Tw GGPPS c DNA全长1 857 bp,编码含514个氨基酸的蛋白序列,相对分子质量为57.13 k Da,等电点为7.85,具有5个保守域和2个功能域,亚细胞定位预测显示其可能位于质膜上,多重序列比对及系统进化树结果显示与其他植物GGPPS家族具有较高同源性。实验首次克隆了雷公藤GGPPS基因,为进一步研究雷公藤甲素等二萜化合物生物合成途径奠定基础。     

白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达

目的 克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis互作蛋白(jasmonate Zim-domain,JAZ)基因(NINJA),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆白木香NINJA基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)处理的白木香愈伤组织中AsNINJA1基因的表达模式。结果 获得白木香NINJA基因全长cDNA,命名为AsNINJA1。序列分析表明,该基因的序列全长为1 982 bp,包含一个1 221 bp的开放阅读框,编码406个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43 697,等电点为6.02。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理4 h后AsNINJA1基因相对表达量最高,是对照(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的近100倍,随后显著下降。结论 获得AsNINJA1基因全长cDNA序列,该基因对MeJA诱导极为敏感,且能在伤害早期响应。     

白木香JAZ1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的伤害诱导表达分析

目的克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis茉莉酸(JA)信号途径核心抑制蛋白基因(jasmonate-zim-domain protein,JAZ),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆JAZ基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qR T-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)和机械伤害处理的白木香愈伤组织中JAZ基因的表达模式。结果获得白木香JAZ基因全长cDNA,命名为AsJAZ1,GenBank登录号为KP677281。序列分析表明,该基因的序列全长为1507 bp,包含一个990 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸,蛋白质相对分子质量为34280,等电点为6.89。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理0.5 h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的27倍,随后显著下降;经机械处理2h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经机械处理的白木香愈伤组织)的17倍,随后又快速降低,到24h基本恢复正常。结论获得AsJAZ1基因全长cDNA序列,该基因对伤害诱导极敏感,且能在伤害早期响应。     

三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及表达分析

目的克隆三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因(Pn PGIP)的全长c DNA序列,分析该基因的表达特性。方法根据三七中编码PGIP的EST(expressed sequence tag)序列设计引物,采用c DNA末端快速扩增技术克隆Pn PGIP基因的全长c DNA序列;用q RT-PCR分析Pn PGIP基因的表达水平。结果 PnPGIP基因的cDNA全长为1 171 bp,含有981 bp的开放阅读框,13 bp的5’-非翻译区以及177 bp的3’-非翻译区,编码含326个氨基酸的蛋白质,PnPGIP蛋白的相对分子质量约为36 770,等电点约为5.83;q RT-PCR分析结果显示,Pn PGIP基因的表达量分别在三七接种茄腐镰刀菌和人参链格孢后4 h和2 h内迅速上升;此外,信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)、乙烯利(ethylene,ETH)、H2O2、水杨酸(salicylic acid,SA)处理均能不同程度地诱导Pn PGIP基因的表达水平。结论 PnPGIP基因在转录水平响应茄腐镰刀菌和人参链格孢的侵染,并受几种逆境胁迫相关信号分子的诱导,Pn PGIP基因可能参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。     

北沙参异戊烯基转移酶GlIPT1基因的克隆及生物信息学分析＊

目的 挖掘参与北沙参（Glehniae Radix）香豆素合成的关键酶异戊烯基转移酶（Isoprenyltransferase，IPT）基因，进一步分析该基因的序列特征及表达量模式。方法 本研究摸索了一种北沙参基原植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.）无菌苗制备方法，并且在珊瑚菜转录组测序数据的基础上，使用茉莉酸甲酯（MeJA）处理筛选出表达量上调的候选基因序列；利用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术对GlIPT1基因cDNA序列进行全长克隆；根据所得的氨基酸序列进行蛋白质理化性质、二级结构、三级结构分析；利用Clustalx及MEGA 6.0构建NJ系统进化树；利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测该基因的组织特异性表达。结果 GlIPT1基因cDNA序列全长为1296 bp，编码306个氨基酸残基，蛋白相对分子质量为34409.30 Da，等电点为5.93，属于P-loop_NTPase超家族，为亲水性蛋白。系统进化分析表明，GlIPT1与伞形科植物胡萝卜Daucus carota subsp. sativus IPT蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示：GlIPT1基因在珊瑚菜的花中表达量最高，其次是根，在叶中表达量较低。结论 本实验为进一步研究北沙参的分子育种和利用生物技术提高香豆素产量奠定了基础，具有重要的理论价值和良好的应用前景。     

珊瑚菜抗盐相关基因GlERF11克隆与盐胁迫表达分析＊

目的 鉴定珊瑚菜抗盐基因GlERF11并分析其在盐处理下的表达量变化。方法 对GlERF11基因进行全长克隆以及生物信息学分析，使用荧光定量PCR方法对GlERF11基因进行定量表达分析。结果 GlERF11基因cDNA全长1019 bp，开放阅读框全长537 bp，编码178个氨基酸。生物信息学分析显示，GlERF11蛋白为亲水性蛋白，无跨膜结构域，相对分子质量为19710.95 Da，包含AP2超家族保守结构域。系统进化树分析显示，GlERF11蛋白与伞形科植物胡萝卜ERF11蛋白亲缘关系较近。荧光定量分析显示，珊瑚菜幼苗的GlERF11基因受盐胁迫影响后表达量均有所提高，处理后12 h变化最为显著。结论 本研究针对珊瑚菜抗盐相关基因GlERF11开展生物信息学分析，研究为珊瑚菜品种改良以及育种提供了重要的理论基础与思路。     

菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析

根据菘蓝转录组数据,克隆了菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT的全长cDNA并进行生物信息学分析,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析了IiHCT基因的表达模式。IiHCT ORF为1290 bp,编码430个氨基酸,等电点为5.77,相对分子质量为47.68 kDa。IiHCT主要在菘蓝茎中表达,幼根、叶、花蕾中几乎不表达。同时发现离体菘蓝毛状根中可以检测到IiHCT的表达,外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,IiHCT相对表达量明显增加,在4 h达到原先的4.3倍。研究首次从菘蓝中克隆得到HCT基因,为进一步解析菘蓝苯丙素类成分的生物合成途径奠定基础。     

地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶,在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用。根据地黄转录组数据,克隆了地黄酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC的全长cDNA序列(GenBank登录号KU640395),并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在地黄不同组织及4种诱导子处理后毛状根中的表达量。结果表明,RgTyDC ORF为1 619 bp,编码509个氨基酸,相对分子质量为56.6 kDa,等电点pI 6.25。RgTyDC与芝麻酪氨酸脱羧酶SiTyDC和猴面花酪氨酸脱羧酶EgTyDC的同源性最高,均为88%。RgTyDC基因在叶片(尤其是衰老的叶片)中表达量较强,在块根中表达量较低。SA和MeJA处理后显著上调表达。这为进一步研究RgTyDC在地黄苯乙醇苷类成分生物合成中的分子功能奠定基础。     

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建

目的 克隆北柴胡Bupleurum chinense中可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因BcUGT8,构建其原核表达载体,为通过体外表达和纯化蛋白的催化活性,分析验证其功能奠定基础.方法 在Roche (454) GS FLX系统高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和长距离PCR扩增方法(LD-PCR)克隆全长cDNA.设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其开放阅读框(ORF),酶切后,插入到pET-28a(+)载体中,构建出原核表达载体.结果 扩增到北柴胡1个糖基转移酶(UGT)基因全长cDNA,构建了这一基因的原核表达载体.结论 通过BcUGT8基因的全长cDNA克隆、序列分析和原核表达载体的构建,为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验,验证其生物功能奠定了基础.