阴道念珠菌随机扩增多态性DNA分型研究

目的 对分离自外阴阴道念珠菌病患者阴道的念珠菌进行基因分型,并对不同菌株间的亲缘关系作相似性分析。方法 用形态学及生化方法对分离到的致病性念珠菌进行鉴定,然后采用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对45株临床分离株基因组DNA进行扩增,并将DNA扩增带型进行聚类分析。结果 30株白念株菌可以分成7群共19个亚群,15株非白念珠菌(包括光滑念珠菌6株,克鲁斯念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌各3株)至少可鉴定到种水平。白念珠菌种内不同菌株间的相似性系数在90%以上,不同念珠菌种间的相似性系数介于80%~90%。结论 外阴阴道念珠菌病的主要致病菌是白念珠菌,用RAPD技术可将之分成不同的基因组型别。     

微孔板双探针杂交法快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌

目的 建立微孔板双探针杂交法,快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌,并应用于临床分离株的快速鉴定。方法 利用真菌保守区核糖体基因和可变区内转录间隔区基因为靶序列,应用生物素标记的通用引物进行念珠菌DNA的PCR扩增,并将该PCR产物分别与固定在微孔板上的都柏林念珠菌和白念珠菌特异性探针杂交,经酶联显色反应测其A值。结果 能特异地鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌标准菌株。对108株常规培养方法从临床标本分离的白念珠菌检测,结果显示106株菌株仅白念珠菌探针检测阳性,另2株菌株仅都柏林念珠菌探针阳性。结论 微孔板双探针杂交法能快速、特异地鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌。     

外阴阴道念珠菌病患者临床分离菌株的菌种及基因型分析

目的 探讨初发型、复发型外阴阴道念珠菌病患者及健康带菌者阴道分离的念珠菌菌种及菌株基因型与初发及复发的关系。方法 选择分别来自健康带菌者、外阴阴道念珠菌病患者和复发性外阴阴道念珠菌病患者。首先经菌种鉴定,然后用RAPD技术对来自3组人群的菌株进行基因分型。结果 临床分离株菌种鉴定结果为白念珠菌83株,非白念珠菌共14株。从9个随机引物中筛选出的2条引物(引物4和引物7)对初发组、复发组及健康带菌组分离株的扩增带型多数未表现出与菌株来源的联系,但少数菌株依来源不同表现出了一定区别。引物4和引物7可将来源于不同临床分型的97株菌及2株标准菌株分成19型和21型。结论 外阴阴道念珠菌病致病菌以白念珠菌为主,非白念珠菌中以光滑念珠菌为主。     

微卫星基因分型法分析生殖器白念珠菌感染的传播特点

目的 建立适用于株间鉴别的白念珠菌快速微卫星基因分型方法,探索生殖器白念珠菌感染特点.方法 采集39例女性和27例男性生殖器念珠菌病患者生殖器、肛管和口腔的白念珠菌分离株.以三色荧光标记引物,PCR扩增白念珠菌保守基因CDC3、EF3和HIS3微卫星序列,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,行微卫星多态性基因分型.结果 三基因联合分析显示,男女生殖器白念珠菌感染者共获18种基因型,主要致病菌株基因型为116:124、122:131、160:200,占感染者的50%以上.3种共有基因型占71%.女性患者中肛管部位菌株基因型与生殖器部位完全一致的占80%,男性则仅占3.8%.女性患者口腔部位的菌株基因型与生殖器部位完全一致的仅占2.7%,男性未见口腔和生殖器一致的菌株基因型.71%的夫妻共患者间生殖器白念珠菌基因型完全相同,其中80%的致病菌株基因型为两性皆感染的主要致病性白念珠菌.结论 改良的白念珠菌微卫星多态性基因分型法能够特异、准确、稳定和快速地进行菌株间鉴别.生殖器白念珠菌感染存在优势基因型.     

新生隐球菌28S rDNA的基因型特征与序列分析

目的 探讨新生隐球菌各变种、血清型与基因型的关系。方法 新生隐球菌标准株10株、新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10以及临床分离株19株,采用变性梯度胶电泳(DGGE)结合DNA序列分析,对以上菌株的28S rDNA片段进行研究。结果 经过DGGE和DNA序列分析,所有新生隐球菌新生变种(A、D型)具有一致的基因带型和序列,格特变种(B、C型)具有不同于新生变种的独特一致的带型和序列;AD型的基因型和序列与格特变种完全相同,新生隐球菌荚膜缺陷株CAP10(D型)的基因型类同于新生变种;19株临床分离菌在DGGE上可分为2型,17株与A、D型完全相同,2株与B、C型相同。结论 DGGE结合DNA序列分析,对于探讨新生隐球菌各变种、血清型的基因型特征、关系具有重要价值;我国非艾滋病隐球菌病感染以新生变种为主,AD型在系统发育上更类同于格特变种,而不是新生变种;本研究不支持A血清型为新生变种以外的新变种即grubii变种的观点。     

白念珠菌ERG11基因启动子部分序列分析

目的 探讨白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子部分(-440～-1)碱基序列的差异以及ERG11基因启动子突变与白念珠菌对氟康唑敏感性的关系。方法 分别提取从同一亲本来源、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因启动子序列及其编码序列设计一对引物,对ERG11基因上游启动子部分碱基序列(-503～53)进行PCR扩增,经PCR产物直接测序比较白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子序列(-440～-1)的差异以及对氟康唑敏感性不同的白念珠菌ERG11基因启动子序列的差异。结果 白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11启动子序列未发现差异。氟康唑敏感株白念珠菌ERG11基因启动子的-365,-353,-328,-310,-308,-299,-295,-293,-292,290,-289位点为杂合状态,且在-284位点有一等位基因发生单碱基缺失(-284delT);而在白念珠菌氟康唑剂量依赖性敏感和耐药株上述杂合现象消失。结论 白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因启动子-440～-1区碱基序列无差异;ERG11基因启动子突变可能与白念珠菌对氟康唑耐药有关。     

利用核糖体基因进行申克孢子丝菌基因分型

目的 利用探针与DNA印迹法对申克孢子丝菌进行种内分型,探讨其基因型特征与菌种来源及临床表现的关系.方法 CTAB法提取来源于不同地区31株孢子丝菌临床分离株及1株标准株的基因组DNA,以真菌通用引物ITS4、NS5扩增标准株的rDNA序列作为探针,与经限制性内切酶ApaI酶切后的基因组DNA进行印迹杂交.结果 杂交后形成多种清晰而稳定的带型,根据带型将31株孢子丝菌分为15种基因型(A-O型),其中A、B、C三型占51.61%.结论 探针与DNA印迹法是孢子丝菌种内分型较为敏感而可靠的方法,该方法所分基因型的不同与菌种的地区来源及临床表现有一定的相关性.     

皮肤念珠菌病患者多部位分离菌株DNA分型研究

目的 比较皮肤念珠菌病患者不同部位分离菌株基因相似性,推测皮肤念珠菌病多部位感染的可能途径。方法 采用PCR扩增引物P-Ⅰ和P-Ⅱ扩增出白念珠菌染色体25SrDNA片段和特征性的基因片段重复序列片段,结合两种扩增结果进行分型,并将870bp大小的特征性的基因片段重复序列片段用限制性内切酶EcoRⅠ和ClaⅠ消化。结果 来自19例皮肤念珠菌病患者的41株白念珠菌被分为6型,同一患者不同部位分离菌株基因型相似,不同个体间基因型有差异。结论 分离自皮肤念珠菌病患者不同部位的致病菌株基因型相同,提示其发病可能与外源性再发感染无关。     

基于PCR-LIS-SSCP的白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因比较研究

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-LIS-SSCP图谱的比较,探讨两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提16株来自同一亲本且对氟康唑敏感性不同的白念珠菌菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计7对引物,对其进行分段PCR扩增,扩增产物经单链变性后,以非变性聚丙烯酰胺凝胶进行SSCP分析。结果16株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出目的片段,SSCP图谱显示两相细胞的ERG11基因序列存在多位点差异。结论白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11,基因存在着差异。     

汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌活性的增效作用

目的 探讨体外汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌活性是否有增效作用.方法 参照微量稀释法确定汉防己甲素对白念珠菌的非细胞毒性剂量,并测定氟康唑单独及联合汉防己甲素时对16株白念珠菌的MIC.结果 在终质量浓度≤40μg/ml汉防己甲素的作用下,白念珠菌的存活率>95%.其中汉防己甲素(30～40μg/mL)可抑制白念珠菌菌丝相形成.氟康唑单独作用时,对16株白念珠菌的MIC值为0.250～64μg/mL;与汉防己甲素(40μg/mL)联合时,氟康唑对受试菌的MIC值降至0.125～16μg/mL,且终点清晰,“拖尾现象”消火.结论 汉防己甲素在体外对氟康唑的抗白念珠菌活性有增效作用.     

阴道非白念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的对分离自外阴阴道念珠菌病(VVC)患者阴道的常见致病性非白念珠菌进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法的鉴定。方法首先采用芽管试验、厚壁孢子试验、法国科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基及API20CAUX酵母菌鉴定系统将分离自VVC患者阴道内的念珠菌菌株鉴定到种,然后采用真菌通用引物将4种常见非白念珠菌(包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌)进行PCR扩增,并选用MspⅠ和HaeⅢ两种内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果在4种非白念珠菌中光滑念珠菌15株(7.50%),近平滑念珠菌7株(3.50%),克柔念珠菌5株(2.50%),热带念珠菌2株(1.00%);PCR扩增后均产生稳定、清晰的条带,扩增产物经MspⅠ,HaeⅢ酶切后分别产生4种和2种特异性带型。结论外阴阴道念珠菌病非白念珠菌中以光滑念珠菌为主;PCR-RFLP方法在鉴定常见致病性非白念珠菌中比较可靠、稳定、特异,但仍有方法繁琐等不足之处。     

念珠菌在母婴间垂直传播的流行病学研究

目的：探讨产妇念珠菌感染与其新生儿口腔念珠菌的带菌情况,了解母婴间的垂直传播。方法：对554例某妇婴医院产科经阴道分娩的产妇分娩前的阴道后穹隆分泌物,及其刚出生断脐后新生婴儿口腔分泌物进行真菌分离培养。并采用常规科玛嘉念珠菌显色培养基、玉米粉培养基、海藻糖试验、API20C生化鉴定板等进行菌种鉴定。同时对产妇的一般情况进行调查。结果：554例产妇中132例培养出真菌,分离率最高的职业是主妇,占50．76％．而第1胎检出率最高,占92．42％：产前感染率百分比最高的是农民和干部,分别占33．33％和30．00％。分离出的132株真菌中,白念珠菌78株(占分离菌的首位),其次为光滑念珠菌21株;而554例新生儿口腔真菌培养共分离出11株真菌,白念珠菌8株,光滑念珠菌2株,克柔念珠菌1株．阳性率为1．99％。母婴间同时分离出相同念珠菌共11对,为白念珠菌8对,光滑念珠菌2对,克柔念珠菌1对。结论：妊娠末期妇女阴道念珠菌的感染可垂直传播给新生儿,其垂直传播率约为8．33％。预防母亲产前阴道念珠菌感染可降低新生儿念珠菌感染的可能性。     

DNA芯片鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变

目的 建立DNA芯片技术鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变。方法 根据6种常见念珠菌内转录间隔（ITS2）区种特异性序列和白念珠菌ERG11基因中已证实可导致对氟康唑耐药的6种突变序列设计探针,制备DNA芯片,鉴定12条50 bp的念珠菌种特异性序列和ERG11突变序列及34株念珠菌（其中白念珠菌29株,热带念珠菌、光滑念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌各1株）。结果 ①芯片正确鉴定12条人工合成序列;②正确鉴定34株试验菌株的菌种;③正确鉴定29株白念珠菌ERG11基因中可致耐药的已知突变。敏感性和特异性均为100%。结论 用DNA芯片进行念珠菌菌种鉴定和白念珠菌ERG11突变筛查,结果可靠。     

外阴阴道念珠菌病复发前后分离菌株基因型分析

目的 比较从外阴阴道念珠菌病患者复发前后分离菌株的RAPD指纹图谱的异同。方法 通过流行病学调查表来收集病例和采集样本。所有临床分离菌株均经芽管形成试验、念珠菌显色培养基（CHROMagar Candida） 和API20C系统鉴定，然后用RAPD技术对2株白念株菌标准菌株和来自24例患者连续2次及1例患者连续3次分离出的临床菌株共51株菌株进行基因分型。结果 引物4的RAPD扩增结果表明，66.7%的患者再次发作前后菌株的扩增带型一致。引物7的RAPD扩增结果为，58.3%的患者复诊前后菌株的扩增带型一致。25例患者中有4例患者前后2次分离的菌种从白念珠菌替换成光滑念珠菌。结论 从外阴阴道念珠菌病患者分离的菌株半数以上在再次发作前后无明显基因型上的差别，仅有部分菌株会在复发前后基因型发生改变。     

复发性阴道念珠菌病念珠菌的菌种及药敏分析

目的：了解复发性外阴阴道念珠菌病(RVVC)临床分离菌株及其对几种常见抗真菌药物的敏感性：方法：分别采用念珠菌显色培养基和ROSCO纸片扩散法进行RVVC念珠菌菌种鉴定和药敏试验。结果：62株阳性标本中,分离出白念珠菌47株(75．81％),热带念珠菌4株(6．45％),光滑念珠菌2株(3．23％),克柔念珠菌5株(8．06％),其他念珠菌4株(6．45％)．62株念珠菌对4种常用的抗真菌药物,即两性霉素B、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑的敏感率分别为：100．00％(62／62)、88．71％(55／62)、96．77％(60／62)、95．16％(59／62)。结论：RVVC的主要致病菌仍是白念珠菌,但非白念珠菌所占比例呈上升趋势：RVVC分离菌株对咪唑类抗真菌药物仍有较高的敏感率。     

伏立康唑与其他5种抗真菌药体外抗念珠菌活性的比较研究

目的比较伏立康唑与其他5种抗真菌药在体外抗深部致病念珠菌的活性。方法按NCCLS推荐的M27A方案(肉汤微量稀释法)检测伏立康唑等6种抗真菌药对6种共52株深部致病念珠菌临床分离株在体外的抗真菌活性。结果对受试菌株总体而言,伏立康唑的活性最高(MIC90≤0.5μg/ml)。伏立康唑对6种念珠菌的MIC90从小到大依次为白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和法氏念珠菌。伏立康唑对各受试菌种的MIC90均低于氟康唑和特比萘芬;对白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌的MIC90低于伊曲康唑;对克柔念珠菌和法氏念珠菌的MIC90低于两性霉素B。结论伏立康唑在体外能有效抑制深部致病念珠菌的生长,其抗菌谱较广,尤其对唑类药耐药的两种念珠菌——克柔念珠菌和光滑念珠菌也具有较好的抗真菌活性,部分菌种抗真菌活性甚至优于氟康唑和伊曲康唑。     

常见病原念珠菌鉴定的数码分类方法

建立了一种用于常见病原性念珠菌菌种鉴定的多种碳源同化试验及结果分析的数码分类方法。结果，对１４种碳源固相同化试验结果的编码分析可形成５位数码，进而形成１８种数码可明确区分８种受试的病原念珠菌。结果表明，多种碳源同化试验及编码分析方法可以快速、明确地鉴定８种临床最常见的念珠菌，也为今后建立临床酵母菌快速鉴定系统打下了基础。     

外阴阴道念珠菌病的致病菌群分析

目的 探讨青岛及周边地区外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种特征。 方法 采用常规念珠菌培养方法鉴定菌种,包括沙氏培养基,血清芽管实验,CHROMagar念珠菌显色培养基及API 20C AUX酵母菌鉴定系统。结果 2011年5 ~ 11月共收集362例妇科门诊患者的阴道分泌物,病原学分析显示,念珠菌阳性例数为313例,总感染率为86.46%,菌种构成分布为白念珠菌275株,光滑念珠菌13株,近平滑念珠菌8株,热带念珠菌7株,克柔念珠菌5株,葡萄牙念珠菌1株,都柏林念珠菌1株,粘质红酵母菌1株,奥默毕赤酵母菌1株,粘性丝孢酵母菌1株。结论 白念珠菌仍是外阴阴道念珠菌病的常见致病菌,非白念以光滑念珠菌为主。     

多重PCR技术快速鉴定血培养阳性标本中酵母菌菌种的应用研究

目的：探讨多重PCR技术在快速鉴定引起真菌血症的重要医学酵母菌中的应用。方法：扩增酵母菌位于18S rRNA和5．8S rRNA基因之间的内转录间区（ITS）1的片段,以及白念珠菌位于ITS2区的特殊DNA片段,建立多重PCR方法,并鉴定血培养液中的酵母菌。结果：通过扩增片段长度分析显示光滑念珠菌482bp,季也蒙念珠菌248bp,近平滑念珠菌229bp,白念珠菌218bp和110bp,热带念珠菌219bp,新生隐球菌201bp,克柔念珠菌182bp。采用多重PCR方法共检测29例患者47份血培养阳性标本共50个分离株,其中白念珠菌27株,热带念珠菌8株,光滑念珠菌4株,近平滑念珠菌4株,新生隐球菌2株,克柔念珠菌1株,季也蒙念珠菌1株,均与培养鉴定结果一致,实验敏感性96％（47／50）,特异性100％。多重PCR实验检测全过程共需8h。结论：多重PCR方法快速、敏感、特异,有助于播散眭念珠菌感染的早期诊断,具有较好的应用前景。