竞争性RT—PCR法定量分析骨巨细胞瘤中TBFβ—1mRNA的表达水平

目的：用竞争性PCR法检测同巨细胞（GCT）中TBFβ-1mRNA,分析其对肿瘤预后的意义。方法：通过RT－PCR法制备内标和外标,交疸的内标和等比释的外标进行竞争性共扩增,得到标准曲线,然后等量的内标和cDNA标本共扩增,通过标准曲线求出标本中TBFβ-1mRNA的水平,并与GCT分级进行对比。结果：内标和外标在共扩增中表现出很强的竞争性。GCT中TBFβ-1mRNA的表达水平随着肿瘤分级的上升明显增加,局部复发和肺转移的标本中TBFβ-1mRNA表达水平较未复发的标本高,结论：竞争性RT－PCR是一种灵敏,简便,快速检测GCT中TBFβ-1mRNA表达水平的方法,应用该方法和肿瘤病理分级标准来综合判断肿瘤的预后,有着重要的临床意义。     

人脑星形细胞瘤EGF、TGFα及其受体EGFR的表达

目的：讨论EGF，TGFα及其受体EGFR的表达与人脑星形细胞瘤发生，发展的联系及其相互关系。方法：用 原位杂交及免疫组化技术从mRNA蛋白水平检测25例人脑星形细胞瘤标本的EGFmRNA和TGFamRNA基因表达，同时检测55例人脑星形细胞瘤标本的EGF，TGFα和EGFR蛋白的表达。结果：25例星形细胞瘤原位杂交中EGFmRNA阳性率为80％，TGFαmRNA阳性率为76％，两者的表达水平与肿瘤的病理组织学分级呈正相关，55例星形细胞瘤的免疫组化染色中，ihEGF,ihTGFα及ihEGFR的阳性率分别为85．4％，94．5％，98．1％，三者的表达水平均与肿瘤的病理组织学分级差异显著，EGFmRNA与ihEGF表达及TGFαmRNA与ihTGFα表达均呈正相关，结论：EGF，TGFα及EGFR在人脑星形细胞瘤中的表达与肿瘤组织学分级有关，三者均可作为判断肿瘤恶性度的客观指标。     

肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的增殖能力与转化生长因子-β_1 mRNA的表达

目的：研究肾癌来源的肿瘤浸润淋巴细胞体外增殖能力与转化生长因子表达之间的关系。方法：自13例肾癌组织标本中分离新鲜的肿瘤浸润淋巴细胞，在含不同浓度的重组人白细胞介素-2的完全培养液中培养3周，了解其体外扩增能力。同时对肾癌组织标本作石蜡切片后，应用原位杂交技术检测肾癌组织中转化生长因子-β1mRNA的表达，对部分液氮冻存的肾癌组织，抽提其RNA，利用Slot印迹技术检测TGF－β1mRNA的表达。结果：在rhuIL－2浓度为100IU／ml和1000IU／ml的培养液中培养3周，TIL的扩增值数分别为x=112±117（范围：12～409）和x＝694±524（范围：59～1748）。其中TGF－β1mNA表达组，TIL的扩增值数分别为x＝30±11（范围：12～49）和x=221±128（范围：59～350），而TGF－β1mRNA不表达组，TIL的扩增值数分别为x＝183±121（范围：37～409）和x＝913±524（范围：91～1748）。结论：TIL随着培养液中IL－2的浓度增加，其扩增能力增强。TIL的扩增能力与肿瘤组织中TGF-β1mRNA的关系呈反向关系。     

转化生长因子β1Ⅱ型受体对增生性瘢痕成纤维细胞的影响

目的探讨转化生长因子β1(TGFβ1)Ⅱ型受体同源序列多肽的生物学功能及其对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响.方法根据TGFβ1Ⅱ型受体的氨基酸序列人工合成一段短肽,以增生性瘢痕成纤维细胞为靶细胞,分别于蛋白水平和mRNA水平检测该短肽对TGFβ1所诱导的细胞胶原合成的拮抗作用.结果该短肽可以明显抑制TGFβ1所诱导的增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成量及细胞内Ⅰ型前胶原mRNA的表达.结论该短肽可能作为TGFβ1 Ⅱ型受体的竞争性拮抗剂,抑制或降低了该生长因子对细胞的刺激作用.     

反义转化生长因子β1抑制Ⅲ度烫伤愈合中瘢痕形成的实验研究

背景瘢痕的形成涉及多种因素,其中之一是转化生长因子β1(TGFβ1)的高表达,为达到抑制TGFβ1过度表达的目的,尝试用反义TGFβ1抑制瘢痕形成的方法,将基因治疗技术运用于临床医学.目的探讨反义TGFβ1对Ⅲ度烫伤愈合中瘢痕生成的抑制作用.设计随机对照、重复测量设计.地点和对象在上海第二医科大学生物化学教研室完成.清洁级雄性SD大鼠105只,体质量(250±20)g,购于中科院上海实验动物中心.干预SD大鼠Ⅲ度烫伤后,分3组进行处理①反义TCFβ1脱氧寡核苷酸.②反义TGFβ1重组质粒.③空白对照.分别于烫伤后1,3,5,14 dRT-PCR、免疫组化检测TGFβ1mRNA和蛋白质的表达.烫伤后5,14,21,28,60 d原位杂交检测Ⅰ型胶原mRNA的表达变化,病理检测炎性细胞浸润反应和胶原分布状况.主要观察指标①烫伤后1,3,5,14 d RT-PCR,TGFβ1mRNA和蛋白质的表达.②烫伤后5,14,21,28,60 d Ⅰ型胶原mRNA的表达变化.③病理检测炎性细胞浸润反应和胶原分布状况.结果反义ODN组和反义重组质粒组在烫伤后第1天TGFβ1mRNA表达水平与对照组相比无降低,14 d分别为0.176±0.014和0.213±0.071,表达均减少.反义作用组TGFβ1蛋白质的表达在烫伤后3周内均为低表达.原位杂交显示对照组在14 dⅠ型胶原mRNA开始表达,28 d达到高峰,随后减少,反义作用组无此现象,一直保持低表达.病理染色显示反义作用组炎性细胞浸润少,炎性反应低,胶原合成减少.结论反义TGFβ1可抑制Ⅲ度烫伤愈合中瘢痕的形成.     

β3GnT8基因对HL60细胞体外侵袭能力的影响

目的：初步探讨β3GnT8/GalT7基因对HL60细胞体外侵袭的作用。方法通过脂质体介导将实验室构建好的β3GnT8真核正义表达载体pEGFP-C1-T8-Sense和反义表达载体pEGFP-C1-T8-AntiSense转染入HL60细胞;RT-PCR和Western blot检测浸润转移相关的功能基因TGFβ1、MMP2、MMP14在mRNA水平和蛋白质水平的表达变化;Transwell侵袭实验检测β3GnT8对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果随着β3GnT8表达上调,细胞侵袭能力高于对照组（P＜0.05）,MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达上调,而TGFβ1表达下调;随着β3GnT8表达下调,细胞侵袭能力下降,MMP2、MMP14在mRNA和蛋白质水平的表达下调,而TGFβ1表达上调。结论β3GnT8可在体外增强HL60细胞的侵袭能力,而该作用可能源于它能够诱导肿瘤侵袭相关蛋白的表达变化。     

靶向转化生长因子β1的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建靶向转化生长因子β1（TGFβ1）小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体.[方法]设计二个siRNA作用靶点,体外合成的相应双链DNA被插入pSilencer-2.1质粒中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序.采用脂质体转入HSC-T6细胞中,利用RT-PCR法和western-blot分别检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达.[结果]靶向TGFβ1 的siRNA-a和siRNA-b二个表达质粒是成功构建; 与无关对照组相比,siRNA-b组对TGFβ1mRNA和蛋白表达均明显下调（ P 〈0.01）,siRNA-a组无明显下调（ P 〉0.05）.[结论]成功构建了靶向TGFβ1 基因的siRNA表达质粒,为进一步研究其阻断肝纤维化打下基础.     

溶血卵磷脂对牛视网膜微血管内皮细胞转化生长因子-β_2及其Ⅱ型受体表达的影响

目的:探讨不同浓度的溶血卵磷脂(LPC)对牛视网膜微血管内皮细胞转化生长因子-β2(TGF-β2)及其Ⅱ型受体表达的影响.方法:原代分离培养牛的视网膜微血管内皮细胞,加入不同浓度的LPC,分别培养6、12、24h,RT-PCR检测TGF-β2 mRNA表达水平,半巢式RT-PCR检测TGF-βⅡ型受体mRNA的表达水平.结果:LPC的浓度为40 μmol/L作用12 h后,TGF.B2 mRNA水平明显高于浓度为20 μmol/L和60 μmol/L.LPC浓度改变对TGF-βⅡ型受体mRNA的表达无明显影响.结论:LPC能调节牛视网膜内皮细胞TGF-β2的表达;LPC对TGF-βⅡ型受体的表达无明显影响.     

TGFβ1与周细胞在乳腺癌血管生成中的关系及意义

目的　分析TGFβ1 与周细胞在乳腺癌血管生成中的相互关系及作用。方法　取 5 0例手术切除乳腺癌新鲜标本 ,采用免疫组织化学染色、原位杂交技术 ,结合体视学分析方法 ,研究TGFβ1 及周细胞在乳腺癌中的表达情况。结果　TGFβ1 蛋白质可表达在新生血管周细胞的胞浆中 ,同时也可表达于乳腺癌癌细胞及新生血管内皮细胞 ;TGFβ1mRNA主要表达在血管周细胞的胞浆中 ,只有极少数癌细胞呈弱阳性表达。乳腺癌中TGFβ1 mRNA的表达与周细胞的表达正相关 ,P <0 0 1。结论　提示周细胞通过TGFβ1 参与血管生成的调节     

胃癌组织中β-catenin mRNA表达水平及临床意义

目的:检测胃癌组织标本β-catenin mRNA表达水平,并探讨其临床意义.方法:以β-actin为内参照,采用实时荧光定量PCR技术检测45例胃癌患者术后胃癌组织标本、肿瘤边缘5 cm外的正常组织β-catenin基因mRNA的表达水平,并进行比较.结果:胃癌患者术后胃癌组织标本β-catenin mRNA表达水平较正常组织标本高(P<0.01);肠型胃癌β-catenin mRNA表达水平高于弥漫型胃癌(P<0.05);TNM分期早期胃癌β-catenin mRNA表达水平低于晚期(P<0.05);淋巴结有转移者高于无转移者(P<0.01),且与浸润深度相关(P<0.01);胃癌β-catenin mRNA表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无关.结论:β-catenin mRNA在胃癌组织中呈高表达,是评价疾病发生、发展的良好指标.     

PDCD5和Caspase-3在多发性骨髓瘤中的表达

目的 研究促凋亡基因PDCD5和Caspase-3mRNA在多发性骨髓瘤(MM)中的表达,并讨论其在MM的发生、发展及预后中的意义.方法 从收集40例MM患者及10例正常对照的骨髓标本中取骨髓单个核细胞(BMMCs),采用实时荧光定量PCR(Real time PCR) 的方法检测BMMCs中PDCD5和Caspase-3mRNA的表达,同时收取血浆以检测β2微球蛋白(β2-MG)分泌水平,Durie-Salmon(D-S)分期标准对MM患者进行临床分期.结果 与对照组比较,PDCD5和Caspase-3mRNA在MM组中表达明显减低(P<0.05),差异有统计学意义;复发/难治组患者PDCD5和Caspase-3mRNA的表达仍保持较低水平;初发组与复发/难治组之间表达差异无统计学意义.PDCD5和Caspase-3mRNA表达与患者病程D-S分期和β2-MG(≥或＜4.0 g/L)水平有负相关性(r=-0.86,P<0 05).结论 MM患者PDCD5和Caspase-3mRNA表达水平降低,提示PDCD5和Caspase-3可能参与MM的发生发展,可能作为评判MM患者预后的新指标.     

多发性骨髓瘤患者BAFF与BCL-2 mRNA的表达及意义

本研究探讨B细胞活化因子(BAFF)和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL-2)mRNA在多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)中表达水平及BAFF和BCL-2对MM的发生、发展及预后的意义。收集40例MM患者及10例正常对照的骨髓标本,获取BMMNC;采用实时荧光定量PCR(real time PCR)的方法检测BMMNC中BAFF与BCL-2 mRNA的表达,并同步收取血浆,检测β2-MG分泌水平;按Durie-Salmon(D-S)分期标准对MM患者进行临床分期。结果表明,①BAFF与BCL-2 mRNA在MM组中表达升高,与对照组比较差异有统计学意义,治疗后平台期BAFF与BCL-2 mRNA表达水平明显减低(p<0.05);②复发/难治性多发性骨髓瘤患者BAFF与BCL-2 mRNA的表达水平较正常对照组及平台期患者明显升高(p<0.05),初发组与复发/难治组之间表达无显著差异。BAFF与BCL-2 mRNA表达与患者病程D-S分期和β2-MG水平有相关性。结论:MM患者BAFF与BCL-2mRNA表达水平升高,并且MM初治组、复发/难治组BAFF与BCL-2 mRNA表达水平均高于平台组,提示BAFF和BCL-2可能参与MM的发生、发展的病理机制;BAFF与BCL-2 mRNA表达水平与MM肿瘤负荷呈正相关,提示BAFF和BCL-2表达水平可以作为评判MM患者预后的新指标。     

纤维母细胞活化蛋白和转化生长因子β1在胃癌中的表达及其临床意义

目的 研究纤维母细胞活化蛋白(FAP)和转化生长因子β1(TGFβ1)在胃癌组织中的表达,并分析其与胃癌临床病理特征及淋巴结转移间的关系.方法 采用免疫组化方法检测FAP和TGFβ1在42例胃癌和癌旁正常组织中的表达情况.结果 ①正常胃组织中FAP(-);胃癌组织中FAP主要表达于肿瘤相关纤维母细胞胞质中,且弥漫型胃癌表达显著高于肠型胃癌(P<0.05),并与临床病理分期、浸润深度和淋巴结转移呈正相关(P<0.05);②正常胃组织中TGFβ1为(-)或弱(+);胃癌组织中TGFβ1主要表达于瘤细胞胞质,在肿瘤间质纤维母细胞、血管内皮细胞和中性粒细胞偶有表达,且瘤细胞的表达强度与临床病理分期、浸润深度和淋巴结转移呈正相关(P<0.05);③ FAP在肿瘤相关纤维母细胞的表达与TGFβ1在肿瘤细胞的表达呈正相关(P<0.05).结论 从FAP表达与TGFβ1表达的正相关性,推测其可能是通过肿瘤-间质相互作用促进肿瘤演进.FAP特异性表达于胃癌间质纤维母细胞,与多项临床病理指标,尤其是淋巴结转移和肿瘤的病理分型有关,可以作为预测胃癌淋巴结转移和预后的免疫病理学指标,有望成为抗胃癌治疗的一个新的靶向分子.     

构建hnRNP B1相对定量的FQ RT-PCR检测方法

目的 建立一种荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ RT-PCR)检测肺癌患者外周血hnRNP B1 mRNA表达的相对定量方法.方法 以hnRNP B1为待测基因,以β-actm为参照进行检测,建立标准曲线,确定实时RT-PCR的扩增效率;优化反应条件,使扩增效率接近100%,检测待检标本hnRNP B1和β-actin的循环阈值(Ct).结果 该法检测的最低拷贝数为103,线性范围为103～107拷贝,批内和批间变异系数(CV)分别为3.4%和11.3%.结论 该方法具有灵敏、特异、数据处理简便可靠等特点,为其他肿瘤患者外周血中肿瘤细胞的检测提供了方法学启示.     

HIF-1α在膀胱移行细胞癌组织中的表达及临床意义

[目的]检测膀胱移行细胞癌(BTCC)组织中HIF-1α的表达情况,初步探讨HIF-1α在BTCC中表达的临床意义.[方法]应用免疫组织化学及RT-PCR技术检测BTCC组织中HIF-1α的蛋白和mRNA表达,并分析其表达与肿瘤临床分期、病理分级及复发的关系.[结果]免疫组织化学染色显示:12例正常膀胱组织未发现HIF-1α阳性表达,57例BTCC组织中有30例HIF-1α表达阳性,阳性表达率占52.63%.其表达与肿瘤的病理分级无关,但与肿瘤的临床分期(Tis-T1期的表达率与T2～T4期相比,P=0.026)及复发明显相关.RT-PCR检测显示:BTCC组织中HIF-1α mRNA的阳性表达率显著高于正常膀胱组织,但BTCC组织中HIF-1α mRNA的表达与其蛋白水平表达无明显相关性.[结论]在BTCC中,HIF-1α蛋白的表达明显上调,HIF-1α在BTCC的侵袭等生物学过程中具有重要的作用,HIF-1α可能可以用于临床监控BTCC的进展.     

Wnt1/β-catenin 与食管鳞状细胞癌临床病理及预后的相关性研究

目的 探究Wnt1/β-catenin 信号通路与食管鳞状细胞癌(ESCC)的临床病理及预后因素的相关性.方法 用实时定量PCR(RT-PCR)和免疫组织化学技术分析70 例ESCC(包括癌组织与癌旁非癌组织)中Wnt1/β-catenin 的表达情况,统计分析其与临床病理及预后的关系.结果 癌组织中Wnt1 mRNA 水平(1.9934 ±1.9888 vs.0.8863 ±0.6658,P ＝0.0000)和蛋白质水平(0.3830 ±0.0947 vs.0.2721 ±0.1474,P ＝0.0000)均较癌旁组织中显著高表达;Wnt1 mRNA 表达与病理分期和淋巴结转移及预后相关(P <0.05),但蛋白质水平未显示相关.癌组织中β-catenin mRNA 水平(0.2854 ±0.1298 vs.0.8863 ±0.6658,P ＝0.0000)和蛋白质水平(0.2835 ±0.0844 vs.0.2352 ±0.0670,P ＝0.003)较癌旁组织中显著高表达,β-catenin mR-NA 表达与病理分期、淋巴结转移及预后相关(P <0.05),但蛋白质水平并未显示相关.在蛋白质水平上,Wnt1 和β-catenin 表达水平无相关性.结论 Wnt1/β-catenin 在ESCC 组织中显著高表达,可能成为判断ESCC 分期和预后的重要分子标记物.且Wnt1/β-catenin mRNA 表达水平与ESCC 临床病理分期、淋巴结转移呈逆相关,mRNA 的异常表达者预后不佳,但可能不是独立预后因素.     

骨巨细胞瘤mdm2和p21~(H-ras)的免疫组化研究

目的　探讨癌基因mdm2和 p2 1H ras在骨巨细胞瘤 (GCT)中的表达及与GCT病理分级和复发的关系。方法　应用SP免疫组织化学方法检测mdm 2和p2 1H ras在 5 2例GCT(GCT按Jaffe分级 :Ⅰ级 15例、Ⅱ级 2 5例、Ⅲ级 12例 )中的表达。结果　 18例mdm 2表达呈阳性 ,阳性率 34.6 % ,7例 p2 1H ras表达呈阳性 ,占 13 .5 %。其阳性表达与病理分级均无显著性相关 (P值分别为 0 .871;0 .6 5 8)。mdm 2和 p2 1H ras在复发和无复发的病例中 ,阳性表达率分别为 6 1.5 %、2 5 .6 %和2 3 .1%、10 .3 %。两者同时阳性表达的有 3例 ,mdm2和p2 1H ras同时过表达与GCT病理分级无显著性相关 (P =0 .75 7) ,而与其复发有显著性相关 (P =0 .0 41)。结论　mdm 2和 p2 1H ras在GCT中的表达与病理分级无关而与其复发有关。     

转化生长因子β1Ⅱ型受体对增生性瘢痕成纤维细胞的影响

目的：探讨转化生长因子β1(TGFβ1)Ⅱ型受体同源序列多肽的生物学功能及其对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响。方法：根据TGFβ1Ⅱ型受体的氨基酸序列人工合成一段短肽，以增生性瘢痕成纤维细胞为靶细胞，分别于蛋白水平和mRNA水平检测该短肽对TGFβ1所诱导的细胞胶原合成的拮抗作用。结果：该短肽可以明显抑制TGFβ1所诱导的增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成量及细胞内Ⅰ型前胶原mRNA的表达。结论：该短肽可能作为TGFβ1Ⅱ型受体的竞争性拮抗剂，抑制或降低了该生长因子对细胞的刺激作用。     

骨巨细胞瘤组织尿激酶型纤溶酶原激活剂系统mRNA的表达与其生物学行为及复发的关系

目的研究骨巨细胞瘤(giant celltumor of bone,GCT)组织尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,u-PA)系统mRNA的表达与GCT病理分级和复发的关系.方法用原位杂交技术检测42例GCT组织u-PA,u-PA受体(u-PAR)及其抑制因子2(PAI-2)mRNA的表达.结果①u-PA,u-PAR,PAI-2 mRNA在GCT组织多核巨细胞(MGC)的阳性率分别为64.3%,71.4%和40.5%;单核基质细胞(MC)的阳性率分别为54.8%,45.2%和9 5%.②Ⅱ、Ⅲ级和复发组GCT的MGCu-PA mRNA与MC u-PA,u-PAR mRNA的表达率均明显高于Ⅰ级(x2分别为8.00,7.82,6.81,P＜0.05)和无复发组(x2分别为5.49,5.54,9.84,P＜0.05);③GCT组织两种细胞间的u-PA mRNA表达(P＜0.05)、MGC u-PAR与PAI-2 mRNA的表达间、MC u-PA与u-PAR mRNA的表达间均呈正相关(x2分别为7.20,8.19,P＜0.05);MGC PAI-2 mRNA的阳性率明显高于MC的阳性率(x2=10.73,P＜0.05).结论GCT组织u-PA,u-PAR mRNA的表达,尤其是在MC中的表达,与骨巨细胞瘤恶性程度密切相关.     

白血病细胞TGFβ1及其受体基因表达与白血病患者血清TGFβ1测定及其意义

目的:研究转化生长因子β_1(TGFβ_1)对白血病细胞增殖抑制作用的机制及急性白血病患者血清TGFβ_1变化及意义。方法:应用逆转录-聚合酶链反应方法检测白血病细胞的细胞因子及其受体基因表达;应用白血病细胞集落试验测定TGFβ_1对HL-60、DAMI、K562细胞增殖的作用;应用ELISA方法测定33例急性白血病患者血清TGFβ_1水平。结果:TGFβ_1对HL-60、K562、DAMI细胞增殖具有明显的抑制作用;白血病细胞系(HEL、HL-60、K562、U937、DAMI、MEG-01、HUT78)及CA均表达TGFβ_1及其受体mRNA。外源性TGFβ_1抑制DAMI细胞IL-6、IL-6R、GM-CSFR及IL-3的基因表达,上调DAMI细胞本身TGFβ_1表达,并诱导DAMI细胞凋亡。白血病患者血清TGFβ_1水平明显减低;患者达完全缓解时,该水平恢复正常;复发时,该水平又趋减低。结论:TGFβ_1是白血病细胞抑制性自泌因子;其抑制作用与其调控白血病细胞的细胞因子与受体表达有关;血清TGFβ_1水平是监测白血病病情转归的一项有价值指标;TGFβ_1作为负调控因子在白血病发病机制中可能起重要作用。