深圳地区手足病肠道病毒5′端非编码区部分基因克隆和序列分析

目的：分析深圳地区手足口病病人肠道病毒（EV）5′端非编码区（5′UTR）部分基因序列，了解本地区手足口病病人EV感染的基因型。方法：设计特异性引物，建立检测EV的RT－PCR方法，对临床疑诊为EV感染的病人的粪便和／或咽拭子、脑脊液标本进行检测，并对5例典型手足口病病人中分离株的PCR阳性扩增产物进行克隆和序列测定。结果：分离出的5株EV5′UTR基因的核苷酸同源性为85.5%－99.3%，与EV71 BrCr原株、CVA9、CVA16和CVB同源性为86.3% -93.3%。结论：深圳地区手足口病EV5′UTR与几种常见的肠道病毒血清型同源性均较高，提示可能存在多种基因型的肠道病毒感染。     

东莞市1例星状病毒核酸检测及分析

目的对星状病毒进行核酸快速诊断并对其部分核酸序列进行测序分析。方法采用RT-PCR、基因测序技术对标本中的核酸进行检测分析。结果 RT-PCR结果表明标本为星状病毒阳性,对PCR扩增产物测序得到了409bp长度的ORF2部分基因序列,经Blast比对发现其为Ⅰ型血清型,与北京分离的一株星状病毒序列（GenBank号FJ755403.1）最为相似,仅有一个C→T的核苷酸变异。但编码的氨基酸并无改变,均为甘氨酸（Gly）。结论应用PCR技术扩增星状病毒特定片段可用于病毒的快速检测,同时对扩增产物测序还可对病毒进行分型,并了解其基因变异情况。     

深圳地区手足病肠道病毒5'端非编码区部分基因克隆和序列分析

目的:分析深圳地区手足口病病人肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'UTR)部分基因序列,了解本地区手足口病病人EV感染的基因型.方法:设计特异性引物,建立检测EV的RT-PCR方法,对临床疑诊为EV感染的病人的粪便和/或咽拭子、脑脊液标本进行检测,并对5例典型手足口病病人中分离株的PCR阳性扩增产物进行克隆和序列测定.结果:分离出的5株EV 5'UTR基因的核苷酸同源性为85.5%～99.3%,与EV71 BrCr原株、CVA9、CVA16和CVB3同源性为86.3%～93.3%.结论:深圳地区手足口病EV 5'UTR与几种常见的肠道病毒血清型同源性均较高,提示可能存在多种基因型的肠道病毒感染.     

江苏省2012年柯萨奇病毒B组3型分离株全基因序列分析

目的探讨2012年江苏省手足口病（HFMD）患者临床样本中分离得到的3株柯萨奇病毒B组3型（CVB3）病毒的全基因序列特点。方法采集江苏省东海县和邳州市2012年HFMD患儿的咽拭子或肛拭子样本16份,经Vero细胞分离培养得到3株CVB3病毒,利用RT-PCR扩增CVB3全长基因。利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树,并对CVB3的毒力位点进行比较。结果扩增得到覆盖CVB3全基因组的3个片段,拼接后为CVB3全基因组,分别命名为DH09Y/JS/2012、DH16G/JS/2012和PZ23Y/JS/2012。同源性分析结果显示,该3株分离株之间同源性为87.6%~98.9%,与原型株（Nancy）的核苷酸同源性分别为80.5%、80.4%和81.2%。3个毒株均属于D2亚型。邳州市分离株和东海县2株毒株VP1区的同源性为91.8%~92.3%,分属于D2a和D2b两个不同分支。3株分离株除5′UTR的GUAA/GCAA模序和VP2的151位氨基酸外,其余毒力位点与近年引起心肌炎、无菌性脑膜炎等重症CVB3流行株一致。结论引起2012年江苏省HFMD的CVB3为D2亚型,不同地区流行D2a和D2b两个分支,此次分离株主要毒力位点与近年来CVB3流行株一致。     

VP4基因鉴定非EV71非CoxA16手足口病病原体漏检的研究

目的探讨肠道病毒VP4基因通用引物PCR诊断非肠道病毒71型( EV71)非柯萨奇病毒A组16型( CoxA16)手足口病( HFMD)病毒方案的准确性。方法通过肠道病毒VP4基因通用引物PCR鉴定阜阳地区非EV71非CoxA16 HFMD病毒时,显示两例病毒分离株为Sabin-1(命名为Fy-01和Fy-02株)。分别采用引物EVP4/Q8和VP1特异性引物对Fy-01和Fy-02分离株进行鉴定。结果采用VP4基因PCR扩增产物测序证实,两例病毒分离株为Sabin-1,而采用EVP4/Q8引物PCR扩增Fy-01分离株却存在异常的扩增条带,PCR扩增产物测序结果为柯萨奇病毒A组10型( Cox-A10);将VP4基因PCR产物制备成克隆载体挑选多个单克隆测序结果显示,Fy-01分离株既存在Sabin-1 VP4基因,又存在CoxA10 VP4基因,证实为两种毒株混合感染。结论临床诊断为非EV71非CoxA16 HFMD的病例,如病原学诊断仅采用VP4基因PCR产物测序,特别是针对多种肠道病毒混合感染引起的HFMD,其结果并不完全可靠。     

柯萨奇病毒与病毒性心肌炎临床研究新进展

柯萨奇病毒（CV）是正链RNA病毒,为小RNA病毒科肠道病毒属。Dalldorf和Sickles在1948年对脊髓灰质炎进行调查时发现该病毒柯萨奇病毒基因与真核生物的mRNA相似。病毒RNA5＇端有一共价结合病毒编码的小蛋白Vpg,3＇端有聚（A）属。柯萨奇病毒感染人体可引起急性或慢性心肌炎,少数患者可表现为进行性心力衰竭、心律失常或猝死。根据流行病学调查显示,45％-60％心肌炎与近期或复发的CVB3感染有关。     

人巨细胞病毒UL137基因在临床低传代分离株中的多态性研究

目的：研究人巨细胞病毒（HCMV）UL137基因在先天巨细胞病毒感染临床低传代分离株中的多态性。方法：选择经荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA为阳性的临床分离株进行涵盖UL137全序列的UL136，UL138基因全序列PCR扩增，对扩增阳性的标本进行全序列的测序，核实测序结果，拼接出UL137基因编码序列，进行相关分析。结果：经分析获得22株HCMV临床分离株UL137ORF核苷酸序列，核苷酸变异分布于整个编码区，但主要集中在5’端220—290bp处，均为核苷酸碱基替换，无插入及移码突变。在UL137预测编码蛋白氨基酸序列中，新增2个半胱氨酸位点，导致17株临床分离株在71-76位氨基酸出现了N相连豆蔻酰化位点（MYR）的新增，及第90～92位氨基酸硫化cAMP位点的相应缺失。结论：HCMVUL137基因在临床低传代分离株中高度保守，但存在一定的多态性。     

简并PCR在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的 探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR（CODEHOP-PCR）在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法 以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16 手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段,经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序,与Genbank提供的序列比较,确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明,所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上,其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定,与传统的病毒分离及血清中和试验相比,具有更快速、准确的优点。     

用高度保守区引物和套式PCR扩增丙型肝炎病毒

采用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法，以具有高度保守性的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ５＇端非编码区引物对，扩增１０例输血后肝炎血清，８例（８０％）阳性。并将逆转录与第一轮ＰＣＲ结合连续进行，使操作简便有效。间接证明了ＨＣＶ上海株与世界若干地区ＨＣＶ株５＇端非编码区核酸序列具有高度同源性和保守性。     

简并PCR技术在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的 探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR（CODEHOP-PCR）在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法 以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16 手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段，经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序，与Genbank提供的序列比较，确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明，所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上，其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定，与传统的病毒分离及血清中和试验相比，具有更快速、准确的优点。     

1株肠道病毒71型南京分离株的全基因组序列的测定及遗传进化分析

［摘要］目的: 对肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）南京分离株EV71-NJ2012全基因组核苷酸序列进行测定,并与基因库中的代表性序列进行分析比对。方法: 登录基因库,选取不同国家和地区的EV71全基因组序列,设计8对覆盖病毒整个基因组且首尾部分重叠的引物,采用RT-PCR扩增出8个基因片段,通过测序和拼接获得全基因组序列,并与国内外其他EV71分离毒株一起用MEGA 4.0软件进行进化树分析,用DNAStar进行同源性分析。结果： EV71-NJ2012株的基因组长度为 7 404 bp, 其中5′非编码区(UTR)长742 bp, 3′UTR长82 bp,病毒基因组开放阅读框(ORF) 全长6 582 bp, 编码一个含有2 193个氨基酸残基的多聚蛋白。病毒序列在分型上属于C4a基因型,与上海株的核苷酸同源性最近,而与我国台湾、湖北等分离株的核酸序列差异较大。结论： EV71-NJ2012株基因组的组成和结构符合肠道病毒特征,与上海株亲缘关系最近,而与我国台湾、湖北分离株的差异较为明显。EV71-NJ2012株可能与上海株来源于EV71病毒株的同一种系。     

云南省新型肠道病毒EV80的基因特征分析简

目的对云南省3株新型肠道病毒EV80的基因特征进行分析。方法对3株EV80病毒VP1区基因进行RT—PCR和基因测序,并在NCBI、EBI和DDBJ三大基因库搜索EV80VP1区基因序列,用MEGA5．0软件计算所得序列的核苷酸和氨基酸相似性,并做基因树进行基因特征分析。结果共检索到35株EV80的VP1区基因序列,去除序列太短不能分析的2株,对云南株和基因库中共33株进行了分析。33株病毒可分为4个基因型,原型株USA—CA67—10387单独聚成一组,为基因型A,云南株和山东株同属基因型D,为中国特有的基因型。结论虽然目前全世界新型肠道病毒EV80的分离数不多,但其地理分布较为广泛,不同国家、地区的毒株大都为不同的基因型,具有基因多样性特点。本研究对今后中国开展新型肠道病毒EV80的分子流行病学研究和传播链的发现和疫情处置提供了实验室基础。     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

2011年济南市某污水河中肠道病毒的分离鉴定与序列分析

目的 监测济南市区地表河水中的人类肠道病毒(HEV),分析其基因特征。方法 于2011年5、6、7月份对流经济南市中心城区的西泺河各采集1份河水标本,经过阴离子膜吸附的方法浓缩后,接种RD、HEp-2和L20b细胞进行病毒分离。测定分离株VP1编码区序列并进行序列分析。结果 共分离到HEV 9株,其中埃可病毒6型(Echovirus 6,E6)4株,柯萨奇B2病毒(Coxsackievirus B2,CVB2)5株。VP1核苷酸序列分析显示,4株E6病毒与2010年山东省临沂市脑膜炎病例分离株的同源性较高(95.9%~96.7%),提示当地有发生E6引起的脑膜炎病例的可能性;与济南市2010年污水分离株的同源性为94.5%~99.7%。5株CVB2病毒之间有较高的核苷酸同源性(98.4%~100%),与往年山东省急性弛缓性麻痹病例分离株之间同源性为80.9%~95.2%。结论 生活污水的排入河可作为HEV环境监测的采样点,我国无专门HEV病例监测系统,环境监测是了解一个地区HEV流行的重要途径。     

柯萨奇病毒B5巢式RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种快速、灵敏、特异的柯萨奇病毒B5(CVB5)检测方法。方法:根据GenBank发表的CVB5河南分离株全基因组序列,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测CVB5的巢式RT-PCR方法。将已测得TCID50的病毒标准株进行10倍梯度稀释后用上述方法检测,以评价该方法的灵敏性;将5株不同的CVB5毒株和EV71等4株其他肠道病毒毒株及阴性对照用该方法进行扩增,以检测其特异性。用建立的巢式RT-PCR方法对52份病毒性脑炎病例样本进行检测。结果:该方法对CVB5的两轮PCR扩增敏感性分别为10TCID50和10-4TCID50;所有CVB5毒株用该方法扩增结果均为阳性,所选其他肠道病毒扩增结果均为阴性。52份临床病例样本中检出10份CVB5阳性,阳性率为19.23%。结论:所建立的CVB5巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度。     

银川市2016—2022年手足口病柯萨奇病毒A6型分离株VP1基因特征分析

目的 分析银川市2016—2022年引起手足口病的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)VP1的基因特征,为手足口病的防治工作提供有效的参考依据。方法 收集2016—2022年银川市手足口病所有CV-A6核酸呈阳性的标本进行病毒分离培养,应用一步法聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增其VP1区完整基因核酸片段进行核苷酸序列测定,利用测序结果进行系统发育树构建、同源性分析及氨基酸突变位点分析。结果 2016—2022年银川市共分离到手足口病CV-A6型毒株90株,测序后成功获得CV-A6 VP1区全长序列的毒株83株。完整VP1区基因均由915个核苷酸组成,编码305个氨基酸。系统发育分析显示,2016—2022年银川市83株CV-A6分离株均属于D3基因亚型的D3a分支;同源性分析表明,银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株(AY421764-USA-1949)之间核苷酸相似性为82.1%～84.1%,氨基酸相似性为76.2%～80.5%,遗传距离较远;银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株的VP1区氨基酸序列比较发现32个氨基酸位点出现变异。结论 2016—2022年银川市...     

广州地区HCMV临床病毒株UL137基因的结构特征与多态性

【目的】研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性。【方法】从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株，经多重PCR鉴定后分别命名为HCMVD2、D3和D52。对3株临床分离株进行HCMVUL137基因全序列PCR扩增，PCR产物纯化后进行基因克隆，构建HCMVUL137-pMD18-T重组质粒；基因测序；将HCMVUL137基因序列呈报GenBank，并进行基因生物信息学分析。【结果】成功从广州地区新生儿感染HCMV患儿体内分离3株HCMV临床病毒株。克隆测序后呈报GenBank并被收录，收录序列号分别为：DQ180388、DQ180376、DQ180360。通过序列分析，结果显示低传代分离株UL137基因DNA序列高度保守，同源性在96．91％～100％之间．其变异均为碱基替换：编码蛋白均由96个氨基酸残基组成，同源性在90．63％～100％之间，超半数的变异发生在第61～81位氨基酸残基之间：编码蛋白翻译后修饰位点包括PKS、MYS、cAMPs三类，其中4个PKS和44～49位的MYS高度保守，cAMPs位点仅在5株病毒出现；编码蛋白等电点在11．50～12．00之间，呈强碱性。【结论】广州地区临床低传代分离株HCMVUL137基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列极为保守，但仍存在-定多态性。提示HCMVUL137ORF可能是-个具有重要功能的基因。     

儿童结核病结核分枝杆菌临床分离株中esxA、fbpB、Rv2660c基因多态性研究

目的 对抗原编码基因esxA、fbpB、Rv2660c进行测序,了解esxA、fbpB、Rv2660c的基因多态性.方法 选取135株结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株,运用PCR方法扩增目的基因esxA、fbpB、Rv2660c并进行测序,与结核标准株H37 Rv基因序列以及从免疫表位数据库(immune epitope database,IEDB)中查询到的表位序列进行对比,分析esxA、fbpB、Rv2660c基因序列中的变异特征.结果 在135株菌株中,esxA、Rv2660c序列暂未发现基因变异.fbpB共66株(48.89％)发现了基因变异,5个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点共造成8个(14.81％)T细胞抗原表位以及9个(24.32％)B细胞抗原表位序列的多态性.fbpB基因的dN值为0.000 120,dS为0.002 126,其中T细胞表位区与非T细胞表位区的dN值分别为0.000 067和0.000 408,dS分别为0.002 382和0.000 470,B细胞表位区dN和dS值分别为0.000 063和0.002 380,非B细胞表位区dN和dS均为0.结论 esxA、Rv2660c基因序列较保守,fbpB存在基因多态性,预测会对蛋白Ag85B的免疫功能造成影响,从而影响H56的免疫有效性.