多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

目的利用多重聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种可以同时快速检测肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法。方法根据EPEC的eae基因、EIEC的ipaH基因、EHEC的stx1基因筛选设计引物,建立多重PCR检测体系,并对PCR反应体系和条件进行优化。结果设计的3对PCR引物均能特异地扩增出相应的目的基因,该多重PCR体系能同时检测3种目的菌,特异度强。结论初步建立了一种能够同时快速检测3种致泻性大肠埃希菌的多重PCR检测方法,可用于食品安全及食物中毒事件的快速筛查。     

基于荧光探针溶解曲线分析技术的HPA 1～5,15等位基因检测方法的建立

目的结合多重聚合酶链式反应(PCR)和荧光探针溶解曲线单核苷酸多态性(SNP)分型技术,建立一种方便准确的HPA等位基因分型方法。方法针对HPA 1~5,15这6种常见的HPA亚型等位基因设计多重PCR引物及SNP探针,通过多重PCR同时扩增6个等位基因目标片段并利用荧光探针的溶解温度变化区分不同SNP位点。结果多重PCR可同时扩增6个等位基因的目标片段,并通过溶解峰的Tm值变化区分SNP位点,结果与PCR-SSP位点相比较有相同的准确度,且操作更为简便,无需PCR后续电泳步骤,减少污染风险。结论成功建立了一种结合多重PCR和荧光探针溶解曲线分析技术的HPA 1~5,15等位基因检测方法。     

中国南京地区汉族人群Colton血型等4个血型系统稀有血型的初步调查

目的:调查和分析中国南京地区部分汉族人群Colton、Diego、Kell、Yt等4个稀有血型抗原的分布情况,以解决稀有血型病人的临床用血问题,并进一步充实国家稀有血型献血者资料库。方法:随机选择南京地区符合《献血者健康检查要求》的2 015名无偿献血者全血标本,提取DNA,采用PCR及多重PCR的方法检测Kell系统的K+和Kpc+、Yt系统的Ytb+、Colton系统的Cob+以及Diego系统的Dia+b+、Dia+b-血型抗原基因。结果:在2005例献血者中筛选出K+基因1例;在2 015例献血者中筛选出Ytb+8例和Dia+b+100例、Dia+b-2例,未筛查出Kpc+与Cob+。结论:中国南京地区汉族人群中K+、Ytb+和Dia+、Dib+基因频率分别为0.0003、0.0013和0.0258、0.9742,在现有筛查人群中未发现Kpc+与Cob+抗原存在。     

等位基因特异性PCR结合金磁微粒免疫层析检测膀胱癌患者尿液中TERT突变

目的建立可检测人尿液DNA中端粒酶逆转录酶(TERT)启动子区域突变的方法。方法设计等位基因特异性PCR引物,利用温度梯度PCR确定等位基因特异性PCR程序,利用金磁微粒检测板进行扩增产物检测。收集34例膀胱癌患者的尿液,提取DNA,利用该文建立的等位基因特异性PCR结合金磁微粒免疫层析方法检测TERT启动子区域突变。结果建立了结合等位基因特异性PCR和金磁微粒免疫层析的TERT启动子区域C228T和C250T突变检测方法。34例膀胱癌患者尿液中8例患者存在C228T突变,1例患者存在C250T突变。结论该研究建立了TERT启动子区域C228T和C250T突变检测方法,可应用于膀胱癌患者尿液DNA突变检测。     

1种人类血小板抗原1～17及Cab等位基因全血直接检测方法的建立

目的 结合靶序列富集多重聚合酶链反应(TEM-PCR)、荧光探针溶解曲线SNP分型和血液直接PCR技术,建立一种方便、准确的人类血小板抗原(HPA)等位基因分型方法。方法 TEM-PCR方法设计HPA1~17、Cab这18种HPA亚型等位基因的引物及荧光探针,使用血液直接PCR酶同时扩增血液标本中的18个等位基因目标片段,并利用荧光探针的溶解温度变化区分不同SNP位点。结果 TEM-PCR可同时扩增18个等位基因的目标片段,并通过溶解峰的Tm值变化区分SNP位点,结果与序列特异性引物聚合酶链反应位点相比较有相同的准确度,且操作更为简便,无需提取血液基因组DNA,无PCR后续电泳步骤,减少污染风险。结论 成功建立了1种基于TEM-PCR,血液直接PCR和荧光探针溶解曲线分析技术检测HPA1~17,Cab等位基因。     

用高保真DNA聚合酶介导的PCR检测β地中海贫血热点突变

目的用高保真DNA聚合酶介导的PCR检测β地中海贫血基因热点突变。方法选取已知中国人群β珠蛋白基因CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26热点突变位点为检测靶点,分别设计3'末端与野生型基因位点或突变型基因位点完全配对的引物,并用硫化磷酸修饰,进行高保真DNA聚合酶介导的引物延伸反应。用多重PCR反应体系检测临床已知分别含CD26和TATAbox-28突变热点患者的DNA标本。结果对野生模板而言,仅有野生型等位基因相关引物有产物产生,而突变型等位基因位点特异性引物无产物产生。反之,使用突变模板,仅突变型等位基因位点相关引物有产物产生,而野生型等位基因位点特异性引物无产物产生。高保真DNA聚合酶介导的多重引物延伸反应筛查含有CD26或TATAbox-28突变的患者DNA标本时显示,突变引物混合物只有相应突变位点的产物产生,而野生引物混合物则有除突变位点以外的其他5个位点的产物产生。结论建立了基于高保真DNA聚合酶的筛查β地中海贫血基因热点突变的PCR技术。     

性病病原体多重聚合酶链反应检测方法的建立和验证

目的建立同时检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体和单纯疱疹病毒-2致病微生物的多重聚合酶链反应（PCR）方法,用于四种性病的诊断和治疗监测。方法根据淋球菌外膜孔蛋白基因、沙眼衣原体基因、解脲支原体尿素酶基因和单纯疱疹病毒-2的DNA聚合酶基因序列,各设计一对特异性引物,优化反应体系和条件进行多重PCR反应。结果4对引物分别扩增出327、167、426、391bp的目的条带,并且特异性强,与其他非目的病原体基因不发生反应。结论本研究建立的多重PCR方法为相关病原体的快速检测提供方法。     

EGFR外显子19、21突变等位基因特异性PCR检测方法的建立

目的 建立一种人表皮生成因子受体(EGFR)外显子19、21突变等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)检测方法.方法 根据EGFR外显子19、21野生型和突变型设计特异性引物,提取健康人和非小细胞肺癌患者血中有核细胞的基因组DNA作为模板,采用等位基因特异性聚合酶链式反应扩增EGFR外显子19、21突变基因.结果 特异性引物可以扩增EGFR外显子19缺失突变的2种类型和外显子21的错义突变.结论 等位基因特异性PCR法可以用于检测人EGFR外显子19、21突变.     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8 h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为:沙门菌104cfu/mL,志贺菌102cfu/mL,副溶血性弧菌104cfu/mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

多重实时荧光PCR快速检测沙门菌和单增李斯特菌

目的 建立可同时检测沙门菌、单增李斯特菌的双重实时荧光PCR快速检测方法,并应用于食品样品的检测.方法 根据GenBank上下载的沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因的保守区序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立并优化双重实时荧光PCR反应体系.对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行评估,并应用于食品标本...     

弥散黏附性大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及其在感染性腹泻患者中的流行情况

目的 建立一种快速检测弥散黏附性大肠埃希菌（DAEC）的普通多重PCR方法,了解DAEC在腹泻患者中的流行情况。方法 根据DAEC黏附基因afaB、afaC、afaD、daaE及16S rRNA基因rrs,建立4重PCR反应体系,对PCR引物、反应体系和反应条件进行优化,评价敏感性和特异性,并应用于389份腹泻患者粪便标本的筛查。结果 4重PCR反应可以特异性扩增DAEC菌株afaB/C、afaD、daaE基因片段,除2株肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）外,检测引物对其他致泻性大肠埃希菌及常见肠道病原菌均无特异性扩增,此多重PCR方法的检测下限可达3.20 101 CFU/反应（8.01 103 CFU/ml）。利用本研究建立的多重PCR方法对腹泻患者粪便标本进行检测,发现DAEC菌株分离率为6.2%（24/389）。结论 本研究建立的多重PCR方法可用于DAEC菌株的快速鉴别,也可用于人粪便标本DAEC的初步筛查。     

实时荧光PCR同时检测沙门菌和单核细胞增生利斯特菌

目的建立一种同时检测沙门菌、单核细胞增生利斯特菌的快速检测方法。方法分别针对沙门菌invA基因、单核细胞增生利斯特菌hlyA基因设计引物和探针，进行多重实时荧光PCR（TaqMan）检测。结果经过对多重实时荧光PCR反应条件的优化，对沙门菌、单核细胞增生利斯特菌检测的灵敏度达到11.5fg和25．5fg。结论实时荧光PCR能够有效地同时检测沙门菌、单核细胞增生利斯特菌，并且该方法操作简便、快速，具有良好的灵敏性和特异性。     

B族链球菌快速筛查及耐药性检测多重PCR体系构建

目的建立B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS)鉴定及克林霉素、红霉素耐药性检测的多重PCR反应体系,为快速筛查和临床治疗提供依据。方法以cfb基因、ermB基因和linB基因为靶点设计引物,构建B族链球菌快速筛查和克林霉素、红霉素耐药检测的多重PCR反应体系,并对反应条件进行优化。结果成功构建GBS筛查和药敏的PCR反应体系,56℃为最佳退火温度。结论本研究建立的GBS鉴定、耐药性检测为一体的多重PCR体系,对围产期GBS筛查、临床治疗具有重要意义。     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应（PCR）技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物，进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系，测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8h内同时检测3种目的菌，通过检测其他9种常见食源性致病菌，结果表明该方法特异性好，多重PCR检测灵敏度分别为：沙门菌10^4cfu／mL，志贺菌10^2cfu／mL，副溶血性弧菌10^4cfu／mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

多重PCR方法鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌

目的 建立一种快速检测和鉴定六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法。方法 根据六类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的毒力基因eae、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、aggR、ipaH、afaD及16S rRNA基因rrs建立多重PCR反应体系,优化引物浓度、PCR反应条件等,评价该方法的特异性和灵敏度,并用该方法鉴定本实验室保存的174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌,将结果与单重PCR、本实验室已建立的鉴定五类致泻性大肠埃希菌和志贺菌的多重PCR方法结果进行对比。结果 10对PCR引物均可特异性扩增相应基因片段。该反应体系对174株致泻性大肠埃希菌和24株志贺菌的鉴定结果与单重PCR检测结果一致,本研究的多重PCR检测下限可达4.56 101 CFU/反应(1.14 104 CFU/ml)。结论 本研究采用毒力基因及内参照基因建立的多重PCR方法可在一个反应体系中鉴定和区分致泻性大肠埃希菌和志贺菌,为临床快速检测、疾病预防控制实验室筛查、腹泻的暴发溯源等提供了方便快捷的技术支持。     

多重PCR诊断线粒体突变聋病的临床应用价值

目的采用多重PCR和多重限制性内切酶法同时检测线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）1555^G、3243^G,7445^G三个突变位点，探讨多重PCR法在线粒体突变聋病中的诊断价值。方法收集311例耳聋患者外周血标本，提取DNA模板，以三对引物在同一PCR反应体系中进行多重PCR扩增；产物在同一体系中用三种相应的限制性内切酶分析，同时对扩增产物进行mtDNA基因序列测定。结果采用本法检测出mtDNA1555^G。点突变20例，7444^A点突变1例，结果与测序相符。结论多重PCR和酶切法可同时检测多个mtDNA突变位点，利用这一方法可快速简捷地诊断线粒体突变聋病，便于临床推广应用。     

基于双启动寡聚核苷酸引物的沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌多重实时荧光PCR方法的建立

目的建立多重实时荧光PCR同时检测沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌的方法。方法通过设计针对沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌和耶尔森菌的双寡聚核苷酸引物,来建立这4种病原体的多重PCR检测体系。结果建立的多重PCR体系可同时特异性扩增4种病原体的DNA片段。沙门菌和弯曲杆菌的特异性和敏感度都是100.0%,志贺菌和耶尔森菌的敏感度是100.0%,特异性分别是99.3%和98.6%。最低检测限均为103 copies/mL。结论该体系可快速、有效、准确检测出样品中4种病原体的存在,可用于肠胃道相关病原体感染的辅助评价。     

脓毒症常见病原菌多重实时PCR检测方法的建立

目的 建立可同时检测脓毒症患者血液中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的多重实时PCR方法。方法 根据各病原菌基因组保守序列设计引物和探针,建立多重实时PCR检测方法。对建立的多重实时PCR检测方法进行特异性、敏感性和灵敏度分析,并使用该法对112份脓毒症血培养阳性标本进行验证。结果 成功建立脓毒症常见病原菌的多重实时PCR检测方法。此方法特异性、敏感性良好,灵敏度达10-5 ng/l,与标准检测方法（血培养加生化鉴定）相比,缩短了20 h。112份临床血培养阳性标本中,目标病原菌83例,多重实时PCR检出80例阳性;非目标病原菌29例,多重实时PCR检测均为阴性。检测结果显示,该方法特异性达100%,敏感性达96.39%。结论 该多重实时PCR检测方法具有快速、高效、灵敏、特异的优点,可用于临床重症监护室患者血液常见感染病原菌的诊断。     

多重PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157：H7

目的 建立一种快速、特异的检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌株的多重PCR方法。 方法 针对O157:H7菌株的O157、H7抗原特异基因rfbE O157、fliC H7以及stx1、stx2、eaeA和hlyA四种毒力基因设计相应引物,在同一扩增体系中进行PCR反应,通过优化多重PCR 反应条件和循环参数,建立检测O157:H7菌株的多重PCR方法,并测定其特异性和灵敏度。 结果 6 对特异性引物各自扩增相应的基因片段,检测结果与常规PCR 获得的结果一致。细菌纯培养物的检测灵敏度为1.33×10⁴ CFU。 结论 该多重PCR方法能在一次检测中同时反映待测菌株是否为肠出血性大肠埃希菌O157:H7及其携带毒力基因的情况,可为O157:H7大肠埃希菌感染的诊断及流行病学调查提供一种简便、快速的检测手段。     

连接酶检测反应法检测乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药突变的可行性

目的探讨依据寡核苷酸等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)扩增及连接酶检测反应(LDR)方法检测乙型肝炎病毒(HBV)4种核苷(酸)类似物耐药突变的可行性。方法以基因库公布的981条HBV基因序列为基础,针对拉米夫啶、替比夫啶、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读。应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,同时采用荧光PCR、焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性。结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBV DNA>106copy/mL患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致;LDR法与荧光PCR法检测结果一致率达83.3%(10/12)。结论血清HBV DNA>106 copy/mL时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗。