口服型VEGFR 2 DNA疫苗的研制及其对小鼠的免疫效应

摘 要 目的: 血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial factor recepto-2,VEGFR-2)在肿瘤生长和转移过程中起着重要作用，制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗并研究其生物免疫效应。方法：采用基因重组技术构建VEGFR-2胞外区基因表达载体pcDNA3.1-VR-2， DNA序列分析证实后，脂质体法转染COS-7细胞， Western blotting检测其VEGFR蛋白表达；以氯化钙法将pcDNA3.1-VR-2转化减毒沙门菌SL3261，制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗。口服型疫苗免疫C57BL/6小鼠，ELISA法检测免疫后小鼠外周血VEGFR-2抗体水平，MTT法检测小鼠脾淋巴细胞对小鼠血管内皮细胞的体外杀伤活性。结果：成功制备口服型VEGFR-2 DNA疫苗。ELISA法检测显示，疫苗组小鼠抗体滴度随着免疫时间和免疫次数的增加而增高，在免疫6周后产生了高水平抗VEGFR-2 IgG类抗体(1.07±0.018)，明显高于生理盐水组(0.14±0.033)和质粒对照组(0.14±0.038)，差异均有统计学意义（F=853.17，P=0.000）。MTT法检测显示，疫苗组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞MS1的杀伤率随着效靶比的增加而增加，在效靶比8∶1时CTL活性(89.38±1.51)明显高于生理盐水组(15.17±2.54)和空质粒对照组(12.99±4.31)，差异有统计学意义(F=315.42,P=0.000)。结论：成功制备了口服型VEGFR-2 DNA疫苗，该疫苗可激活小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫，为进一步抗肿瘤研究奠定了基础。     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

表达VEGFR-2的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗诱导特异性抗胶质瘤血管免疫应答

背景与目的:血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)及其主要受体血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelialgrowth factorreceptor-2,VEGFR-2)在肿瘤新生血管和肿瘤基质形成过程中起着重要作用。本研究的目的是观察表达鼠VEGFR-2的重组减毒沙门氏疫苗菌诱导的抗血管特异性免疫应答及抗胶质瘤作用。方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGFR2,通过电转化法将pcDNA3.1-VEGFR2导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,经由胃管饲予C57BL/6J小鼠,对小鼠进行基因免疫。采用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗VEGFR2-IgG抗体,分离免疫小鼠的脾细胞,分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lym phocyte,CTL)应答。用携带pcDNA3.1-VEGFR2的重组沙门氏菌免疫治疗胶质瘤荷瘤小鼠,通过测量荷瘤小鼠肿瘤大小,检测肿瘤微血管密度及肿瘤细胞凋亡,评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。结果:重组疫苗菌免疫后小鼠产生了高水平的抗VEGFR2-IgG抗体,诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对VEGFR2的特异性CTL活性。重组疫苗菌的免疫能够明显抑制胶质瘤的生长。NaH CO3对照组、载体对照组、重组疫苗菌组的平均微血管密度分别为26.5±5.8、27.2±4.5、8.8±1.9,平均凋亡细胞数分别为4.41.2、3.     

TCRγ独特型DNA疫苗诱导特异性免疫反应的实验研究

目的：观察TCRγ独特型DNA疫苗诱导BALB／c小鼠的抗人类Jurkat淋巴肿瘤免疫反应的情况。方法：碱裂解法大量提取质粒，制备DNA疫苗。选用16只BALB／c小鼠随机分为pcDNA3组、pcDNA3／TCRγV1组，双侧股四头肌内注射疫苗免疫，于第0、2、4周各免疫1次，共3次。每次免疫前及免疫开始后至第8周取鼠血，用间接免疫荧光法检测小鼠血清中抗体生成情况；RT-PCR法检测重组质粒在小鼠肌肉中的mRNA表达。结果：pcDNA3／TCRγV1组小鼠血清中全部产生了特异性抗独特型抗体，抗体滴度在第4周开始增高，第6周时达到高峰(1：160)。在pcDNA3／TCRγV1组小鼠中用RT—PCR法检测到了重组质粒在肌肉中的mRNA表达。结论：TCRγV1独特型DNA疫苗可以诱导小鼠产生特异性抗淋巴瘤细胞独特型抗体。     

口服DNA疫苗pcDNA3.1+/flk-1(n1-7)抗小鼠结肠癌肝转移

背景与目的：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其主要受体血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）在肿瘤血管生成过程中起着重要作用。VEG—FR-2在鼠中为flk-1，本研究以减毒沙门氏菌SL3261为载体制备了抗肿瘤血管生成口服DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（n1-7），研究该疫苗抗小鼠结肠癌肝转移的作用，并探讨其可能的作用机制。方法：RT—PCR法扩增鼠VEGFR-2胞外cDNA全长序列flk-1（n1-7），构建重组质粒pcDNA3．1＋／flk-1（n1-7）。将重组质粒转化减毒沙门氏菌SL3261，制备成以SL3261为载体的口服DNA疫苗。将18只小鼠随机分组，口服接种疫苗两周后，用CT-26细胞建立结肠癌肝转移动物模型，15d后处死小鼠，体视学方法计数肝脏的肿瘤结节数目。流式细胞仪检测小鼠外周血CD4^＋细胞和CD8^＋细胞变化。结果：构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）／flk-1（n1-7），制备成以SL3261为载体的口服DNA疫苗pcD—NA3．1（＋）／flk-1（n1-7）。疫苗组小鼠肝脏内的肿瘤转移病灶明显低于对照组，P〈0．05。结论：成功构建了重组质粒pcDNA3．1（＋）／flk-1（n1-7），制备成以SL3261为载体的口服DNA疫苗pcDNA3．1（＋）／flk-1（n1-7）。这种疫苗能抑制小鼠结肠癌的肝脏转移。     

小鼠去信号肽AFP/DC疫苗体外抗肝癌免疫活性的检测

目的构建Balb/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突状细胞(DCs)中表达,观察其抗肝癌的免疫活性。方法构建AFP1cDNA和AFP2cDNA,真核表达载体,体外转染DC,制备AFP1-DC和AFP2-DC疫苗,以ELISA、MTT方法等检测其免疫活性。TUNEL法检测肝癌细胞凋亡情况。结果所构建的真核表达质粒PcDNA3.1( )/AFP1和PCDNA3.1( )/AFP2在小鼠树突状细胞中获得稳定高效表达,其中PcDNA3.1( )/AFP2明显刺激T细胞增殖,刺激指数(SI)明显高于空质粒组,AFP2/DC疫苗诱导出肿瘤特异性杀伤肝癌细胞活性明显高于空质粒组。结论成功地构建了真核表达载体PcDNA3.1( )/AFP1和PcDNA3.1( )/AFP2,AFP2/DCS能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应,其机制可能与诱导肝癌细胞凋亡有关。     

地方株HPV16E7基因疫苗诱发的小鼠免疫反应

目的评价地方株HPV16E7基因疫苗诱导的免疫反应。方法从先期构建的地方株HPV16E7基因重组质粒pGEM-T-E7经限制性核酸内切酶酶切,获得E7基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建地方株pcDNA-E7基因疫苗,转染CHO细胞,通过IFA试验验证E7蛋白的表达。用pcDNA-E7肌注方法免疫6周龄BALB/c小鼠,同时设pcDNA空载体为阴性对照,于第1天、第15天和第43天共免疫3次,用IFA和MTT法分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答。结果pcDNA-E7免疫小鼠后能检测出特异的抗体,而原载体免疫后不能产生特异抗体;但2组刺激淋巴细胞增殖的能力差异不显著。结论地方株HPV16E7基因疫苗可诱导产生小鼠免疫反应。     

口服VEGFR2 DNA疫苗抗小鼠Lewis肺癌血管生成的实验研究

背景与目的血管内皮生长因子(VEGF)及其主要受体血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)在肿瘤新生血管和肿瘤基质形成过程中起着重要作用。本研究的目的是观察口服VEGFR2 DNA疫苗抗C57BL/6小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤生长的作用,并探讨其可能的作用机制。方法将重组DNA疫苗对小鼠进行免疫,通过观察小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤大小,记录各组小鼠离体肿瘤湿重,检测移植瘤微血管密度(MVD)及血液CD3 、CD8 T细胞水平,评价重组疫苗的抑瘤作用。结果疫苗组、空质粒组、生理盐水组的MVD分别为1.75±1.07、6.89±2.52、7.57±3.75,肿瘤湿重分别为(2.05±1.32)、(4.83±1.47)、(5.12±1.02)g,疫苗组与其它两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。接种肿瘤后,疫苗组CD3 T细胞仍维持较高水平,其它两组明显下降(P<0.05);疫苗组CD8 T细胞水平较其它两组明显升高(P<0.05)。结论口服VEGFR2DNA疫苗对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的生长具有较强的抑制作用。该疫苗可能是通过杀伤肿瘤内皮细胞、抑制血管生成而起到抗肿瘤生长的作用。     

磷酸钙纳米颗粒修饰的甲胎蛋白和树突状细胞疫苗对小鼠皮下移植瘤的抑制作用

目的 探讨转染小鼠带有信号肽的AFP_1 cDNA和去掉信号肽的AFP_2 cDNA树突状细胞(DC)在体外的免疫活性,以及其对Balb/c小鼠皮下移植瘤的抑制作用.方法 应用磷酸钙纳米颗粒将带有信号肽的AFP_1 cDNA和去掉信号肽的AFP_2 cDNA 真核表达载体pcDNA3.1转染DC,将DC疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,采用酶联免疫吸附(ELISA)法,检测上清液中干扰素γ(IFN-γ)的表达情况.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,检测AFP_1/DC和AFP_2/DC刺激同基因小鼠脾淋巴细胞增殖能力及诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤能力.观察AFP_1/DC和AFP_2/DC对Balb/c小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用.结果 AFP_2/DC能明显促进脾淋巴细胞增殖并提高CTL的特异性杀伤作用.AFP_1/DC和AFP_2/DC瘤内注射均可显著抑制肝癌移植瘤的生长,但AFP_2/DC的抑制作用更明显,治疗2周后,AFP_2/DC组小鼠肿瘤体积为(726.7±298.2)mm3,明显小于AFP_1/DC组[(1486.2±457.2)mm~3]和空质粒对照组[(2137.2±547.2)mm~3,P<0.05].AFP_2/DC组和AFP_1/DC组的抑瘤率分别达79.2%和39.7%,而空质粒对照组和空白对照组的抑瘤率为0.AFP_2/DC组和AFP_1/DC 组小鼠的生存时间分别为(58.5±4.2)d和(45.2±4.8)d,较空质粒对照组[(30.6±6.2)d]显著延长(P<0.05).结论 AFP_2/DC 疫苗在体外能够诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫效应,在体内具有抑制Balb/c小鼠皮下移植瘤生长的作用.     

PML-RARα-hIL-2DNA疫苗诱导BALB／C小鼠的细胞和体液免疫应答

目的分析PML-RARα融合基因疫苗诱导小鼠特异体液和细胞免疫应答情况。方法用成功构建的重组质粒（pIRES-PML-RARα-hIL-2）免疫小鼠后，分别利用ELISA法检测小鼠血清中INF-γ生成情况；LDH释放法检测小鼠脾细胞特异性CTL细胞针对APL细胞株NB4的杀伤率；用间接免疫荧光法检测血清中抗PML-RARα抗体。结果免疫后第7周时，小鼠血清中INF-γ含量、抗PML-RARα抗体及脾脏CTL细胞针对NB4的杀伤率均高于对照组。结论所构建的pIRES-PML-RARα-hIL-2重组质粒可诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

胰头癌手术切除可能性的术前评价

目的通过总结胰头癌病人的临床表现和影象学检查结果来评价手术切除的可能性。方法总结32例胰头癌病人的临床表现和CT、磁共振（MRI）检查结果,判断肿瘤是否已发生邻近浸润或远处转移,以此来评价其手术切除的可能性。结果在22例作CT检查的病例中,判断正确的为17例,准确率为77．3%。作MR检查9例,全部判断正确,准确率为100%。结论某些特殊的临床表现和CT、MR检查对判断肿瘤是否发生邻近浸润或转移有较大价值,为术前评价手术切除的可能性提供依据。     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。