牛脱细胞肌腱基质的制备方法研究

目的:探究牛肌腱组织脱细胞的方法,为组织工程法修复肌腱所需生物材料的制备提供理论和实验基础。方法:牛的肌腱作实验材料,被组织粉碎机粉碎后,依次放入不同浓度的胰蛋白酶溶液、Triton X-100溶液、SDS溶液浸泡处理后,所得基质用过氧乙酸-乙醇溶液中灭菌消毒处理,然后依次用蒸馏水和PBS缓冲液洗涤、过滤。最后冷冻、干燥、保存。冰冻切片进行苏木素-伊红染色,观察细胞核残留情况。微量DNA提取试剂盒提取脱细胞后跟腱基质DNA,检测DNA的残留量。结果:大体观察可见,各实验组跟腱组织经脱细胞处理后,均呈乳白色匀浆状。苏木素-伊红染色结果显示,跟腱组织脱细胞处理后细胞核均大量减少,细胞核残留极少,每高倍视野中细胞核残留不大于5。DNA含量结果显示,当牛跟腱组织依次经过0.5%胰蛋白酶溶液处理2h、1%的Triton X-100溶液处理2h、0.5%的SDS溶液处理1h后,得到的肌腱脱细胞基质DNA含量最少,为0.03μg/mg。结论:依次用胰蛋白酶溶液、Triton X-100溶液、SDS溶液浓度分别为0.5%、1%、0.5%、处理时间分别为2h、2h、1h时,对牛肌腱组织的脱细胞效果最佳。     

脱细胞神经基质的制备及成分分析

目的:制备脱细胞神经基质,通过测定细胞核和DNA残留评价脱细胞程度,并对所制备的脱细胞神经基质进行成分分析,为开发新型神经修复生物材料提供研究基础。方法:1依次采用0.5%胰蛋白酶-3%曲拉通X-100-0.1%SDS-PBS溶液-水振荡漂洗的方法对异种动物的外周神经进行脱细胞处理。2冰冻切片并经苏木素-伊红染色观察细胞核残留。3微量样品DNA提取试剂盒提取脱细胞神经基质的DNA,超微量蛋白核酸分析仪检测其残留DNA含量。4免疫组织化学法分析脱细胞神经基质成分。结果:经脱细胞处理制备的神经基质呈乳白色;脱细胞神经基质经冰冻切片和苏木素-伊红染色后观察,未见有完整细胞核残留;脱细胞神经基质的DNA残留为6.6ng/mg;经免疫组织化学染色分析,脱细胞神经基质的主要成分为Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和层粘连蛋白。结论:采用本法制备的脱细胞神经基质,有效去除了神经组织中的细胞成分,保留了神经组织细胞外基质的主要成分,可以作为神经修复的新型生物材料。     

脱细胞血管基质的生物相容性研究

目的评估Triton X-100和胰蛋白酶方法制备的猪脱细胞血管基质的生物相容性。方法分别采用体外细胞毒性试验(直接接触法和MTT法)检测脱细胞血管基质的细胞毒性,采用皮下植入试验来评估经脱细胞血管基质的免疫排斥反应。结果L929细胞在预铺脱细胞血管基质的培养板内及不同浓度脱细胞基质浸提液内均生长良好,皮下植入试验显示2周后脱细胞血管基质的炎性反应明显减轻。结论经Triton X-100和胰蛋白酶方法制备的猪脱细胞血管基质具有良好的生物相容性。     

兔主动脉脱细胞血管基质的制备

目的 研究脱细胞血管基质的制备方法.方法 采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔胸主动脉制备脱细胞血管基质, 标本经苏木精-伊红染色光镜观察,20 g/L戊二醛固定做扫描电镜、透射电镜观察.结果 光镜下血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维呈网状排列,细胞已全部除去;扫描电镜观察血管脱细胞组织基质纤维结构完整,胶原纤维无断裂,呈网状和多孔状,孔径(100～150)μm ×(10～20)μm;透射电镜观察示胶原和弹性纤维无断裂,基底膜面光滑完整,无破裂.结论 胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔主动脉,可使血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂,细胞外基质保持完好.     

优化脱细胞处理制备心肌ECM薄片——探索制备“心肌生物创可贴的脚手架”

【目的】 研究表明,移植用组织工程技术在体外构建工程心肌(engineered cardiac tissue, ECT)明显修复心泵功能。将心肌脱细胞处理制备出保留天然成分、超微结构和三维结构的心肌细胞外基质(extracellular matrix,ECM),能有效支持细胞的存活和生长,并影响其迁移和分化,可被用于构建仿生ECT。然而目前的脱细胞方法尚存在不足。本研究拟联合使用经典脱细胞试剂SDS和Triton X-100,改良脱细胞方法,制备性能更为优良的心肌ECM薄片,为构建仿生工程心肌片提共理想的生物支架。 【方法】 取6周龄成年昆明小白鼠心脏,经处理、包埋后沿横断面切成300 μm心室肌薄片,置于4℃无钙台氏液中保存。将切片分为正常对照组、SDS脱细胞组和改良脱细胞组。改良脱细胞组心肌片置于0.1%SDS中,37℃振荡反应11.5 h,去掉SDS,加入PBS漂洗3次,再加入0.5%Triton X-100,37℃振荡反应0.5 h。SDS组心室肌薄片按相同反应条件用0.1%SDS处理12 h。两组反应结束后,均加入PBS振荡漂洗3次,时间分别为10 min、30 min和1 h,以去除残余脱细胞试剂。正常对照组心室肌薄片置于含双抗的PBS中37℃振荡反应12 h。通过细胞成分定量(总RNA定量和总蛋白定量分析)、H-E染色和免疫荧光染色(胶原蛋白Ⅵ、层粘连蛋白和Heochst33247)评估脱细胞程度和ECM成分保留。将改良脱细胞组ECM与小鼠胚胎干细胞源心肌细胞(murine embryonic stem cell derived cardiomyocytes, mES-CMs)和小鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonic fibroblasts, MEFs)共培养,通过动态观察和H-E染色的方法检测其生物相容性。 【结果】 SDS+Triton X-100改良脱细胞法能有效降低残留细胞成分含量;改良脱细胞法对核质去除较SDS脱细胞法更加彻底;改良脱细胞法更好地保留了胶原蛋白Ⅵ和层粘连蛋白两种ECM关键成分;改良脱细胞法制得的ECM能有效支持种子细胞生长和迁移。 【结论】 SDS+Triton X-100联合脱细胞法能更有效地去除细胞成分,并保护ECM中关键成分及其结构。制得的心肌ECM薄片具有良好的生物相容性。     

不同脱细胞方法对猪主动脉瓣的组织学及生物力学特性的影响

目的:研究不同脱细胞方法对猪主动脉瓣的组织学及生物力学特性的影响。方法:瓣叶随机分为5组:新鲜瓣叶对照组(组Ⅰ)及脱细胞组(组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)。脱细胞处理:组Ⅱ用1％Triton X-100+核酸酶;组Ⅲ用0.01％胰蛋白酶+核酸酶;组Ⅳ用0.05％胰蛋白酶;组Ⅴ用1％Triton X-100+0.01％胰蛋白酶+核酸酶。瓣叶分别行大鼠皮下包埋,并测定生物力学特性。结果:组Ⅳ瓣叶纤维结构受损,其极限抗张强度明显下降(P<0.05),其余3个脱细胞组生物力学性能无变化。组Ⅳ、Ⅴ瓣叶皮下包埋的炎性反应较组Ⅱ、Ⅲ为轻。结论:1％Triton X-100+0.01％胰蛋白酶+核酸酶脱细胞法能更好地降低瓣叶的免疫原性并保持其生物力学特性,是一种较为理想的脱细胞方法。     

猪真皮脱细胞基质制备方法的实验研究

目的 研究猪真皮脱细胞基质的制备方法.方法 实验组使用0.125％胰蛋白酶和2.5 U/mL DispaseⅡ溶液,对照组使用PBS溶液,在4℃下,经过24 h脱去猪真皮细胞,配合0.5％SDS对脱细胞后基质振荡洗涤3 h和0.5％Triton X-100振荡洗涤24 h清除细胞碎片制备出猪真皮脱细胞基质.结果 实验组...     

猪主动脉脱细胞血管基质制备

目的研究脱细胞血管基质的制备方法。方法采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂法处理猪胸主动脉来制备脱细胞血管基质，标本作苏木素-伊红染色，大体、光镜及扫描电镜、透射电镜观察。结果经该法处理的血管细胞全部脱除，胶原纤维、弹性纤维无断裂，细胞外基质保持完好。结论酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法是制备脱细胞血管基质的较好方法。     

2种去细胞方法制备大鼠脱细胞脊髓支架效果的对比研究

目的比较脱氧胆酸钠+Triton X-100和脱氧胆酸钠+DNA+RNA酶2种脱细胞方法制备脱细胞的同种异体脊髓支架的效果。方法取成年SD大鼠胸段脊髓2 cm,运用冻融+化学萃取的组织工程学方法(脱氧胆酸钠+Triton X-100和脱氧胆酸钠+DNA+RNA酶)处理大鼠脊髓组织,对处理后的脊髓支架分别进行HE染色,髓鞘染色和扫描电镜观察。结果2种方法均较为完全地脱去了细胞和髓鞘成分,脊髓横断面上呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核。结论采用冻融+化学萃取的2种组织工程学方法均可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架。     

淋巴结脱细胞支架的构建及效果评价

目的 对小鼠淋巴结脱细胞和卵巢脱细胞支架进行比较,为人工卵巢的制作提供组织工程材料。方法使用表面活性剂(0.5%SDS)振荡清洗方法脱细胞,再用去离子水(ddH₂O)清洗其内残留SDS,获得脱细胞支架。HE染色观察脱细胞的形态,DAPI染色观察细胞的残留情况,Masson染色观察胶原纤维,阿尔新蓝染色(Alician Blue)观察糖胺聚糖,透射电镜观察支架超微结构,并测定DNA和羟脯氨酸含量。结果 与新鲜淋巴结及卵巢相比,脱细胞后大体观察组织体积稍缩小,颜色变淡,呈毛玻璃状。HE染色未见明显细胞残留,可见交织成网的纤维结构。Masson染色显示淋巴结和卵巢脱细胞支架胶原纤维形态保留完整。Alcian Blue染色显示卵巢脱细胞支架中蓝色条带较细,淋巴结脱细胞支架中有稍粗不定形基质样结构。DAPI染色未见明显细胞核。扫描电子显微镜见密集分布的大量纤维以及与纤维相连的较小的片状细胞外基质成分,相互连接成3D网架结构。DNA定量分析得出淋巴结及卵巢脱细胞支架仅残留7.45%及11.96%(P<0.05),卵巢脱细胞后羟脯氨酸含量减少(P<0.05)。结论 ...     

Triton X-100法制备牛颈静脉脱细胞血管支架

 【目的】 研究经Triton X-100 脱细胞处理的牛颈静脉的组织结构和生物力学特性以及作为组织工程血管支架的可能性?【方法】 获取10条新鲜带瓣牛颈静脉,随机分为两组,新鲜对照组(n = 5)和脱细胞实验组(n = 5),脱细胞组血管使用2.5 mL/L Triton X-100等进行脱细胞处理48 h, 病理切片染色和扫描电镜观察血管壁和瓣膜自身细胞的脱除情况和细胞外基质变化情况;生物力学性能检测血管组织强度变化;体外人内皮种子细胞种植以了解脱细胞支架的生物相容性?【结果】 脱细胞处理后,管壁和瓣膜的自身细胞完全脱除而弹力纤维和胶原纤维无明显改变;与新鲜牛颈静脉相比,脱细胞血管的拉伸强度[(16.5 ± 2.61)MPa vs (15.5 ± 3.1)MPa; P > 0.05]和最大持线力[(7.9 ± 0.9)N vs (7.0 ± 1.1)N; P > 0.05]无明显改变,在100 mm Hg液压下脱细胞血管无异常扩张;内皮种子细胞在脱细胞血管支架上生长黏附良好?【结论】 Triton X-100法对新鲜牛颈静脉进行脱细胞处理效果良好,脱细胞牛颈静脉可作为细胞种植的血管支架使用?     

猪主动脉脱细胞血管基质制备及保存

目的 探讨脱细胞血管基质的制备和保存方法.方法 采用酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理猪胸主动脉制备脱细胞血管基质, 标本行苏木精-伊红染色,大体、光镜及扫描电镜、透射电镜观察.并将标本放入液氮中保存,于保存1、2、3月分别取标本用20 g/L戊二醛固定,扫描电镜观察.结果 经该法处理的猪血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂,细胞外基质保持完好.液氮保存后1、2、3月扫描电镜观察与新鲜标本无明显差别.结论 酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法是制备脱细胞血管基质的较好方法,制得的脱细胞血管基质可放入液氮中保存.     

大鼠肾脱细胞支架的制备研究

背景 基于完整天然肾的脱细胞支架可以用于生物人工肾,然而目前对肾脱细胞支架的制备没有统一的标准.由于脱细胞的结果直接关系到再细胞化和肾功能的发挥,因此对脱细胞支架的制备方案进行探索和优化显得尤为重要.目的 探究基于大鼠完整肾的脱细胞支架制备方案,为组织工程肾的制备提供生物支架材料.方法 通过给离体肾灌注十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液洗脱肾内的细胞成分制备大鼠肾脱细胞支架,病理染色及透射电镜观察组织结构及细胞外基质保留情况,超声和超声造影观察支架完整性和血管网络通畅性,DNA和SDS定量检测支架内的核酸和洗脱剂的残留,细胞毒性检测脱细胞支架的安全性.结果 脱细胞时间随着灌注流速增加而减少,高流速灌注洗脱肾造成鲍曼氏囊面积变大而导致鲍曼氏囊破裂,且有细胞核成分残留.低流速下制备的脱细胞支架结构完整、细胞成分洗脱干净.0.5 mL/min流速下液体环境中灌注洗脱制得的脱细胞支架结构完整,DNA和SDS残留符合标准,超声探查见脱细胞支架完整,造影检查见完整血管网络,支架无细胞毒性.结论 制备大鼠肾脱细胞支架的最佳灌注流速是0.5 mL/min,超声和超声造影检查可以作为评价肾脱细胞支架的手段.     

人肝组织脱细胞支架的制备

目的探究人肝组织脱细胞支架的制备。方法本研究利用手术切除的人肝血管瘤左外叶组织,经反复冻融,0.01% SDS、
0.1% SDS和1% Triton X-100循环灌注制备人肝组织脱细胞支架,并通过灌注过氧乙酸消毒。将L-02细胞通过门静脉插管种
植于脱细胞支架内进行培养。结果HE、DAPI染色和扫描电镜结果显示脱细胞支架内无细胞成分残留,残余DNA检测为
25.3±14.6 ng/mg干质量,小于新鲜肝脏DNA含量的1%。免疫组化证实支架内保留了Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、弹力蛋白
成分。L-02细胞在支架上生长良好且有增殖,并表达白蛋白及葡萄糖-6-磷酸酶。结论利用手术切除的人肝标本行肝组织脱
细胞支架的制备是可行的,且为构建更适用于临床的组织工程肝脏提供了新思路。
     

两种羊膜脱细胞基质制备方法的比较

目的:探究制备羊膜脱细胞基质的方法.方法:取新鲜羊膜标本,分别采用TritonX-100(Triton组)预处理(恒温36 h)和甘油预处理(4℃,24 h×3次),再经胰蛋白酶、EDTA酶消化(分别用时4 h和10 h),制备羊膜脱细胞基质.经HE染色和扫描电镜观察2组羊膜脱细胞基质残留细胞数和组织结构,并观察接种的第3代人脐带间质干细胞在2种羊膜脱细胞基质上的黏附、生长状况.结果:上述2种方法制备的羊膜脱细胞基质均为白色、半透明膜状物,无细胞及其他组织残留.Triton组羊膜脱细胞基质结构均匀平整,操作时间短.甘油组样本表面凹凸不平,看不到细胞形态.脐带间质干细胞在2种羊膜脱细胞基质表面黏附、增殖状况均良好,Triton组细胞增殖状况总体优于甘油组(P<0.05).结论:TritonX-100预处理并酶消化法是制备羊膜脱细胞基质较好的方法.     

不同方法脱猪主动脉瓣细胞效果比较

目的:比较不同脱细胞方法处理猪主动脉瓣叶的效果,探讨组织工程心脏瓣膜生物支架的最佳制备方法.方法:取猪主动脉瓣膜,消毒后随机分组.Ⅰ组瓣叶不做处理,作为对照组.Ⅱ组Triton X-100、核酸酶(DNaseⅠ、RNase Ⅰ)处理.Ⅲ组采用低浓度胰蛋白酶、EDTA、核酸酶、DCA处理.Ⅳ组用DCA、核酸酶处理.对各组脱细胞瓣叶进行大体、光镜、电镜观察及理化检测.结果:Ⅳ组方法不可完全去除细胞成分,Ⅱ、Ⅲ组方法可完全去除细胞成分,但Ⅱ组瓣叶原有的超微结构有所改变.结论:低浓度胰蛋白酶、EDTA、核酸酶、DCA联合应用是理想的组织工程心脏瓣膜生物支架制备方法.     

不同的固定及渗透方法对小鼠卵母细胞免疫荧光染色的影响

目的 探索有效的染色前固定及渗透卵母细胞的方法,以提高小鼠卵母细胞免疫荧光染色的效率.方法 采用4种不同的固定及渗透方法处理小鼠卵母细胞:①方案A:先用4%多聚甲醛(PFA)固定1 h,再用0,5%Triton X-100穿透10 min;②方案B:先用0.5% Triton X-100穿透10 min,再用4%PFA固定1 h;③方案C:用1%PFA+0.5%Triton X-100同时固定与穿透1 h;④方案D:用-20℃预冷甲醇固定15 min.分析10种核蛋白(TFⅡA、TFⅡB、TAF1、TAF4、polⅡ、BRF1、MeCP2、MBD2ab、HP1α及HP1β)在小鼠卵母细胞中的免疫荧光染色效果.结果 只有方案C能够完全检测出这10种蛋白质.结论 用1%PFA+0.5%Triton X-100同时固定与穿透1 h,可以在小鼠卵母细胞形态保持良好的同时检测出更多的蛋白质.     

兔半月板脱细胞基质的制备

目的 制备兔半月板脱细胞基质并研究其组织形态结构及生物力学特性.方法 将切取的兔半月板用双氧水浸泡、蒸馏水洗涤后,采取Triton X-100及脱氧胆酸钠等试剂制备脱细胞的兔半月板,观察其色泽、质地,用苏木精-伊红(HE)、甲苯胺蓝、番红花O、Hoechst-33258荧光染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行组织学检测,用倒置相差显微镜观察其微观三维结构,用生物力学机测定其在不同压缩比率下的瞬时形变恢复率、最大形变恢复率及最大受压强度.结果 兔脱细胞半月板呈乳白色,结构蓬松,HE、甲苯胺蓝和番红花O染色均显示细胞陷窝内已无细胞结构,Hoechst-33258荧光染色呈阴性,Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性.倒置相差显微镜观察到脱细胞半月板基质内部结构疏松,微孔较多.生物力学测定其压缩40%时,最大瞬时形变恢复率为(76.65±4.61)%,最大形变恢复率为100%,最大强度是(4.51±0.69)N.结论 成功制备的兔半月板脱细胞基质有较多微孔,形变恢复好,有利于细胞附着生长,可作为组织工程支架.     

三种去细胞方法构建的猪主动脉瓣膜支架的性能比较

目的:评价不同去细胞方法制备的猪主动脉瓣支架的组织学、生物力学特性及组织相容性,寻找更合适的去细胞心脏瓣膜支架制备方法.方法:分别采用3种不同的去细胞方法对新鲜猪主动脉瓣叶及带瓣主动脉管道进行脱细胞处理:0.01%胰蛋白酶 1%Triton 核酸酶组用含有0.01%胰蛋白酶-1%Triton和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡24 h;0.01%胰蛋白酶8 h 1%脱氧胆酸(DCA) 核酸酶组先用 0.01%胰蛋白酶37℃持续震荡消化处理8 h,终止胰酶后加入含有1?A和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡24 h;1?A 核酸酶32 h组:用含有1?A和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡32 h;同时以PBS漂洗的新鲜瓣叶作为对照组.通过H-E染色、扫描电镜和透射电镜观察评价去细胞效果.测定瓣叶弹性模量、最大抗张强度、应力伸长比及断裂伸长比以评价各组瓣叶的生物力学特性.大鼠皮下包埋实验评价去细胞支架的免疫源性、体内炎性反应及改建情况.结果:0.01%胰蛋白酶8 h 1?A 核酸酶组细胞去除完全,优于0.01%胰蛋白酶 1%Triton 核酸酶组和1?A 核酸酶32 h组.所制备瓣膜支架的弹性模量及最大抗张强度大于0.01%胰蛋白酶 1%Triton 核酸酶组.应力伸长比及断裂伸长比则小于0.01%胰蛋白酶 1%Triton 核酸酶组,与新鲜瓣叶无明显差异.体内埋植实验炎症反应轻微,宿主成纤维细胞能够长入支架并对其进行改建.结论:短时间低浓度胰蛋白酶与1?A和核酸酶相结合的去细胞法方便有效,既能完全去除猪带瓣主动脉管道的细胞成分,使免疫源性显著下降;同时瓣叶的生物力学特性保持稳定,可为受体细胞化组织工程心脏瓣膜的提供可靠的支架材料.     

人脂肪肝脱细胞支架的制备及肝癌细胞的体外三维培养

目的体外建立一个基于人脂肪肝脱细胞支架的肝癌三维模型。方法通过反复冻融、梯度浓度的SDS和1% Triton X-100 经门静脉和肝动脉双重灌注及组织块在Triton X-100中反复震荡的方法制备人脂肪肝脱细胞基质（hFLM）。在hFLM内培养 HepG2细胞,检测其存活、形态、增殖及黏附分子表达情况。结果采用双重灌注的方式显著缩短了支架制备的时间,同时保留 了肝脏的细胞外基质成分及三维结构。HepG2细胞在hFLM内培养15 d,存活良好,并呈现与体内相似的肿瘤增殖模式。而 且,hFLM培养的HepG2细胞和皮下成瘤组均低表达E-cadherin,高表达Vimentin,与二维培养组正好相反。基于hFLM的肝癌 模型缺少有效的血管网络,缺乏足够的营养转运,可能导致后期细胞增殖减缓。hFLM培养的HepG2细胞第12天时PCNA指数 较第6天时降低了29.3%。结论建立一种新的人脂肪肝脱细胞方案,并验证了基于hFLM体外构建肝癌模型的可行性。