脉冲电磁场诱导小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化

目的 观察脉冲电磁场对小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化的影响.方法 将小鼠4 d龄胚胎干细胞(embry-onic stem cells,ESCs)衍生的胚胎体单细胞按5×104ml-1接种到细胞培养板,在DMEM基础培养液中使胚胎体单细胞贴壁培养.于第14～21天时,分别给予脉冲电磁场、化学诱导剂以及联合刺激.采用茜素红染色、骨钙素免疫组织化学染色、成骨分化关键因子Osterix和Cbfa-1/Runx-2的相对定量RT-PCR检测等方法观测成骨分化情况.结果 茜素红染色和RT-PCR结果均显示:脉冲电磁场组、化学诱导组以及联合培养组的成骨诱导效果均比空白对照组显著增加,其中又以联合培养组成骨诱导效果最明显.骨钙素免疫组化染色也显示:联合培养组中骨钙素分泌最多.结论 脉冲电磁场可以促进小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化,而且脉冲电磁场和常规化学诱导剂联合应用会产生协同效应,其成骨诱导效果优于两者单独应用.     

VEGF-165基因修饰的MSCs诱导分化后治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究

目的：探讨VEGF-165基因联合单纯骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stemcells,MSCs）治疗激素性股骨头坏死的可行性。方法：1）体外分离、培养兔MSCs,纯化并鉴定兔MSCs;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后以1μgPeDNA3．1-hVEGF165：3μl阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染,通过ELISA检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。2）测定在正常条件培养和成骨备件培养下,转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。3）实验动物连续三天大剂量（40mg／kg）臀部肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠,通过MRI和组织病理学检查,建立动物模型。4）随机分成4组,每组14只。经皮穿刺于右侧股骨头,（1）生理盐水组,（2）单纯MSCs组,（3）hVEGF165基因转染MSCs组,（4）诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组。8周后,组织病理学检查成骨和细胞成活情况。结果：1）hVEGF165基因转染的MSCs能成功分泌VEGF蛋白。2）成骨条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）;而在正常条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。3）成功建立ANFH模型。4）组织学评分：生理盐水组1．8±0．72;单纯MSCs组8．54±0．37;hVEGF165基因转染MSCs组11．96±0．26;诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组13．7±0．43,各组间差异有显著性（P〈0．05）。诱导分化转基因干细胞组与单纯干细胞组和生理盐水组之间差异非常显著（P〈0．01）。结论：诱导分化后的hVEGF165基因转染MSCs组成骨能力更好,修复股骨头缺血性坏死的能力也是最强。     

巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化影响的实验研究

为探讨巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响,采用含药血清的方法体外培养骨髓基质细胞,分A组(巴戟天水提物组)、B组(巴戟天醇提物组)、C组(对照组)、D组(经典成骨诱导组)、E组(巴戟天水提物+经典成骨诱导组)、F组(巴戟天醇提物+经典成骨诱导组),观察各组碱性磷酸酶染色、茜素红染色、碱性磷酸酶比活性及骨钙素含量,结果显示碱性磷酸酶染色和茜素红染色反应强弱的顺序为F组＞E组＞D组＞B组＞A组,C组为阴性;碱性磷酸酶比活性和骨钙素(BGP)含量测定结果为:A、B、D、E、F组在同一时间点均高于C组(P<0.05),E组、F组在同一时间点均高于D组(P<0.05).说明巴戟天水提物及醇提物均能促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化,且巴戟天醇提物的作用强于水提物.     

Dkk1对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨经典Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化的影响。方法：以C3H10T1/2为目的细胞,通过重组腺病毒介导BMP9过表达,联用重组腺病毒Dkk1抑制经典Wnt信号通路。检测各处理组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性变化、钙盐沉积、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨桥素（osteopontin,OPN）变化;体内异位成骨实验分析Dkk1对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。结果：BMP9可诱导C3H10T1/2细胞成骨分化;Dkk1显著降低BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP活性（F=1 467.21,P=0.000）、钙盐沉积、OC（F=32.95,P=0.000）和OPN（F=127.23,P=0.000）蛋白表达;异位成骨模型中Dkk1抑制BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化和骨块成熟。结论：Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1可降低BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化可能需要经典的Wnt信号通路参与。     

TGF-β2和geneX对BrdU标记骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的作用

［摘要］ 目的　研究TGF-β2和geneX对BrdU标记的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化作用的影响．方法　采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞,传代并鉴定,设实验组和空白对照组,实验组分4组:A组:BrdU标记后的BMSCs组;B组:BrdU标记后的BMSCs+TGF-β2组;C组:BrdU标记后的BMSCs+geneX组;D组:BrdU标记后的BMSCs+geneX+TGF-β2组．空白对照组为BrdU标记后的单纯BMSCs加入基础培养基避光培养．诱导培养后观察骨髓间充质干细胞生长形态、检测生长动力学（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和钙定量、进行细胞Von-Kossa法染色,观察成骨分化作用．结果　（1）4组BMSCs吸光度值（OD）分析比较显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各组BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）和钙定量检测结果显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）进行细胞Von-Kossa法染色,D组可见大量钙结节;C组可见较多钙结节;B组可见部分钙结节;A组可见少量钙结节;空白对照组未见钙结节．结论　（1）TGF-β2可促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导其向成骨细胞分化;（2）geneX可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且在细胞因子TGF-β2联合作用下成骨分化作用更明显．     

人骨髓间充质干细胞体外诱导培养成骨的实验研究

目的 观察人骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 抽取人骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用含地塞米松、β—甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色等方法进行观测。结果 原代人骨髓间充质干细胞10～12d左右即可长满，并可稳定传代，传代细胞5～6d即可传代，在诱导培养液中2周形成多层结构，并聚集成细胞钙化结节。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色，骨钙素免疫组化染色阳性。结论 人骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

体外分离培养Balb/c小鼠胚胎干细胞向神经细胞定向诱导分化

目的: 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的高效方法. 方法: 自孕3.5 d的Balb/c小鼠获得附植前的早期胚胎,机械剥离法去除胚胎的滋养层细胞获取内细胞团(ICM)分别在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上和明胶包被的培养板中培养获得类ESCs克隆. 进行碱性磷酸酶染色,SSEA-1细胞免疫化学鉴定及体内分化实验鉴定. 模拟体内神经系统发育过程采用序贯诱导方法定向诱导ESCs分化为神经细胞,进行分化后细胞的免疫细胞化学鉴定. 结果: 所分离得到的细胞碱性磷酸酶染色阳性,SSEA-1表达阳性,体内分化实验证实具有多向分化潜能. 符合ESCs的一般特性. 经过序贯诱导方法可以高效诱导ESCs分化为神经细胞. 结论: 体外分离得到的Balb/c小鼠的ESCs经过模拟体内神经系统发育过程经过序贯诱导方法可以高效的诱导为神经细胞,且所获得的神经元比例高.     

人肌源干细胞体外成骨作用的实验研究

目的探讨人肌源性干细胞(MDSCs)的分离、培养、鉴定及体外成骨作用,为临床应用提供实验依据。方法采用消化法分离MDSCs,应用差速贴壁法纯化干细胞,免疫细胞化学染色对细胞鉴定,MDSCs在骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化后,检测其碱性磷酸酶、骨钙素。结果成功获得高纯度的MDSCs,免疫组织化学方法能够有效鉴定MDSCs,BMP-2诱导MDSCs后能够合成碱性磷酸酶、骨钙素。结论可通过体外原代培养获得高纯度MDSCs,其具有干细胞特征,并能够转化为骨系细胞,发挥成骨作用,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

Smurf1拮抗BMP-2对C2C12细胞的诱导成骨作用

目的研究Smad泛素化调节因子1（Smurf1）对基因重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）诱导成骨作用的影响。方法通过将质粒pcDEF3-Smurf1临时转染C2C12细胞并应用实时PCR和Western免疫印迹法鉴定其表达Smurf1，空载体pcDNA3．1作为阴性对照；然后用比色法测定细胞碱性磷酸酶活性和实时PCR分析细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达，观察Smurf1对rhBMP-2诱导C2C12细胞向成骨细胞分化的影响。同时在相差显微镜下观察细胞形态的变化。结果Smurf1在C2C12细胞可以通过临时转染获得很好的表达。尽管在细胞形态上没有明显的差别，但Smurf1转染的C2C12细胞在rhBMP-2作用48h后，细胞碱性磷酸酶活性以及细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达均较对照组明显下降。结论Smurf1在BMP诱导成骨过程中发挥着负性调节作用。     

共培养大鼠内皮祖细胞对白体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）与自体骨髓基质细胞（BMSCs）共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离、培养大鼠BMSCs和EPCs,培养细胞分为四组：A组（BMSCs组）、B组（EPCs组）、C组（BMSCs成骨诱导组）及D组（BMSCs和EPCs联合培养组）。通过观察细胞克隆形态、免疫细胞化学、细胞增殖、碱性磷酸酶活性,从酶学、组织学及生化等不同方面观察EPCs对BMSCs成骨活性及生长情况的影响。结果免疫细胞化学染色证实C组培养的细胞具有晚期EPCs的特性。倒置相差显微镜、HE染色均证实共培养的BMSCs和EPCs生长良好,并能够形成与单纯成骨诱导培养的BMSCs相似的钙结节。MTr检测结果：各组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）。碱性磷酸酶活性检测结果：C、D组显著高于A、B组（P〈0．05）。结论EPCs和BMSCs联合培养具有良好的细胞相容性,EPCs能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力。     

小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的体外实验

目的：探索提高胚胎干细胞（ESC）体外诱导分化为心肌细胞的实验方法.方法：采用悬滴—悬浮—贴壁三步法（悬滴三步法）和悬浮—贴壁两步法（悬浮两步法）,按诱导剂的不同分为Ⅰ组：丹参＋5-氮杂胞苷（5-aza）组;Ⅱ组：丹参＋维甲酸（RA）组;Ⅲ组：5-aza组;Ⅳ组：丹参组;Ⅴ组：RA组;Ⅵ组：阴性对照组6组进行诱导培养,比较在2种培养方法下各组心肌细胞的分化率.结果：Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ组采用悬滴三步法培养的心肌细胞分化率分别为（77.78±5.09）%,（66.67±8.82）%,（51.11±1.92）%,（44.44±5.09）%,（23.33±3.34）%;采用悬浮两步法培养的心肌细胞分化率分别为（42.22±6.94）%,（36.67±8.82）%,（25.55±10.71）%,（17.78±5.09）%,（10.00±2.84）%.各组心肌细胞分化率悬滴三步法较悬浮两步法高,差异具有统计学意义（P〈0.05）.采用悬滴三步法培养Ⅰ组心肌细胞分化率最高可达78%,与其它各组相比较差异具有统计学意义（P〈0.05）.结论：悬滴三步法联合采用中药丹参与5-aza为诱导剂,可为体外ESC分化为心肌细胞的实验方法提供理论依据.     

环孢霉素A诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的：观察环孢霉素A（CSA）对小鼠胚胎干细胞（ESCs）向心肌细胞分化的影响。方法：分别观察ESCs自发和CSA诱导情况下心肌细胞分化率,细胞免疫组化检测心肌细胞标志物的表达。结果：CSA诱导的心肌细胞分化率明显高于自发的心肌细胞分化率,且诱导生成的心肌细胞具备心肌细胞特有的特征。结论：CSA能够诱导ESCs向心肌细胞分化并扩增ESCs分化形成的心肌细胞。     

昆明小鼠胚胎干细胞大鼠侧脑室内移植诱导分化的在体研究

目的：探讨脑内微环境诱导胚胎干细胞向神经细胞分化的状况，确定胚胎干细胞脑内移植的最佳分化阶段。方法：将未分化的昆明小鼠胚胎干细胞和经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞分别进行侧脑室内移植，通过苏木素伊红（HE）染色、尼氏染色和神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫组织化学染色，检测胚胎干细胞移植后的存活和分化情况。结果：未分化的昆明小鼠胚胎干细胞侧脑室内移植后．不能很好地向神经细胞方向分化，有形成畸胎瘤的倾向。而经维甲酸初步诱导分化的胚胎干细胞进行侧脑室移植后4周，移植物中有相当一部分细胞为NSE免疫阳性细胞．部分细胞的胞浆中可见尼氏小体。具有神经细胞的典型特征。结论：经过维甲酸诱导后，胚胎干细胞发生了向神经细胞的分化．在侧脑室微环境中可以存活．并朝着神经细胞方向分化。     

诱导小鼠胚胎干细胞分化获取血管平滑肌和内皮细胞

目的 探讨从诱导分化的小鼠胚胎于细胞中获取体外构建组织工程化血管种子细胞的可行性.方法 利用Flk-1作为小鼠胚胎干细胞分化来源的血管前体细胞标志,流式细胞仪分选分化的类胚体中Flk-1阳性细胞,分别添加血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF),诱导血管前体细胞向血管平滑肌细胞和血管内皮细胞分化.免疫荧光染色鉴定诱导分化后细胞的相关标志表达;流式细胞仪分析诱导分化后细胞的分化效率和纯度.结果 流式细胞仪分析显示,在分化第4天类胚体中有50%左右的细胞表达Flk-1,经分选的Flk-1阳性细胞通过进一步诱导,可以得到(95.9±3.5)% α-SMA阳性的血管平滑肌细胞和(59.1±4.8)%CD31阳性的血管内皮细胞.结论 成功应用流式细胞分选法从诱导分化的小鼠胚胎干细胞中获取血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实验为组织工程化血管构建中种子细胞来源提供了新途径.     

低氧对小鼠胚胎干细胞诱导分化成心肌细胞的影响

目的探讨在胚胎干细胞诱导分化过程的不同阶段进行低氧处理对分化心肌细胞的影响。方法建立胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的实验方法,在分化过程的不同阶段采取低氧（氧浓度为4%）处理,并设立常氧组（约为20%）作为对照,用免疫荧光鉴定分化后的心肌细胞,以流式细胞术检测低氧对分化心肌细胞的增殖、分化、凋亡的影响。结果分化细胞经免疫荧光检测显示,部分细胞呈α辅肌动蛋白阳性（红色）、心肌肌钙蛋白I阳性（绿色）;分化细胞经流式检测显示,与常氧组相比,悬滴低氧组α-actinin阳性细胞和cTnI阳性细胞的比率分别提高了12.55%（P〈0.01）和6.11%（P〈0.05）,悬浮低氧组凋亡比率与常氧组相比明显提高（P〈0.01）,悬滴低氧组处于S期的细胞比率与常氧组相比明显降低（P〈0.01）。结论在胚胎干细胞向心肌细胞的定向诱导分化过程中,采用悬滴阶段低氧处理,使心肌特异性蛋白阳性细胞比率提高,细胞凋亡率稳定,细胞增殖能力因细胞分化成熟而有所降低,为低氧处理的最佳方案。     

体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源。方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞。将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果。结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达。培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志。经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化。结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。     

胚胎干细胞来源的内皮细胞构建内皮化血管支架

目的探索胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞,并用于构建内皮化血管支架,为临床心血管疾病治疗提供实验基础。方法采用改良后单层分化体系,血管内皮生长因子（VEGF）作为独立诱导因子定向诱导胚胎干细胞分化为血管内皮细胞,用RT-PCR法检测分化时程各时间点内皮特异性标志的表达,用免疫荧光法检测分化体系中的内皮细胞蛋白标志。将分化成熟的内皮细胞种植于支架表面,构建内皮化血管支架。结果胚胎干细胞全能性分子标志Oct3／4,早期内皮标志Flk-1,Tie-2,PECAM-1,以及成熟内皮标志VE-cadherin在胚胎干细胞分化体系中呈现一定的转录时序性;免疫荧光结果显示分化细胞Flk-1,VE-cadheiin阳性,血管支架被表达VE-cadherin的内皮细胞覆盖。结论我们改良了胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的方法,并用于探索内皮化血管支架的构建。     

胚胎干细胞自我更新与诱导分化

本文在简述胚胎干细胞生物学性状的基础上,重点综述胚胎干细胞自我更新和诱导分化研究的相关进展,其中包括由外源性细胞因子(LIF因子)和内源性转录因子(Oct-4,Nanog)共同参与的自我更新调控机制;通过条件培养基和基因转染的方法定向诱导干细胞分化以及微环境对干细胞诱导分化的影响及调控,最后提出干细胞研究面临的挑战.可为今后干细胞的基础科研及应用开发提供必要的理论依据和技术指导.     

胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞的诱导条件

目的：探索胚胎干细胞ES—D3分化为胰岛素分泌细胞的诱导条件。方法：ES—D3细胞培养于鼠胚成纤维细胞滋养层上，对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM液中，隔天换液，2周后，用DTZ染色、ELISA、免疫细胞化学染色等方法鉴定诱导生成的胰岛素分泌细胞及其所分泌的胰岛素。结果：ES—D3细胞在不含白血病抑制因子和滋养细胞的无血清培养体系中呈悬浮生长，并于第4天形成拟胚体，加入促分化因子bFGF可使胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化，诱导生成的胰岛素分泌细胞在培养基中自我组装形成三维立体细胞簇。诱导第17天，DTZ染色发现大量被染成暗红色的胰岛素分泌细胞，免疫细胞化学染色亦证实了胰岛素分泌细胞的存在；同时，用ELISA法检测到胰岛素分泌。随着诱导天数增加，DTZ染色阳性细胞数及胰岛素含量均增加?结论：胚胎干细胞ES—D3在无血清含bFGF培养基中能被诱导分化为胰岛素分泌细胞，且该细胞能够分泌胰岛素。     

BMSCs及ESCs因子在迟发型超敏反应中的作用

目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）和胚胎干细胞（ESCs）因子对迟发型超敏反应（DTH）的影响。方法分离、培养并传代小鼠BMSCs和ESCs,获取BMSCs因子和ESCs因子。小鼠随机分为正常组（A组）、模型组（B组）、培养基组（c组）、地塞米松（DEX）组（D组）、BMSCs因子组（E组）和ESCs因子组（F组）6组,每组10只,应用5g／L二硝基氟苯腹部涂抹致敏、耳廓激发的方法制备小鼠变应性接触性皮炎（ACD）模型（A组不处理）,A、B组尾静脉注射生理盐水,C、D、E、F组分别注射DMEM、DEX、BMSCs因子、ESCs因子,比较各组耳肿胀度、胸腺指数和脾指数,光镜下观察耳廓苏木精一伊红染色后组织学变化。结果B组耳肿胀度高于A组,差异有显著性（F=153．080,q=27．68,P＜0．01）;D组、E组和F组小鼠耳廓肿胀度均低于B组（q=8．130～20．440,P＜O．01）,脾指数和胸腺指数亦低于B组（F=621．352、409．533,q=9．579～38．030,P＜O．01）;E组和F组的脾指数及胸腺指数均高于D组（q=4．089～15．969,P＜0．05）,E组耳肿胀度、脾指数及胸腺指数均高于F组（q=4．860～11．487,P＜O．05）。B组和C组以上指标比较差异均无显著性（P＞O．05）。镜下观察,D组、E组和F组炎性细胞浸润均较B组减少。结论BMSCs因子和ESCs因子均可抑制DTH,但ESCs因子抑制作用优于BMSCs因子。