特异性抗幽门螺杆菌IgY的制备和活性测定

目的 寻找一种高效的特异性抗幽门螺杆菌IgY的制备和活性测定方法.方法 分别用福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂混合含幽门螺杆菌火活全菌及其超声碎片的试剂,对6只31周海兰褐种产蛋母鸡进行免疫,2周后二免,4周后三免.于初免后即开始收集鸡蛋,提取特异性抗幽门螺杆菌IgY,采用间接血凝试验测定卵黄中的抗体效价,体外抑菌试验测定其抑制幽门螺杆菌的活性.结果 母鸡在初免2周后,抗体效价可达1:256,初免3周后,抗体效价可达1:1024,初免4周后,抗体效价可达1:8192;同批样品在此水平可维持达11周以上,然后抗体效价呈缓慢下降趋势,26周后抗体效价仍可保持在较高水平.特异性抗幽门螺杆菌IgY具有明显的抑制HP生长的活性.结论 采取加强免疫方法,可高效地引起免疫应答,是一种较好的获得抗体的方法.     

用BALB/c小鼠制作抗青霉素酰化酶和抗头孢菌素酰化酶抗体及其交叉反应的观察

用3种不同方法制备的抗原分别免疫BALB／c小鼠，制备了抗青霉素酰化酶a亚基、β亚基和抗头孢菌素酰化酶a亚基、β亚基共4种抗体，测定了它们的效价并比较这几种方法的优缺点；还比较了用同一种方法制备的抗原免疫小鼠后制作这两类抗体的效价以及上述毛种抗体的交叉反应。结果：用割胶法制备的抗原（加用不完全佐剂）免疫小鼠后所得抗体效价较高，且所制备的两类抗体效价无显著差异：在交叉反应测试中，抗头孢菌素酰化酶抗体也能识别青霉素酰化酶，但抗青霉素酰化酶抗体却几乎不能识别头孢菌素酰化酶，说明抗青霉素酰化酶抗体更为专一、而同类抗体对相应抗原的2个亚基之间的交叉反应说明其互相结合部位的结构有类似之处，同时也说明只有进一步制作单克隆抗体才能提高抗体的特异性。##6—动物实验—     

鲍曼不动杆菌抗体制备的实验研究

目的：探讨鲍曼不动杆菌抗体的制备方法。方法分别采用高压蒸汽法和煮沸法制备鲍曼不动杆菌抗原，与弗氏完全佐剂混合并乳化后免疫大鼠，末次免疫3周后采用琼脂扩散法检测大鼠血液中的鲍曼不动杆菌抗体。结果采用煮沸法制备的鲍曼不动杆菌抗原免疫大鼠后，大鼠血液内产生了较高水平的鲍曼不动杆菌抗体，效价达到1∶100。结论应用煮沸法制备的鲍曼不动杆菌抗原免疫大鼠，可获得高效价的鲍曼不动杆菌抗体。     

甲状腺素抗体制备的改进

目的：制备甲状腺素（Ｔ４）免疫测定方法所需的特异性抗体，要求可用于酶联免疫方法测定血清中总Ｔ４和游离Ｔ４的浓度。方法：将甲状腺素（Ｔ４）与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联形成完全抗原，在免疫方法上做了主要改进，即依据动物体的免疫反应规律安排免疫日程，制备出高质量的抗Ｔ４特异性抗体。结果：用放免法（ＲＩＡ）检测两只家兔的抗血清，其效价分别为１：１．６×１０５和１：１．２×１０５，亲和常数分别为２．６３×１０９Ｌ／ｍｏｌ和１．８×１０９Ｌ／ｍｏｌ，与Ｔ３交叉反应分别为０．１５％和０．１２８％，与ｒＴ３交叉反应分别为０．２１７％和０．１６８％。结论：制备的抗体可用于Ｔ４的免疫测定。     

兔抗猪Ⅱ型胶原抗血清的制备与检测

目的：采用纯化的猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔制备Ⅱ型胶原抗体,并经改良的ELISA法检测确定Ⅱ型胶原抗体效价。方法：提取猪Ⅱ型胶原,经层析纯化,将纯化无菌Ⅱ型胶原与不完全佛氏佐剂等量混合,注射于兔脚掌、背部和皮下。并每隔20天追加抗原刺激,共3次,每隔一定时间收集血浆,以ELISA法检测抗Ⅱ型胶原抗体。结果：提纯猪Ⅱ型胶原纯度与Sigma标准品一致。Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔,抗体含量具二个高峰期,分别在首次致敏后第21天和第40天,免疫第40天抗血清的效价达1：2430。结论：采用纯化猪Ⅱ型胶原免疫新西兰大白兔短期内可产生高效价抗体。     

两种制备猪囊尾蚴免疫血清方法的比较

<正> 我们用两种不同方法免疫家兔并用间接血凝试验方法(IHA)检测抗体效价,以选择一种效价高、操作简便的方法,现介绍如下。①无菌条件抽取囊液经2 000r/min离心20min,再经9 000×g离心30min,上清液为囊液抗原。用分光光度计测定,蛋白含量为12.4mg/ml,-20℃保存。②选两只雄性家兔,体重2.5kg,分别用下述两种方法进行疫免。方法Ⅰ首次免疫将囊液1ml加等量弗氏完全佐剂,分别注射于家兔的四脚掌皮内。两周后将囊液1.5ml加等量弗氏完全佐剂,分别注射于背部和后腿肌肉内,经两周     

直接在小鼠脾内注射免疫原免疫产生MCAb

用可溶性抗原直接注入小鼠脾脏免疫,第4天取脾与SP2/0融合,用ELISA和间接血凝法(PHA)检测杂交瘤上清,测到阳性克隆。利用双亲细胞杂交产生单克隆抗体(MCAb),其中之一的脾细胞要求有大量增殖状态的特异性B细胞,才能分泌特异性抗体,这与免疫的关系极大。常见的方法要福氏完全佐剂加可溶性抗原首次免疫,间隔2-4周加或不加不完全佐剂的抗原加强一次,隔合前应连续以50～500ug不加佐剂的抗原进行静脉或腹腔加强。Spitz用直接脾内免疫产生MCAb的方法获得比较高的分泌MCAb的杂交瘤我们应用此法免疫人IgG、马钤薯病毒,轮状病毒获得抗人IgG MCAb并在融合后的培养板杂交瘤上清测到了抗马铃薯病毒阳性克隆。现将实验报告如下:     

脂质体对JEV－E糖蛋白的佐剂作用研究

目的：观察脂质体对日本脑炎病毒Ｅ糖蛋白的佐剂作用；方法：利用改进的振荡法，使亲和层析提取的日本脑炎病毒Ｅ糖蛋白包裹于脂质体中，制备出脂质体－Ｅ蛋白结合物，并分组免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠；通过ＥＬＩＳＡ，血凝抑制试验（ＨＩ）和中和试验（ＮＴ）等指标观察．结果：脂质－Ｅ蛋白免疫组的特异性抗体水平明显高于游离Ｅ蛋白组；在两批病毒攻击保护性试验中，前者保护率分别为５０％和５７％，后者分别为３８％和３０％．结论：脂质体对日本脑炎病毒Ｅ糖蛋白有明显的佐剂作用．     

重组结核分支杆菌16000蛋白抗原(rPA16)的免疫原性研究

目的：研究结核分枝杆菌重组16000蛋白（rPA16)诱发家兔产生抗体的能力并评价其血清学诊断的价值。方法：家兔按注射的抗原及佐剂的不同分组，皮下多点注射分别进行免疫，6次免疫后采血，双向琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）跟踪兔血清抗体效价的时间效应并检测兔血清与所试各类分支杆菌PPD有无交叉反应；同时检测rPA16与各分支杆菌PPD的免疫羊血清的反应，并用rPA16抗原检测人血标本，分析该抗原的临床检测的敏感性和特异性。结果：兔血清抗体效价结果显示：5个月后，加佐剂的抗原组的兔免疫血清仍能检测到抗体，不加佐剂组2个月后血清抗体检测即为阴性，ELISA检测兔免疫血清比双向琼脂扩散方法要更敏感，rPA16抗原加佐剂引起的兔血清抗体滴度最高可达1：6400，不加佐剂组的血清抗体滴度仅为1：400，ELISA法分析抗rPA16的兔血清的特异性表明其特异笥较好，仅与牛、人型结核分支杆菌的PPD呈阳性反应，与其他所试分支杆菌PPD反应均为阴性，同时又分析了rPA16抗原的特异性，与人型PPD相比，该抗原只与所试各类分支杆菌，BCG、牛分支杆菌免疫的血清呈阳性反应，而人型PPD则基本上与结核分支杆菌免疫的血清均呈阳性反应，ELISA检测血清标本结果：肺结核病组中rPA16和PPD检测敏感性分别为64.8%和75.2%；健康组，卡介苗接种阳转健康组，rPA16和PPD检测特异性分别为96.2%,88.5%和94.3%,66.7%。结论：rPA16具有较强的免疫原性和一定的特异性，可能成为结核病血清学诊断试剂之一。     

增强型绿色荧光蛋白兔多克隆抗体的制备

目的:制备增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的兔多克隆抗体.方法:用谷胱甘肽-增强型绿色荧光蛋白(GST-EGFP)融合抗原加福氏完全佐剂背部皮内注射首次免疫新西兰大白兔,第28天用GST-EGFP融合抗原加福氏不完全佐剂同样剂量加强免疫,第35天时再次免疫.第49天心脏采血30 mL,4℃静置过夜,收集血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清中EGFP多克隆抗体的效价;免疫印迹法检测EGFP多克隆抗体的特异性;利用荧光免疫细胞化学检测该抗体和观察转染EGFP贴壁生长的大鼠脑皮层混合培养细胞中EGFP的表达.结果:ELISA检测EGFP多克隆抗体滴度最高为1:9 549;免疫印迹检测结果显示该抗体特异性高;荧光免疫细胞化学检测显示存混合培养细胞中EGFP呈阳性表达.结论:直接使用GST-EGFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,可在较短时间内制备大量EGFP多克隆抗体.     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

兔抗弓形虫Ⅰ型液泡型质子焦磷酸酶多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗弓形虫I型液泡型质子焦磷酸酶（TgVP1）多克隆抗体并鉴定其应用。方法选择弓形虫ME49株TgVP1氨
基酸序列中的两条多肽,TgVP1-1与TgVP1-2,进行人工合成,并将其与KLH偶联作为抗原免疫新西兰大耳白兔,收集血清制备
多克隆抗体,并通过ELISA、Western blot、免疫荧光等方法进行鉴定。结果经间接ELISA测定,兔抗TgVP1-1及TgVP1-2的多
克隆抗体效价均达1∶128 000;Western blot结果显示两种多抗均能识别弓形虫天然蛋白中85 000左右条带,与TgVP1预测相对
分子质量大小相符,且特异性较好;通过免疫荧光技术检测到两株多抗识别的蛋白均定位于细胞质中,与酸性钙体的分布相
同。结论采用人工合成多肽为免疫原所获得的兔抗TgVP1多克隆抗体效价高,特异性好,弓形虫TgVP1和酸性钙体的深入研
究奠定了基础,同时也为弓形虫病的诊断提供了新的有效工具。
     

EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

目的：制备高效价EB病毒膜蛋白抗体,并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法：将B95-8细胞培养至3×10^5/mL时,超声破碎,纯化获得EB病毒膜蛋白抗原;EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化,在家兔背部皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清,检测兔免疫血清抗体IgG;进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性,同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。结果：所有家兔在全程免疫后都产生了高效价膜蛋白的特异性抗体,最高滴度达1：6400。结论：用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔,可成功制备高效价的特异性血清抗体,为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。     

小鼠Tnfaipl基因的克隆、表达及抗体制备

目的克隆小鼠Tnfaipl基因，并在大肠杆菌中表达，通过免疫新西兰兔，获得小鼠Tnfaipl多克隆抗体，为进一步研究小鼠Tnfaipl的功能奠定基础。方法用RT-PCR方法从小鼠肝脏组织中扩增获得Tnfaipl基因的蛋白质编码区，将目的片段连接到PMD18-T载体，然后亚克隆至pGEX-4T-2中，进而在大肠杆菌BL21（DE3）中表达融合蛋白质GST-Tnfaipl，并用其免疫新西兰兔，获得小鼠Tnfaipl多克隆抗血清。结果得到了小鼠Tnfaipl多克隆抗体。结论成功得到了特异性好的、效价高的小鼠Tnfaipl多克隆抗体。     

重组SAK及其突变体多克隆抗体制备及应用研究

目的通过制备SAK及其突变体(SAK2)的多克隆抗体,检测并比较两者的免疫原性。方法将4只新西兰大耳白兔随机分为SAK组2只,SAK2组2只,皮下多点注射抗原SAK及SAK2。第3次免疫1周后,收集血清。使用饱和硫酸氨沉淀及DEAE离子交换法纯化多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价。ELISA检测抗原抗体反应性,比较SAK和SAK2的免疫原性。结果兔抗SAK多克隆抗体与SAK2的反应性显著低于与SAK的反应性,兔抗SAK2多克隆抗体与SAK和SAK2的反应性无明显差异。结论使用多克隆抗体检测抗原抗体反应性的结果显示,SAK突变体SAK2缺失了部分抗原表位,同时未产生新的抗原表位。与SAK相比SAK2可能具有较低的免疫原性。利用多克隆抗体检测抗原抗体反应性对判断抗原性变化具有重要价值。     

抗血小板膜糖蛋白Ibα胞内段多肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备兔抗人血小板膜糖蛋白(GP)Ibα C端557～561氨基酸序列多肽的多克隆抗体,并初步用于人血小板GPIbα C端559位丝氨酸磷酸化状态的检测.方法 应用化学方法合成C-R-G-S-L-P(559位丝氨酸非磷酸化,Ser559)和C-R-G-s(p)-L-P(559位丝氨酸磷酸化,pSer559)多肽.将2种多肽分别与钥孔蜮血蓝蛋白交联后,以皮下注射法分别免疫新西兰大白兔,分离获得2种抗血清(抗Ser559多抗和抗pSer559多抗).应用斑点印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法 对抗血清进行鉴定并检测效价.从人血小板裂解液中分离纯化血小板GPIbα,利用抗Ser559多抗和抗pSer559多抗、采用ELISA方法检测人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状况.结果 所制备的2种多抗分别特异性识别各自抗原,效价分别为1:32 000和1:64 000.2种多抗均可与纯化的人血小板GPIbα特异结合,表明人血小板GPIbα 559位点丝氨酸存在磷酸化与非磷酸化两种状态.结论 应用人工合成多肽成功制备出2种可特异性识别丝氨酸磷酸化状态的兔抗人血小板GPIbα胞内段多肽多抗,并证明人血小板GPIbαC端559位丝氨酸存在磷酸化状态.     

乙型肝炎病毒免疫耐受动物模型的建立与验证

用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染1d龄幼鸭建立了乙型肝炎免疫耐受动物模型,随访22周,鸭乙型肝炎病毒表面及前表面抗原(DHBs/presAg)及DHBV DNA阳性不变。在持续性感染鸭血清中未能检出抗DHBs/pres或抗鸭乙型肝炎核心(DHBc)抗体。用纯化的DHBs/pres Ag及DHBcAg与鸭外周血淋巴细胞作特异性淋巴细胞增殖试验,结果也未见阳性反应。以DHBs/presAg及DHBcAg分别免疫上述免疫耐受鸭,每3周1次。连续免疫5次,也未能刺激产生相应的抗体及特异性淋巴细胞增殖反应,从而首次建立并确证了1d龄鸭感染DHBV导致的免疫耐受动物模型。     

兔抗人TGF-β_1多克隆抗体的制备

目的以人重组TGF-β1蛋白作为抗原,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀,免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果成功获得兔抗人TGF-β1多克隆抗体,纯化后抗体效价达1∶110 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体具有良好的特异性,能满足进一步实验的需要。     

抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定

目的：纯化rVVC免疫家免，制备并纯化多克隆抗体。观察复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合作用肝癌细胞SMMC7721后，肝癌细胞SMMC7721形态学和活性变化，评估抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC772的保护作用。方法：纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳免获得多克隆抗体，多克隆抗体经过硫酸铵盐析、Sephadex G25除盐和DEAE-SephadexG100层析纯化并进行Westerm Blot鉴定和抗体效价分析。复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合物作用肝癌细胞SMMC7721后，显微镜观察并以MTT法确定抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC7721的保护作用。结果：兔抗重组rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后，得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示，抗重组rVVC蛋白多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。显微镜观察和MTT结果表明，纯化多克隆抗体能够阻断重组rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC772的损伤。结论：成功制备了具有保护和阻断作用的免抗重组rVVC多克隆抗体，为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。     

抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗果蝇Trio蛋白的抗体。方法:以RT-PCR扩增Trio的1 173 bp的基因片段并克隆入pET28a( )和pGEX-4T-1(His)6C表达载体中,表达并纯化Trio-His、Trio-GST融合蛋白。用纯化的Trio-His融合蛋白免疫家兔产生抗Trio的抗体,用Trio-GST亲和层析法进行纯化并采用Western blot法检测抗体生物学活性。结果:表达的Trio-His蛋白以包涵体的形式存在,用His亲和层析法分离纯化后得到较纯的Trio-His融合蛋白,以纯化的Trio-His免疫家兔制备的兔抗Trio的抗体,经Western blot分析显示该抗体可与果蝇S2细胞Trio特异性结合。结论:获得具有良好特异性的兔抗Trio抗体,为进一步研究Trio的功能奠定了基础。