密码子优化的HPV6b L1 DNA诱导BALB/c小鼠产生增强的免疫应答

目的 探讨真核细胞偏好密码子优化对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b型L1 DNA诱导BALB/c小鼠特异性体液和细胞免疫应答的增强效应.方法 利用PCR从尖锐湿疣组织中扩增HPV6b L1基因,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建野生型pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)并进行鉴定;同时,对HPV6b L1基因进行真核细胞偏好密码子优化,进一步通过重叠PCR的方法获得全长基因,构建密码子优化的重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)并进行鉴定.将6～8周龄雌性BALB/c小鼠分成4组,分别肌肉注射3次pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)、pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、pcDNA3.1(+)载体和PBS,间隔2周,每次剂量为150μg/鼠.分别于免疫前和免疫后每隔2周,收集血清,用间接ELISA检测血清igG抗体;并于第8周取小鼠脾细胞,采用乳酸脱氢酶释放法,按效应细胞与靶细胞之比(E:T)为5:1、10:1、20:1进行免疫小鼠特异性CTL杀伤活性检测.结果 成功构建了密码子优化的HPV6b L1重组质粒.小鼠免疫后血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间和次数的增加而升高.pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)组血清IgG抗体在第8周达到高峰,与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、载体和PBS对照组相比差异均有统计学意义(t=18.138、t=29.140、t=30.840,P值均＜0.01);而pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)组与载体和PBS组比较差异也有统计学意义(t=20.072、t=22.457,P值均＜0.01).在特异性CTL杀伤实验中,当E:T分别为5:1、10:1、20:1时,pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)组的脾细胞特异性CTL杀伤率明显高于pcDNA3.1(+)/HPV6bLl(wt)组(t=11.892、t=15.329、t=2.911,P值均＜0.05)、载体组(t=12.936、t=16.613、t=13.90l,P值均＜0.01)和PBS对照组(t=14.768、t=18.935、t=10.925,P值均＜0.01).结论 密码子优化的HPV6b L1 DNA可诱导BALB/c小鼠产生增强的特异性体液和细胞免疫应答.     

EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

目的：制备高效价EB病毒膜蛋白抗体,并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法：将B95-8细胞培养至3×10^5/mL时,超声破碎,纯化获得EB病毒膜蛋白抗原;EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化,在家兔背部皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清,检测兔免疫血清抗体IgG;进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性,同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。结果：所有家兔在全程免疫后都产生了高效价膜蛋白的特异性抗体,最高滴度达1：6400。结论：用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔,可成功制备高效价的特异性血清抗体,为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。     

HPV18 E7基因的原核表达及其在宫颈癌患者血清抗体中的检测

目的研究人类乳头瘤病毒18型E7全长基因(HPV18 E7)在原核表达系统中的表达,及其作为特异性抗原在宫颈癌血清抗体检测中的意义,为HPV感染与肿瘤相关的血清学诊断研究奠定基础。方法PCR法扩增HPV18 E7全长基因,构建重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7,转化表达HPV18 E7融合蛋白后经纯化、SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。再以该融合蛋白作为诊断抗原,间接ELISA法检测宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照三组血清特异性IgG抗体水平。结果HPV18 E7融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的35.00%;宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照组的血清特异性抗体均值分别为0.604±0.328,0.287±0.202和0.342±0.225,三组间差异有显著性意义(F=32.771,P<0.01);宫颈癌组与尖锐湿疣组及健康对照组的HPV18E7均值比较,差异均有显著性意义(P均<0.01),而尖锐湿疣组与健康对照组抗体均值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论HPV18 E7融合蛋白具较强的抗原性,对宫颈癌诊断试剂的研究具有应用价值。     

沙眼衣原体感染小鼠生殖道模型的初步研究

目的建立沙眼衣原体（C￡）小鼠生殖道感染模型。方法分别用10。、10‘、10。数量IFU的CtE型株阴道内接种雌性BALB／c小鼠,观察外阴炎症反应,检测排菌情况,PCR检测分泌物及对组织进行病理观察。结果接种后第5d,实验组小鼠即出现感染迹象;在接种后的5～20d均可在小鼠生殖道分离得到具感染性的c≠,但其持续排菌时期与接种的IFU数量成正比;且小鼠生殖道排菌量（IFU）与接种的IFU数量亦成正比,以10。剂量组为高;小鼠生殖道分泌物PCR扩增后电泳,可见与CtMOMP分子量相当的产物;小鼠生殖道组织切片观察证实,c￡E型株感染小鼠生殖道可产生生殖道炎症。结论成功建立了小鼠生殖道E型c￡感染模型;10。IFU是建立模型的适宜感染量。     

透明质酸酶在弓形虫重组融合抗原ROP2-P30基因免疫中的免疫增强作用

目的： 研究透明质酸酶在弓形虫重组融合抗原ROP2-P30基因免疫中的免疫增强作用,初步探讨透明质酸酶在提高质粒DNA分子免疫效应中的应用潜能。 方法： 弓形虫重组质粒pcROP2-P30 联合透明质酸酶以及单独的重组质粒pcROP2-P30肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,生理盐水和空质粒载体pcDNA3.1作阴性对照免疫,免疫3次,间隔3周。免疫结束后,以纯化的弓形虫重组蛋白ROP2-P30（rROP2-P30）为检测抗原,检测各免疫组小鼠血清中特异性抗体的形成;cell counting kit-8（CCK-8）检测免疫鼠脾细胞的增殖活性;硝酸还原酶法检测免疫鼠脾细胞培养上清中NO的含量。 结果：pcROP2-P30+透明质酸酶免疫组特异性抗体生成水平显著高于其它免疫组（均P<0.01）;pcROP2-P30+透明质酸酶免疫组小鼠脾细胞受特异性抗原rROP2-P30刺激后,其淋巴细胞的增殖明显高于单独的质粒pcROP2-P30免疫组（P<0.01）;pcROP2-P30+透明质酸酶免疫组脾细胞培养上清中免疫活性分子NO的含量也显著升高（均P<0.01）。 结论：透明质酸酶在提高弓形虫DNA免疫效应方面显示了免疫增强作用,具有发展成为基因免疫的免疫佐剂的潜能。