转化生长因子-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞表型转化的信号通路研究

目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)对人结膜下Tenon囊成纤维细胞(human subconjunctival Tenon's capsule fibroblast,HTCF)表型转化的作用及其信号转导通路.方法 白内障手术中取人结膜下Tenon囊组织块培养成纤维细胞.用第5～9代细胞,以10 μg/L TGF-β1诱导HTCF 48 h,使其表型转化为肌成纤维细胞(myofibroblast,MF).用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型.在诱导后不同时间点(0、5、30、60、120、180 min,12、24、36 h),用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术测定smad2、AKT、ERK、P38蛋白表达.结果 10 μg/L TGF-β1诱导HTCF后α-SMA在24 h达峰值,蛋白表达在48 h最高;10 μg/L TGF-β1诱导HTCF后smad2、AKT、P38表达具有时间双向性,smad2具有两个峰值.结论 TGF-β1能显著诱导HTCF,使其表型转化为MF,smad信号通路参与了这一过程.     

TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞生物学行为改变及表达整合素连接激酶(ILK)的研究

目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor beta 2,TGF-β2)对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)生物学行为及表达整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的影响.方法 组织块贴壁法培养原代HTFs,免疫荧光染色鉴定波形蛋白和角蛋白.MTT法检测不同浓度TGF-β2对HTFs细胞的促增殖作用,RT-PCR检测TGF-β2作用前后α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)、ILK mRNA的表达,Western Blot检测α-SMA、ILK、E-cadherin蛋白的表达,细胞免疫荧光染色检测α-SMA、E-cadherin蛋白的表达.结果 MTT检测结果显示,TGF-β2作用48 h、72 h,5.0 μg· L-1及10.0 μg· L-1诱导下的OD值显著高于0.1μg·L-1、1.0 μg·L-1组及空白对照组(均为P＜O.05),5.0 μg·L-1及10.0 μg·L-1作用48 h及72 h的OD值显著高于24 h(均为P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,5.0μg·L-1TGF-β2诱导48 h后,α-SMA mRNA及ILK mRNA水平和空白对照组相比明显上调,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).Western Blot检测结果显示,ILK、α-SMA及E-cadherin在空白对照组和5.0 μg· L-1TGF-β2处理组均有表达,但TGF-β2能够明显上调三者的表达,5.0 μg·L-TGF-β2处理48 h组与空白对照组差异均有统计学意义(均为P＜0.05).细胞免疫荧光染色结果显示,TGF-β2处理组α-SMA、E-cadherin均有荧光表达,其中oα-SMA表达在细胞质中,而E-cadherin在细胞质和细胞核中均有表达.结论TGF-β2可以诱导体外培养HTFs增殖,转分化及黏附性增强,同时促进ILK的高表达,提示ILK在青光眼术后瘢痕化过程中可能也起到一定作用.     

转化生长因子-β2诱导人Tenon囊成纤维细胞转化及其在瘢痕形成中的作用

背景 研究表明转化生长因子-β2(TGF-β2)能够促进瘢痕形成,但其在青光眼滤过术后局部瘢痕形成中的作用机制值得研究. 目的 探讨TGF-β2对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)转化以及在滤过术后瘢痕形成中的作用.方法 在斜视手术中获取3例患者的Tenon囊组织,并用组织块培养法在含质量分数10％胎牛血清的DMEM中培养,培养的细胞贴壁后达到70％ ～ 80％亚融合状态时更换为无血清培养基饥饿培养24 h,然后分别加入质量浓度1、2、5、10、20 μg/L TGF-β2诱导HTFs 24 h,另用2μg/L或5μg/L TGF-β2诱导HTFs 6、24、48、72 h,阴性对照组培养基中不加TGF-β2.用Western blot法检测HTFs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和pSmad2蛋白的表达,采用细胞免疫荧光技术检测α-SMA及纤维状肌动蛋白(F-actin)表达的定位,采用凝胶收缩实验检测培养细胞收缩力的变化.结果 不同质量浓度TGF-β2组HTFs中α-SMA表达的强度均明显强于阴性对照组,2μg/L、5μg/L TGF-β2作用24～48 h后HTFs中α-SMA表达强度达峰值,10 μg/L、20 μg/L TGF-β2组较2μg/L、5μg/L TGF-β2组α-SMA蛋白表达强度减弱.对照组HTFs中有少量α-SMA及F-actin表达,1、2、5μg/L TGF-β2组α-SMA及F-actin荧光表达明显增强,阳性细胞数明显增加,10 μg/L TGF-β2组α-SMA及F-actin荧光表达较低质量浓度组减弱.2μg/L TGF-β2作用后pSmad2表达强度明显强于PBS组和FBS组,在作用后30 min ～2 h表达较强,2h后开始出现下降.对照组HTFs收缩凝胶面积所占原面积的百分数为(78.00±3.13)％,1、2、5、10 μg/L TGF-β2组分别为(63.88±1.78)％、(20.69±0.65)％、(19.49±0.54)％、(16.24±0.84)％,HTFs收缩凝胶面积占原面积的百分数随着TGF-β2质量浓度的增加而明显增加(F组别=859.400,P=0.000).结论 TGF-β2可诱导成纤维细胞转分化,一定程度上其作用呈质量浓度依赖性和时间依赖性,且细胞收缩力随质量浓度的增加而增强,可能是青光眼滤过术后滤过通道建立失败的重要机制.     

TGF-β1诱导体外培养角膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

目的观察转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)对体外培养的角膜成纤维细胞结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)的诱导表达作用。方法体外培养的角膜成纤维细胞分实验组和对照组,对照组弃原培养液,加无血清培养液继续培养,实验组用不同浓度的TGFβ1(0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1)处理24h,用RTPCR方法检测角膜成纤维细胞CTGFmRNA的表达情况。结果1μg·L-1和10μg·L-1TGFβ1处理组CTGF/GAPDH像素比值分别为0.35±0.05和1.25±0.10,均较对照组高(0.13±0.02),差异具有统计学意义,同时CTGF/GAPDH比值随TGFβ1浓度增加而增加。结论TGFβ1可以诱导角膜成纤维细胞CTGF的表达,在角膜成纤维细胞中CTGF也可能是TGFβ1对细胞起作用的下游信号分子。     

TGF-β1对甲状腺相关性眼病眼眶成纤维细胞外基质基因表达的影响

目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对甲状腺相关性眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)患者眼外肌来源成纤维细胞(orbital fi-broblasts,OF)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)主要成分金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinases-1,TIMP-1)、胶原Ⅰ(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)、胶原Ⅲ(collagen typeⅢ,COL-Ⅲ)及纤维连接蛋白(fibronectin,FN)基因表达水平的影响。方法采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察10μg·L-1TGF-β1刺激OF后不同时间点(0h、3h、6h、12h、24h、48h)及不同浓度TGF-β1(1μg·L-1、5μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1)刺激OF24h后TIMP-1、COL-I、COL-Ⅲ及FN mRNA表达的变化。结果 10μg·L-1TGF-β1刺激OF的时间效应:TIMP-1mRNA在3h和6h分别为对照组的1.50倍和2.46倍(P<0.01);COL-ⅠmRNA在24h和48h分别为对照组的5.49、3.69倍(P<0.01);COL-ⅢmRNA在24h和48h分别为对照组的2.14、1.63倍(P<0.01);FN mRNA在12h和24h后分别为对照组的2.45、1.53倍(P<0.01)。不同浓度TGF-β1刺激OF24h后剂量效应:与空白对照组相比,TIMP-1mRNA在5μg·L-1和10μg·L-1时分别为空白对照组的1.79、1.46倍(P<0.01);COL-ⅠmRNA在1μg·L-1和10μg·L-1分别空白对照组的1.94、3.29倍(P<0.01);COL-ⅢmRNA在5μg·L-1和10μg·L-1分别空白对照组的1.52、3.28倍(P<0.01);FN mRNA在1μg·L-1和10μg·L-1分别为空白对照组的1.30、2.45倍(P<0.01)。结论 TGF-β1以剂量和时间依赖的方式刺激OF表达TIMP-1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及FN mRNA,TGF-β1可能在TAO眼外肌纤维化机制中发挥了重要的作用。     

TGF-β1诱导CD90+和CD90-眼眶成纤维细胞亚群肌成纤维细胞转化的研究

目的依据培养的甲状腺相关性眼病患者眼眶成纤维细胞是否表达CD90分为两个亚群,分离这两个细胞亚群,分别进行肌成纤维诱导,研究它们在眼外肌纤维化中所起的不同作用。方法免疫磁分离法分离CD90 和CD90-的眼眶成纤维细胞,TGF-β1诱导CD90 和CD90-成纤维细胞亚群转化为肌成纤维细胞(MFB),免疫细胞化学法检测代表MFB标志的平滑肌动蛋白α-SMA的表达情况。结果在TGF-β1的作用下,48 h后部分CD90 细胞开始出现α-SMA弱表达,4 d后大部分细胞呈阳性。CD90-细胞不表达α-SMA。结论CD90 与CD90-眼眶成纤维细胞具有不同的功能,CD90 细胞群具有转化为MFB的潜能,与眼外肌纤维化和细胞外基质积聚有关;CD90-成纤维细胞不能转化为MFB。     

K-115增强自噬调控TGF-β1诱导的人Tenon囊成纤维细胞活化

目的：研究K-115对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增殖和迁移的影响,并探讨其相关作用机制,为青光眼术后抗瘢痕治疗提供新思路。

方法：选取2018-09/2019-09于河北省人民医院行青光眼手术患者的Tenon囊组织,采用组织块法进行HTFs原代培养,应用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导HTFs模拟青光眼滤过性手术后的细胞活化模型,并采用K -115处理细胞。将细胞分为4组：对照组采用溶剂二甲基亚砜(DMSO)处理; TGF-β1组采用10μg/L TGF-β1处理24h; TGF-β1+5 K-115组采用5μmol/L K-115预处理2h后加入10μg/L TGF-β1处理24h; TGF-β1+10 K-115组采用10μmol/L K-115预处理2h后加入10μg/L TGF-β1处理24h。通过细胞增殖实验观察细胞的增殖能力; 划痕试验检测细胞的迁移能力; 透射电子显微镜观察细胞内自噬小体的形成; Hoechst 33342/PI染色观察细胞凋亡情况。

结果：细胞增殖实验结果提示K-115可以抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖; 划痕试验提示K-115可以抑制TGF-β1诱导的HTFs迁移; 透射电子显微镜结果显示K-115可以增强TGF-β1诱导的HTFs自噬。Hoechst 33342/PI染色提示K-115并未诱导细胞凋亡。

结论：K-115可能是通过增加HTFs自噬而非诱导凋亡机制调控TGF-β1诱导的HTFs增殖及迁移能力。     

K115对TGF-β1诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制

目的　探讨K115对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法　人Tenon 囊成纤维细胞取自于河北省人民医院眼科行青光眼手术的患者。采用CCK-8实验检测K115对人Tenon 囊成纤维细胞增殖的影响,筛选出TGF-β1对细胞增殖最佳作用浓度为5.0 μg·L^-1,最佳作用时间为24 h;K115对细胞增殖起始作用浓度为5.0 μmol·L^-1,最佳作用浓度为10.0 μmol·L^-1。依据这两个浓度进行分组,分别是对照组（不加TGF-β1与K115）,TGF-β1组（加5.0 μg·L^-1 TGF-β1）,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组（加5.0 μg·L^-1TGF-β1和5.0 μmol·L^-1的K115）,TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组（加5.0 μg·L^-1 TGF-β1和10.0 μmol·L^-1 的K115）。采用Transwell 实验检测K115对人Tenon 囊成纤维细胞迁移的影响;免疫荧光法测定人Tenon 囊成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。对实验所得各指标进行统计学分析。结果　本研究细胞培养状态良好,6～8周可见人Tenon 囊成纤维细胞铺满培养瓶瓶底。用CCK-8 试剂盒检测各组细胞增殖情况结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组光密度值分别为0.977±0.042、1.306±0.059、0.862±0.035、0.558±0.042,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组光密度值均小于TGF-β1组 (均为P<0.05),并且呈现浓度依赖性减小,K115浓度越大细胞增殖减少幅度越大。Transwell 实验结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组迁移细胞数分别为（38.67±3.06）个、（81.00±4.00）个、（44.33±3.21）个、（23.67±2.52）个;TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组与TGF-β1组比较,迁移细胞数降低,差异有统计学意义（P<0.05）;TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组与对照组及TGF-β1组比较,迁移细胞数均明显降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。各组细胞内α-SMA蛋白免疫荧光染色结果显示,对照组人Tenon 囊成纤维细胞胞浆内可见散在分布的绿色荧光物质,TGF-β1处理后24 h（TGF-β1组）,胞浆内绿色丝状荧光物质明显增加,荧光强度差异有统计学意义（P<0.05）;与TGF-β1组比较,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组和 TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组细胞胞浆内的荧光强度呈浓度依赖性减弱,K115浓度越高荧光强度减弱越明显(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,对照组细胞凋亡率为（2.400±0.346）%,TGF-β1组为（0.900±0.173）%,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组为（1.333±0.252）%,TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组为（1.067±0.058）%;TGF-β1组的细胞凋亡率较对照组降低（P<0.05）; TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组和TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组的细胞凋亡率均较对照组降低（均为P<0.05）,而与TGF-β1组比较,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　K115对TGF-β1诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移有明确的抑制作用,其作用机制可能与K115抑制了TGF-β1诱导的细胞内α-SMA的表达进而调控了细胞活化有关。     

TGF-β2对体外培养豚鼠巩膜成纤维细胞的影响

目的探讨豚鼠巩膜成纤维细胞(guineapigscleralfibroblast,GSF)体外培养的方法,研究转化生长因子-β2(transforminggrowthfactor-β2,TGF-β2)对体外培养GSF的增生及胶原蛋白合成的影响。方法GSF原代培养,取生长状态良好的3~6代GSF分别加入不同浓度的TGF-β2(0.00~50.00μg·L-1)。应用MTT法和氯胺T法分别观察比较GSF的增生及胶原蛋白合成情况。结果TGF-β2体外能促进GSF的增生,最佳作用浓度为10.00μg·L-1。在0.01~10.00μg·L-1浓度范围内促进胶原蛋白的合成,呈剂量依赖性。结论TGF-β2体外能够促进GSF增生及胶原蛋白的合成。     

TGF-β1对Tenon囊成纤维细胞增生和HSP47表达的影响

目的探讨转化生长因子B1（TGF-β1）对人Tenon囊成纤维细胞（HTF）增生和热休克蛋白47（HSP47）表达的影响。方法青光眼患者Tenon囊组织体外培养，用不同质量浓度0．01、0．1、1、5、10ng／mLTGF-β1处理细胞，继续培养24h，用MTT比色法检测吸光度值（A），用免疫细胞化学检测HSP47和Ⅰ型胶原纤维蛋白含量，用实时荧光定量PCR检测HSP47和Ⅰ型胶原mRNA表达。结果TGF-β1能促进HTF的增生（P〈0．05），诱导HTF表达HSP47和Ⅰ型胶原纤维蛋白（P〈0．05），促进HTF表达HSP47和Ⅰ型胶原纤维mRNA（P〈0．05），其作用随TGF-β1质量浓度的增加而增强。结论TGF-β1通过促进HTF纤维增生，诱导下游介质HSP47和Ⅰ型胶原蛋白表达而促进HTF纤维化，可能是青光眼滤过手术后瘢痕形成的重要机制。     

HSP47 siRNA对体外培养HTCF细胞生物学行为及TGF-β1表达水平的影响

目的:探究热休克蛋白47(HSP47)siRNA对体外培养人眼Tenon囊成纤维(HTCF)细胞生物学行为及转化生长因子-β1(TGF-β1)表达水平影响。方法:体外培养HTCF细胞,并分为:空白对照组、空载体组和转染组;转染组根据HSP47基因序列设计并合成干扰siRNA序列,构建载体并导入HTCF细胞中;空载体组导入空白载体。采用RT-PCR和蛋白质印迹实验检测细胞中HSP47 mRNA和蛋白的表达情况,采用克隆形成实验、流式细胞术、Transwell法及划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移,蛋白质印迹实验检测增殖、凋亡、侵袭、迁移蛋白和TGF-β1的表达情况。结果:相比空载体组,转染组HSP47 mRNA和蛋白的表达、克隆形成率、细胞愈合率、侵袭细胞数目、Ki67、N-cadherin、TGF-β1蛋白相对表达水平显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05),但细胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平均无差异(P>0.05)。结论:HSP47 siRNA可以通过抑制TGF-β1蛋白的表达降低HTCF细胞的增殖、侵袭及迁移能力,但对HTCF细胞的凋亡无明显影响。     

汉防己甲素对人眼Tenon囊成纤维细胞表达细胞凋亡蛋白和转化生长因子的影响

背景 汉防己甲素(Tet)对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(TCFs)有抑制效应,但其作用机制尚不完全明确. 目的 观察Tet对体外培养的人眼TCFs中bax、bcl-2、转化生长因子β2(TGF-β2)蛋白表达的影响,探讨其可能的作用机制. 方法 收集健康供体眼球巩膜组织,用组织块培养法培养、分离TCFs,并进行传代,将第3代细胞以1×105个/ml的密度接种于培养板,采用光学显微镜和免疫组织化学法对培养细胞进行鉴定.培养24 h后,用培养液稀释Tet至浓度为1×10-5 mol/L,并加入培养孔中,对照组用1640培养液,继续培养24 h后冲洗固定,采用TUNEL法检测细胞的凋亡情况;采用免疫组织化学法检测bax、bcl-2、TGF-β2蛋白在TCFs中的表达.结果 培养的细胞形态学呈现成纤维细胞的特征,vimentin染色呈阳性反应.Tet组出现大量的TUNEL阳性细胞,而对照组TCFs未见明显凋亡细胞核出现.免疫组织化学检测表明,Tet组TCFs中bax、bcl-2、TGF-β2蛋白的表达率(A值)分别为0.577±0.009、0.430±0.012、0.341±0.017,对照组分别为0.320±0.015、0.819±0.021、0.624±0.014,Tet组bax的表达明显升高,bcl-2和TGF-β2的表达明显下降,差异均有统计学意义(t=33.277、-35.356、-28.093,P＜0.01).结论 Tet通过上调人眼Tenon囊成纤维细胞中bax的表达,下调bcl-2、TGF-β2的表达,从而抑制TCFs的增生.     

曲尼斯特对人眼Tenon囊成纤维细胞TGF-β1，2 mRNA表达的影响

目的观察曲尼斯特对人眼Tenon囊成纤维细胞(human tenon fibroblast,HTF)TGF-β1、TGF-β2 mRNA表达的影响.方法体外进行HTF细胞原代及传代培养.采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),研究不同浓度和不同作用时间的曲尼斯特对HTF细胞TGF-β1、TGF-β2 mRNA表达的影响.结果曲尼斯特作用24 h后,25.0、50.0、100.0 mg/L浓度曲尼斯特组与对照组相比均能够明显下调HTF细胞TGF-β1(P＜0.05、0.05、0.01)和TGF-β2(P＜0.01、0.05、0.01)mRNA表达.50.0 mg/L曲尼斯特处理12 h、24 h、48 h组相对于相应时间对照组,能够明显下调HTF细胞TGF-β1(P＜0.05、0.01、0.01)和TGF-β1(P＜0.01、0.01、0.01)mRNA表达.结论 曲尼斯特能够下调体外培养HTF细胞TGF-β1、TGF-β2 mRNA的表达,下调效应随药物浓度和作用时间的延长而加强.(中国眼耳鼻喉科杂志,2006,681～83)     

环孢素A对人Tenon''''s囊成纤维细胞增殖及TGF-β1分泌的影响

目的 观察环孢素A(CsA)对体外培养的人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)增殖及其转化生长因子β1(TGF-β1)分泌的影响。方法 以体外培养的人HTFs为实验对象，分别加入0．00l～10μg／mL CsA作用48h，细胞计数观察CsA对细胞增殖的影响。收集0．00l～5μg／mL CsA处理后细胞培养上清液，采用ELISA方法检测细胞TGF-β1的分泌量。光镜及透射电镜观察细胞的结构变化。结果 CsA在.1～10μg/mL范围内以质量浓度依赖方式抑制人HTFs的增殖，IC50为0．55μg／mL，并在0．01～5μg／mL范围内刺激细胞TGF-β1的分泌。CsA作用后细胞形态学改变的主要特征为胞浆内大量空泡形成。结论 一定质量浓度的CsA可能通过直接的细胞损伤作用在促进TGF-β1分泌的同时仍显著抑制人HTFs的增殖。     

TGF-β2特异性siRNA载体干扰人结膜囊成纤维细胞表达的研究

目的:探讨人转化生长因子TGF-β2特异性siRNA真核表达载体转染人结膜囊成纤维细胞后对其TGF-β2mRNA表达的影响。方法:体外分离并培养人结膜囊成纤维细胞,在培养后传代3次的细胞以TGF-β2特异性siRNA真核表达载体进行转染,并以未转染细胞作为对照。转染后分别于24,48和72h收集细胞,采用RT-PCR技术检测TGF-β2特异性siRNA真核表达载体对TGF-β2mRNA表达的影响。结果:分离的人结膜囊成纤维细胞于接种约4h左右开始贴壁,同时细胞变长成为梭形,表现出明显的成纤维细胞特性,约36h后达到融合状态;RT-PCR结果示:与对照组相比,转染24,48和72h后的细胞TGF-β2表达抑制率分别为17.40%,52.80%和79.20%,抑制效率呈现随时间延长有所加强的趋势。结论:TGF-β2特异性siRNA真核表达载体能抑制人结膜囊成纤维细胞TGF-β2mRNA的表达。     

干扰素α-2b对人眼Tenon囊成纤维细胞纤维化作用的影响

目的观察干扰素α-2b(IFNα-2b)对人眼Tenon囊成纤维细胞纤维化作用的影响。方法取青光眼患者滤过术中剪下的Tenon囊组织,在体外进行成纤维细胞原代及传代培养。采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR),研究0、125、250、500和1 000 IU/mL浓度的IFNα-2b对体外培养的成纤维细胞转化生长因子β(TGF-β1、TGF-β2)、I型胶原蛋白、纤维连接蛋白表达的影响,以及IFNα-2b对TGF-β2促纤维化作用的影响。以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照,计算产物/GAPDH像素值。结果与对照组(TGF-β1:0.50±0.03;TGF-β2:0.53±0.10)相比,250～1 000 IU/mL浓度IFNα-2b组均能明显抑制人Tenon囊成纤维细胞TGF-β1(0.45±0.18、0.45±0.13、0.37±0.11,P<0.05、0.05、0.01)和TGF-β2(0.47±0.12、0.48±0.21、0.42±0.14,P<0.01、0.05、0.01)表达。与对照组(I型胶原蛋白:0.68±0.08;纤维连接蛋白:0.72±0.09)相比,125～1 000 IU/mL浓度IFNα-2b组均能明显抑制I型胶原蛋白(0.53±0.17、0.54±0.20、0.54±0.18、0.44±0.06,P<0.01)和纤维连接蛋白(0.68±0.14、0.67±0.19、0.64±0.07、0.58±0.11,P<0.01)表达。在10μg/L TGF-β2刺激下,与对照组(Ⅰ型胶原蛋白:1.00±0.06;纤维连接蛋白:0.85±0.16)相比,1 000 IU/mL组IFNα-2b能够显著抑制I型胶原蛋白(0.78±0.09,P<0.01)表达;125～1 000 IU/mL组IFNα-2b均能显著抑制纤维连接蛋白(0.74±0.22、0.68±0.18、0.68±0.15、0.63±0.10,P<0.01)表达。结论 IFNα-2b能够通过减少TGF-β1、TGF-β2的表达,减少Ⅰ型胶原蛋白及纤维连接蛋白的表达;还能够拮抗外源性TGF-β2引起的Ⅰ型胶原蛋白及纤维连接蛋白表达升高。     

TGF-β1对Tenon''''s囊成纤维细胞增殖和结缔组织生长因子表达的影响

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对Tenon's囊成纤维细胞增殖和诱导表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响.方法用MTT法检测不同质量浓度TGF-β1(0、0.1、1、10ng/mL)对Tenon's囊成纤维细胞增殖的影响;免疫细胞化学染色法检测不同质量浓度TGF-β1(0、0.1、1、10ng/mL)对Tenon's囊成纤维细胞诱导表达CTGF的影响.结果GF-β1能够剂量依赖性地促进Tenon's囊成纤维细胞增殖(P＜0.05);TGF-β1能够促进CTGF的表达,有随质量浓度的增加而增强的趋势(P<0.05),但1ng/mL和10ng/mL TGF-β1组之间无统计学差异(P>0.05).结论GF-β1能够促进Tenon's囊成纤维细胞增殖,并促进其下游介质CTGF的表达,可能是青光眼滤过术后滤过泡瘢痕形成的重要机制.     

转化生长因子β1对牛角膜内皮细胞外基质合成的影响

目的观察转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)对体外培养的牛角膜内皮细胞细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成的影响。方法将体外培养的牛角膜内皮细胞分为实验组和对照组,经0μg·L-1(对照)、0.1μg·L-1、1.0μg·L-1、10.0μg·L-1、100.0μg·L-1浓度的TGF-β1处理48h后,用SABC免疫组化法分别检测角膜内皮细胞纤维连接蛋白和层粘连蛋白的合成情况。结果与对照组相比,一定浓度(1.0μg·L-1及10.0μg·L-1)的TGF-β1能明显促进体外培养的角膜内皮细胞纤维连接蛋白及层粘连蛋白的合成,且呈剂量依赖性。但浓度为0.1μg·L-1及100.0μg·L-1的TGF-β1组OD值与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论一定浓度(1·0μg·L-1及10.0μg·L-1)TGF-β1能促进牛角膜内皮细胞ECM的合成,提示TGF-β1可能在角膜内皮细胞损伤修复中扮演重要角色。     

特异性转化生长因子-β_2 shRNA对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的观察转化生长因子-β2（TGF-β2）特异性短发夹RNA（shRNA）对人眼Tenon囊成纤维细胞（TCFs）TGF-β2表达的影响及对人TCFs增生的抑制作用。方法根据小干扰RNA（siRNA）的设计原则,针对TGF-β2基因序列特征构建特异性shRNA载体,转染培养的人TCFs。MTT比色法检测细胞的增生情况;ELISA法检测shRNA对TGF-β2蛋白表达的抑制作用。结果 TGF-β2shRNA转染组的细胞增生及TGF-β2蛋白的表达均受到抑制。转染24、48、72h后MTT比色法检测显示,TGF-β2shRNA转染组培养的Tenon囊的成纤维细胞的增生值分别为0.5426±0.05、0.5210±0.03、0.4055±0.04,明显低于阴性对照组的0.5655±0.03、0.5378±0.03、0.5268±0.04,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义（F组=54.691,P=0.000;Ftime=66.888,P=0.000）。ELISA法检测显示,TGF-β2shRNA转染组TGF-β2蛋白的表达水平下降,24、48、72hTGF-β2蛋白的表达量分别为（543.58±25.32）、（400.26±30.74）、（202.72±23.24）ng/L,明显低于阴性对照组的（659.78±20.95）、（547.45±24.65）、（442.87±17.43）ng/L及空白组的（721.75±30.19）、（756.61±30.19）、（787.60±18.37）ng/L,3个组和各时间点的总体差异均有统计学意义（F组=163.082,P=0.000;F时间=31.498,P=0.000）。结论 TGF-β2特异性shRNA能显著抑制人TCFsTGF-β2的表达,载体介导的TGF-β2特异性shRNA对眼前节术后的抗瘢痕化治疗具有潜在的可能性。     

mTOR在TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞上皮-间叶样转化过程中的动态表达

目的观察雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在转化生长因子β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)上皮-间叶样转化过程中的动态表达变化。方法将10μg·L-1TGF-β2加入HLEC-B3细胞系,分别在体外培养0h、1h、6h、12h、24h、48h,光学倒置显微镜下观察细胞的形态变化,Western blot-ting检测mTOR及其磷酸化水平在该过程中的动态表达情况,同时观察HLEC上皮细胞标志物缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)、上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin,E-cad)和间叶样细胞标志物纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。结果在10μg·L-1TGF-β2诱导HLEC间叶样分化过程中,随着培养时间的增加,HLEC从类椭圆形、多角形逐渐变为长梭形,且细胞间隙增大。与未经TGF-β2处理的HLEC相比,E-cad和Cx43分别于培养的6h和12h时表达开始明显下降(E-cad:1.059±0.004,P=0.000;Cx43:0.477±0.076,P=0.032),FN和α-SMA于处理24h时表达开始明显增高(FN:0.872±0.134,P=0.011;α-SMA:0.516±0.049,P=0.000);mTOR的磷酸化水平从培养的6h开始明显增高(0.542±0.124,P=0.003),并呈时间依赖性表达上调,在24h时达到最高水平,但总mTOR的表达水平没有明显变化。结论 TGF-β2诱导HLEC上皮-间叶样转化过程中mTOR磷酸化激活,并随间叶样转化程度的增高而表达增加,提示mTOR可能参与了HLEC向间叶样细胞转化的过程。