ILK SiRNA对TGF-β2诱导的人Tenon囊成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨小干扰RNA(the small interference RNA,SiRNA)沉默整合素链接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因对转化生长因子-β₂(transforming growth factor beta 2,TGF-β₂)诱导的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)增殖和凋亡的影响。

方法：体外培养HTFs细胞,波形蛋白(Vimentin)和角蛋白(keratin)免疫荧光染色进行鉴定。实验分组包括NC组：正常对照HTFs; H+T组：HTFs+5μg/L TGF-β₂; H+T+NC SiRNA组：HTFs+5μg/L TGF-β₂+50nmol/L阴性对照SiRNA; H+T+ILK SiRNA组：HTFs+5μg/L TGF-β₂+50nmol/L ILK SiRNA。50nmol/L ILK SiRNA转染HTFs细胞,5μg/LTGF-β₂刺激后,分别利用Western-blot检测细胞内ILK的蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖能力,Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡。

结果：Western-blot结果显示,TGF-β₂可以明显上调HTFs细胞内ILK的表达,ILK SiRNA可以明显抑制TGF-β₂诱导的ILK蛋白表达(P<0.05)。CCK-8检测结果显示,5μg/L TGF-β₂可以促进HTFs细胞增殖,ILK SiRNA转染后48h,细胞的增殖明显受到抑制,且低于正常对照组(P<0.05)。Hoechst 33342/PI双染结果显示,TGF-β₂并不诱导HTFs细胞发生凋亡(P>0.05),但ILK SiRNA可以诱导HTFs细胞发生明显凋亡,并出现少量坏死细胞(P<0.05)。

结论：ILK SiRNA可以抑制TGF-β₂诱导的HTFs增殖,并诱导HTFs细胞发生凋亡。     

EW-7197对TGF-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及机制

目的：探讨ALK5抑制剂EW-7197对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增殖和迁移的影响及其机制。

方法：采用MTS法检测细胞增殖率，并摸索EW-7197最佳的作用浓度和作用时间。之后将细胞分为3个组，分别为正常对照组、TGF-β1诱导组和TGF-β1+EW-7197处理组，采用Transwell小室观察各组细胞迁移情况，采用Western blot检测各组细胞Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平。

结果：MTS结果显示，不同处理条件的EW-7197以6.0μmol/L作用24h的细胞增殖率最低(均P<0.01)。Transwell小室实验结果显示，TGF-β1诱导组的细胞迁移数量为228.0±17.0个/视野，明显高于正常对照组(149.0±15.0个/视野)和TGF-β1+EW-7197处理组(46.0±8.0个/视野)(均P<0.01)。Western blot检测结果显示，TGF-β1诱导组细胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3相对表达量高于正常对照组和TGF-β1+EW-7197处理组(均P<0.001)。

结论：EW-7197能够通过TGF-β/Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖和迁移。     

曲古抑菌素A抑制TGF-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞活化的作用

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对TGF-β₁诱导人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts, HTFs)增殖及Ⅰ型胶原纤维合成的影响。

方法：首先,将不同浓度(200、400、600、800nmol/L)TSA作用HTFs共24h后,MTT法检测其对细胞活力的影响; 然后,不同浓度(400、600nmol/L)TSA与5ng/mL TGF-β₁混合作用于HTFs共24h,MTT法检测其对细胞活力的影响; 最后,RT-PCR和Western-blot法分别检测不同浓度(400、600nmol/L)TSA与5ng/mL TGF-β₁混合以及600nmol/L TSA对HTFsⅠ型胶原纤维的mRNA及蛋白表达的影响。

结果：MTT证实,与对照组相比,400nmol/L及以上浓度TSA作用组,HTFs活力显著下降(P<0.05); 两种浓度(400、600nmol/L)TSA均可减弱TGF-β₁促HTFs增殖的作用(P<0.05); RT-PCR和Western-blot证实两种浓度(400、600nmol/L)TSA对TGF-β₁诱导上调的Ⅰ型胶原纤维在基因转录及蛋白表达水平有逆转作用。

结论：TSA能够抑制TGF-β₁诱导的HTFs增殖,并减弱Ⅰ型胶原纤维基因转录及蛋白表达水平。     

转化生长因子-β2诱导人Tenon囊成纤维细胞转化及其在瘢痕形成中的作用

背景 研究表明转化生长因子-β2(TGF-β2)能够促进瘢痕形成,但其在青光眼滤过术后局部瘢痕形成中的作用机制值得研究. 目的 探讨TGF-β2对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)转化以及在滤过术后瘢痕形成中的作用.方法 在斜视手术中获取3例患者的Tenon囊组织,并用组织块培养法在含质量分数10％胎牛血清的DMEM中培养,培养的细胞贴壁后达到70％ ～ 80％亚融合状态时更换为无血清培养基饥饿培养24 h,然后分别加入质量浓度1、2、5、10、20 μg/L TGF-β2诱导HTFs 24 h,另用2μg/L或5μg/L TGF-β2诱导HTFs 6、24、48、72 h,阴性对照组培养基中不加TGF-β2.用Western blot法检测HTFs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和pSmad2蛋白的表达,采用细胞免疫荧光技术检测α-SMA及纤维状肌动蛋白(F-actin)表达的定位,采用凝胶收缩实验检测培养细胞收缩力的变化.结果 不同质量浓度TGF-β2组HTFs中α-SMA表达的强度均明显强于阴性对照组,2μg/L、5μg/L TGF-β2作用24～48 h后HTFs中α-SMA表达强度达峰值,10 μg/L、20 μg/L TGF-β2组较2μg/L、5μg/L TGF-β2组α-SMA蛋白表达强度减弱.对照组HTFs中有少量α-SMA及F-actin表达,1、2、5μg/L TGF-β2组α-SMA及F-actin荧光表达明显增强,阳性细胞数明显增加,10 μg/L TGF-β2组α-SMA及F-actin荧光表达较低质量浓度组减弱.2μg/L TGF-β2作用后pSmad2表达强度明显强于PBS组和FBS组,在作用后30 min ～2 h表达较强,2h后开始出现下降.对照组HTFs收缩凝胶面积所占原面积的百分数为(78.00±3.13)％,1、2、5、10 μg/L TGF-β2组分别为(63.88±1.78)％、(20.69±0.65)％、(19.49±0.54)％、(16.24±0.84)％,HTFs收缩凝胶面积占原面积的百分数随着TGF-β2质量浓度的增加而明显增加(F组别=859.400,P=0.000).结论 TGF-β2可诱导成纤维细胞转分化,一定程度上其作用呈质量浓度依赖性和时间依赖性,且细胞收缩力随质量浓度的增加而增强,可能是青光眼滤过术后滤过通道建立失败的重要机制.     

氯化锂对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的影响

目的：观察氯化锂（Lithium chloride）对人眼Tenon囊成纤维细胞（human Tenons capsule fibroblasts, HTFs）体外生长的抑制效应,并探讨其作用机制。 方法：磺基罗丹明（SRB）法和BrdU法检测细胞生长抑制率;采用流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期的变化;Hoechst 33258染色后荧光显微镜观察细胞形态学的改变。结果：在40-160mmol/L范围内,氯化锂能够抑制HTFs的增殖,且呈剂量与时间依赖性。氯化锂使HTFs阻滞于G2/M期,且能诱导细胞凋亡,高浓度组尤为明显。结论：氯化锂能抑制HTFs增殖,机制为诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G2/M期。     

环孢素A对人Tenon''''s囊成纤维细胞增殖及TGF-β1分泌的影响

目的 观察环孢素A(CsA)对体外培养的人Tenon’s囊成纤维细胞(HTFs)增殖及其转化生长因子β1(TGF-β1)分泌的影响。方法 以体外培养的人HTFs为实验对象，分别加入0．00l～10μg／mL CsA作用48h，细胞计数观察CsA对细胞增殖的影响。收集0．00l～5μg／mL CsA处理后细胞培养上清液，采用ELISA方法检测细胞TGF-β1的分泌量。光镜及透射电镜观察细胞的结构变化。结果 CsA在.1～10μg/mL范围内以质量浓度依赖方式抑制人HTFs的增殖，IC50为0．55μg／mL，并在0．01～5μg／mL范围内刺激细胞TGF-β1的分泌。CsA作用后细胞形态学改变的主要特征为胞浆内大量空泡形成。结论 一定质量浓度的CsA可能通过直接的细胞损伤作用在促进TGF-β1分泌的同时仍显著抑制人HTFs的增殖。     

氯化锂对人眼Tenon 囊成纤维细胞增殖的影响

目的：观察氯化锂（Lithium chloride）对人眼Tenon囊成纤维细胞（human Tenons capsule fibroblasts, HTFs）体外生长的抑制效应,并探讨其作用机制。 方法：磺基罗丹明（SRB）法和BrdU法检测细胞生长抑制率;采用流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡和细胞周期的变化;Hoechst 33258染色后荧光显微镜观察细胞形态学的改变。 结果：在40~160mmol/L范围内,氯化锂能够抑制HTFs的增殖,且呈剂量与时间依赖性。氯化锂使HTFs阻滞于G₂/M期,且能诱导细胞凋亡,高浓度组尤为明显。 结论：氯化锂能抑制HTFs增殖,机制为诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G₂/M期。     

miR-200a对结膜成纤维细胞增生和迁移的调控作用及其机制

背景 青光眼滤过性手术后手术区域瘢痕化是导致抗青光眼手术失败的主要因素,因此越来越多的研究关注瘢痕形成的原因和过程. 目的 比较青光眼滤过术后滤过区人瘢痕组织来源成纤维细胞(HSFs)与人正常Tenon囊来源成纤维细胞(HTFs)增生迁移能力的差异以及微小RNA200a(miR-200a)对结膜成纤维细胞生物学行为的抑制作用,并探讨产生这种差异的可能机制. 方法 收集斜视手术过程中切取的正常Tenon囊组织和青光眼滤过术后手术区瘢痕组织,对成纤维细胞进行原代培养,采用细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测不同来源成纤维细胞的增生能力;采用细胞划痕试验检测细胞的相对迁移距离;采用实时荧光定量PCR法检测不同来源成纤维细胞中转化生长因子-B1(TGF-β1)mRNA和miR-200a mRNA的表达.于HTFs培养基中分别加入0、1、2和5 ng/ml TGF-β1拟似物,于HSFs培养基中分别加入0.00、0.25、0.50、1.00μs/mlTGF-β1抑制剂,细胞处理24 h,采用CCK8法检测细胞增生能力;用2 ng/ml TGF-β1拟似物处理HTFs,用1.00 μg/ml TGF-β1抑制剂处理HSFs,分别采用划痕法检测不同处理组细胞的相对迁移距离,采用实时荧光定量PCR法检测不同处理组细胞中miR-200a mRNA的相对表达量. 结果 原代培养的细胞胞体较大,呈纺锤形或星形,细胞核呈卵圆形,对角蛋白抗体呈弱阳性反应,对波形蛋白抗体呈阳性反应.HSFs的增生值(A值)为1.476±0.110,明显高于HTFs的0.958±0.074,差异有统计学意义(t=24.900,P=0.016);HSFs中TGF-β1 mRNA相对表达量高于HTFs,是HTFs的(1.739±0.205)倍,差异有统计学意义(t=6.358,P=0.024);HSFs中miR-200a mRNA的相对表达量明显低于HTFs,是HTFs的(46.23±10.78)％,差异有统计学意义(t=7.394,P=0.018).与添加2 ng/ml TGF-β1拟似物的HTFs相比,添加TGF-β1拟似物的HSFs相对迁移距离增加了(3.533±0.402)倍,miR-200a mRNA相对表达量低至(45.4±7.3)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与添加1.00 μg/ml TGF-β1抑制剂的HTFs相比,培养基中添加TGF-β1抑制剂后,HSFs的相对迁移距离幅度降低至(64.3±6.5)％,miR-200a mRNA相对表达量明显增加(3.106±0.415)倍,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 HSFs的增生及迁移能力均明显强于HTFs,可能与HSFs中miR-200a表达量低有关.MiR-200a与TGF-β1在调控成纤维细胞的增生和迁移能力方面发挥相反的作用.     

K115对TGF-β1诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制

目的　探讨K115对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法　人Tenon 囊成纤维细胞取自于河北省人民医院眼科行青光眼手术的患者。采用CCK-8实验检测K115对人Tenon 囊成纤维细胞增殖的影响,筛选出TGF-β1对细胞增殖最佳作用浓度为5.0 μg·L^-1,最佳作用时间为24 h;K115对细胞增殖起始作用浓度为5.0 μmol·L^-1,最佳作用浓度为10.0 μmol·L^-1。依据这两个浓度进行分组,分别是对照组（不加TGF-β1与K115）,TGF-β1组（加5.0 μg·L^-1 TGF-β1）,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组（加5.0 μg·L^-1TGF-β1和5.0 μmol·L^-1的K115）,TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组（加5.0 μg·L^-1 TGF-β1和10.0 μmol·L^-1 的K115）。采用Transwell 实验检测K115对人Tenon 囊成纤维细胞迁移的影响;免疫荧光法测定人Tenon 囊成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。对实验所得各指标进行统计学分析。结果　本研究细胞培养状态良好,6～8周可见人Tenon 囊成纤维细胞铺满培养瓶瓶底。用CCK-8 试剂盒检测各组细胞增殖情况结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组光密度值分别为0.977±0.042、1.306±0.059、0.862±0.035、0.558±0.042,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组光密度值均小于TGF-β1组 (均为P<0.05),并且呈现浓度依赖性减小,K115浓度越大细胞增殖减少幅度越大。Transwell 实验结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组、TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组迁移细胞数分别为（38.67±3.06）个、（81.00±4.00）个、（44.33±3.21）个、（23.67±2.52）个;TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组与TGF-β1组比较,迁移细胞数降低,差异有统计学意义（P<0.05）;TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组与对照组及TGF-β1组比较,迁移细胞数均明显降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。各组细胞内α-SMA蛋白免疫荧光染色结果显示,对照组人Tenon 囊成纤维细胞胞浆内可见散在分布的绿色荧光物质,TGF-β1处理后24 h（TGF-β1组）,胞浆内绿色丝状荧光物质明显增加,荧光强度差异有统计学意义（P<0.05）;与TGF-β1组比较,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组和 TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组细胞胞浆内的荧光强度呈浓度依赖性减弱,K115浓度越高荧光强度减弱越明显(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,对照组细胞凋亡率为（2.400±0.346）%,TGF-β1组为（0.900±0.173）%,TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组为（1.333±0.252）%,TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组为（1.067±0.058）%;TGF-β1组的细胞凋亡率较对照组降低（P<0.05）; TGF-β1+5.0 μmol·L^-1 K115组和TGF-β1+10.0 μmol·L^-1 K115组的细胞凋亡率均较对照组降低（均为P<0.05）,而与TGF-β1组比较,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　K115对TGF-β1诱导的人Tenon 囊成纤维细胞增殖和迁移有明确的抑制作用,其作用机制可能与K115抑制了TGF-β1诱导的细胞内α-SMA的表达进而调控了细胞活化有关。     

阿昔洛韦对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖迁移的影响

目的:探索阿昔洛韦(ACV)对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增殖和凋亡的影响以及作用机制。方法:将HTFs分为ACV处理组和空白组;CCK8检测不同浓度梯度下的细胞增殖速率,划痕实验检测HTFs迁移能力,流式细胞术检测HTFs凋亡以及细胞周期。结果:与空白组相比,ACV处理组(终浓度分别为1.125、2.25、3.375、4.5mmol/L)HTFs增殖速率显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性。4.5mmol/L ACV处理组划痕细胞迁移率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P=0.0005),细胞周期G0/G1期峰值升高(P=0.0011),S期下降(P=0.0006),细胞周期被阻滞在G0/G1期。结论:阿昔洛韦可以通过阻滞HTFs周期促进细胞凋亡,抑制HTFs的增殖和迁移。     

TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞生物学行为改变及表达整合素连接激酶(ILK)的研究

目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor beta 2,TGF-β2)对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)生物学行为及表达整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的影响.方法 组织块贴壁法培养原代HTFs,免疫荧光染色鉴定波形蛋白和角蛋白.MTT法检测不同浓度TGF-β2对HTFs细胞的促增殖作用,RT-PCR检测TGF-β2作用前后α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)、ILK mRNA的表达,Western Blot检测α-SMA、ILK、E-cadherin蛋白的表达,细胞免疫荧光染色检测α-SMA、E-cadherin蛋白的表达.结果 MTT检测结果显示,TGF-β2作用48 h、72 h,5.0 μg· L-1及10.0 μg· L-1诱导下的OD值显著高于0.1μg·L-1、1.0 μg·L-1组及空白对照组(均为P＜O.05),5.0 μg·L-1及10.0 μg·L-1作用48 h及72 h的OD值显著高于24 h(均为P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,5.0μg·L-1TGF-β2诱导48 h后,α-SMA mRNA及ILK mRNA水平和空白对照组相比明显上调,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).Western Blot检测结果显示,ILK、α-SMA及E-cadherin在空白对照组和5.0 μg· L-1TGF-β2处理组均有表达,但TGF-β2能够明显上调三者的表达,5.0 μg·L-TGF-β2处理48 h组与空白对照组差异均有统计学意义(均为P＜0.05).细胞免疫荧光染色结果显示,TGF-β2处理组α-SMA、E-cadherin均有荧光表达,其中oα-SMA表达在细胞质中,而E-cadherin在细胞质和细胞核中均有表达.结论TGF-β2可以诱导体外培养HTFs增殖,转分化及黏附性增强,同时促进ILK的高表达,提示ILK在青光眼术后瘢痕化过程中可能也起到一定作用.     

沉默GFAP基因调控高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞增殖与凋亡

目的：研究沉默胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)增殖和凋亡的影响及其机制。

方法：采用qRT-PCR法检测高糖(30mmol/mL)和低糖(5mmol/mL)处理的hRMECs中GFAP的表达。通过慢病毒介导法建立GFAP基因稳定沉默的高糖诱导的hRMECs细胞模型,用SRI-011381(TGF-β信号通路特异性激活剂)、二甲基亚砜(DMSO)处理该细胞模型,采用Western blot法检测细胞中GFAP、转化生长因子-β1(TGF-β1)、转录激活因子2(Smad2)、Smad3蛋白的表达,并分别采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。

结果：高糖处理的hRMECs中GFAP表达水平显著升高。通过慢病毒介导法可成功构建GFAP基因沉默的高糖诱导的hRMECs细胞模型,且沉默GFAP后,细胞的增殖能力明显提高,凋亡率明显抑制,TGF-β信号通路关键基因TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表达均明显抑制,而激活TGF-β信号通路可逆转沉默GFAP对高糖诱导的hRMECs细胞的增殖促进和凋亡抑制作用。

结论：沉默GFAP基因可促进高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,其机制可能与TGF-β信号通路失活相关。     

氯化锂对人眼Tenon囊成纤维细胞TGF-β及CTGF的影响

目的:研究氯化锂(lithium chloride,LiCl)对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts,HTFs)转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)及结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响并探讨其作用机制.方法:体外培养HTFs并通过vimentin免疫荧光染色技术及细胞形态特征观察鉴定细胞;将HTFs分为实验组(80mmol/L LiCl处理48h)和对照组(未用药).用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, Real time-qPCR)检测两组细胞内TGF-β及CTGF基因的表达,Western blot检测两组细胞内TGF-β及CTGF蛋白的表达.结果:体外培养的HTFs能够表达TGF-β及CTGF.与对照组比较,实验组中TGF-β、CTGF基因表达下降,差异均具有统计学意义(t=20.042、14.995,P<0.05);与对照组比较,实验组中TGF-β、CTGF蛋白表达下降,差异均具有统计学意义(t=46.058、12.452, P<0.05).结论:体外培养的HTFs在基因和蛋白水平表达TGF-β及CTGF,LiCl能够抑制该过程,其可能通过该机制抑制HTFs增殖,此研究为LiCl用于青光眼滤过术后瘢痕化调控提供了实验依据.     

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞EMT的抑制作用

目的：探究吡咯脘二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对转化生长因子-beta2(TGF-β2)诱导人晶状体上皮细胞(LECs)上皮-间充质转化(EMT)的逆转机制。

方法：TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞EMT,并给予不同浓度PDTC处理TGF-β2诱导的LECs。CCK-8、划痕试验检测细胞增殖与迁移,Western Blot检测EMT标志物E-cadherin、α-SMA和NF-κB信号传导通路相关蛋白表达,以及凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、Caspase-3、细胞周期蛋白D₁的表达。

结果：TGF-β2处理组细胞增殖和迁移活力明显高于未添加TGF-β2的实验组; E-cadherin表达下调,α-SMA表达上调。在TGF-β2的作用下NF-κB p65和磷酸化的NF-κB p65表达增加(P<0.05)且在TGF-β2 10 ng/mL刺激浓度时LECs表现出较强的增殖活力和迁移能力。PDTC逆转EMT和诱导细胞凋亡的机制研究表明,PDTC干预处理后细胞活力和迁移能力都显著降低,PDTC抑制IκB的磷酸化进而抑制NF-κB核移位,NF-κB信号通路中NF-κBp65/p-NF-κB p65、Iκκ-α/p-Iκκ-α表达下调(P<0.05),诱导促凋亡蛋白BAX/Caspase-3表达上调、抑凋亡蛋白BCL-2、细胞周期蛋白Cyclin D₁表达下调,NF-κB/IκB mRNA表达下调,凋亡相关mRNA BAX表达上调BCL-2表达下调。

结论：PDTC可显著逆转由TGF-β2诱导的LECs细胞EMT过程,可能与抑制NF-κB信号通路活化使NF-κB p65/IκB/Iκκ-α表达降低以及激活凋亡相关蛋白表达有关,PDTC可通过抑制NF-κB信号通路达到逆转EMT的进程并使异常增殖的细胞发生凋亡,这将为后发性白内障的治疗提供新的潜在的治疗药物。     

羟喜树碱诱导的人Tenon囊成纤维细胞凋亡及其机制

背景 青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增生是滤过泡功能下降的主要原因,羟喜树碱是诱导肿瘤细胞及多种非肿瘤细胞凋亡的药物.目前已有羟喜树碱诱导成纤维细胞凋亡的相关报道,但其作用机制尚不完全清楚. 目的 探讨羟喜树碱是否能诱导HTFs凋亡并研究其作用机制.方法 取离体＜6h的供体结膜囊组织,以组织块培养法原代培养HTFs,用含质量分数10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基继续传代培养,用波形蛋白及角蛋白对培养的细胞进行鉴定,取3～6代细胞进行实验.分别将0.01、0.05、0.10 g/L羟喜树碱加入培养基中作用5 min,未加入羟喜树碱的细胞作为对照组,采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)法检测各组细胞的增生能力并进行比较.用0.10 g/L羟喜树碱处理细胞,继续培养24 h,用annexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,用JC-1染色检测HTFs线粒体膜电位,采用Western blot法检测HTFs中半胱氨酸天冬酶-3(caspase-3)、caspase-9及线粒体/细胞质中细胞色素C(cyt C)蛋白的表达,对各组中的测量结果进行比较.结果 0、0.01、0.05、0.10 g/L羟喜树碱组的HTFs增生值(A450)分别为0.9716±0.0608、0.8035±0.0346、0.7048±0.0446和0.6265±0.0286,总体差异有统计学意义(F=26.372,P=0.002),0.01、0.05、0.10 g/L羟喜树碱组HTFs A450值均低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05),以0.10 g/L羟喜树碱组HTFs A450值最低.Annexin V/PI双染色检测发现,0.10 g/L羟喜树碱组HTFs凋亡率为(18.72±1.41)％,明显高于对照组的(3.67±0.36)％,差异有统计学意义(t=-10.374,P=0.001);0.10 g/L羟喜树碱组HTFs中caspase-3、caspase-9蛋白的表达强度明显强于对照组.JC-1染色发现,0.10 g/L羟喜树碱处理5 min后细胞质中单体JC-1的绿色荧光明显强于对照组,而线粒体中聚合态JC-1的红色荧光弱于对照组.Western blot检测发现,0.10 g/L羟喜树碱组HTFs线粒体中cyt C蛋白表达灰度值为0.0124±0.0016,高于对照组的0.0216±0.0096,雨0.10 g/L羟喜树碱组HTFs细胞质中cyt C蛋白表达灰度值为0.0605士0.0022,低于对照组的0.0301±0.0016,差异均有统计学意义(线粒体:t=4.865,P=0.014;细胞质:t=-11.177,P=0.001).结论 羟喜树碱诱导HTFs凋亡,引起线粒体的稳态破坏,激活线粒体凋亡途径.     

转化生长因子-β1对人Tenon囊成纤维细胞表型转化的作用

目的探讨转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)对人Tenon囊成纤维细胞(humansubconjunctivalTenon’scapsulefibroblast,HTCF)表型转化的作用。方法人白内障手术中取结膜下Tenon囊组织块培养成纤维细胞。用第5~9代细胞,以不同浓度TGF-β1(0μg·L-1,2μg·L-1,5μg·L-1,10μg·L-1,20μg·L-1)、不同时间(24h、48h、72h)诱导成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型。结果体外用TGF-β1诱导HTCF,在0~10μg·L-1内,TGF-β1呈剂量依赖性增加平滑肌肌动蛋白在蛋白水平的表达,至20μg·L-1时表达迅速下降;10μg·L-1TGF-β1诱导48h后其平滑肌肌动蛋白的表达与24h、72h相比,差异有显著性(P<0.01,n=6)。结论一定浓度和剂量的TGF-β1能显著诱导HTCF表型转化为肌成纤维细胞,在人Tenon囊组织局部组织损伤修复及瘢痕形成中具有重要作用。     

羟基喜树碱对人眼Tenon蒺s囊成纤维细胞的抑制作用

目的：研究羟基喜树碱（HCPT）对人眼Tenon＇s囊成纤维细胞（human Tenon＇s capsule fibroblasts,HTFs）的细胞周期、细胞毒性的影响,探讨其抗纤维化作用机制。方法：取本院眼库新鲜眼球（〈6h）的Tenon＇s囊组织,用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养;流式细胞仪测定HCPT和丝裂霉素C（MMC）对HTFs细胞周期的影响;台盼蓝染色法鉴定HCPT和MMC对HTFs的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起;RT-PCR检测HCPT、MMC作用24h后HTFs的Smad7 mRNA基因表达。结果：HTFs体外生长良好,可用于实验研究。不同浓度HCPT（0,0.25,1,4mg/L）作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G2期细胞百分数的组间差异均有统计学意义（P〈0.05）;不同浓度MMC（0,0.025,0.1,0.4mg/L）作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G1期细胞百分数的组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。不同浓度HCPT和MMC作用后的HTFs活细胞率和空白对照组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。4mg/LHCPT,0.4mg/LMMC作用HTFs24h后,Smad7 mRNA表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：HCPT将HTFs阻滞于G2期,MMC将HTFs阻滞于G1期;HCPT,MMC抑制HTFs的作用和药物的细胞毒性无关;HCPT抑制HTFs的增殖可能是通过上调Smad7mRNA的表达阻断TGF-茁信号通路实现的。     

紫杉醇对人Tenon囊成纤维细胞增生的抑制作用及机制

背景人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的异常增生是导致抗青光眼滤过手术失败的主要原因。寻找抑制HTFs增生的药物对抑制青光眼术后功能性滤过泡的瘢痕化有重要意义。目的观察紫杉醇对体外培养的HTFs增生、凋亡、细胞周期以及基质金属蛋白酶-1（MMP-1）表达的影响。方法收集抗青光眼滤过术中切除的人眼Tenon囊组织,用组织块培养法培养HTFs并进行传代,取3～6代细胞用于实验。采用小鼠抗人角蛋白抗体、小鼠抗人波形蛋白抗体、小鼠抗人结蛋白抗体、小鼠抗人S-100抗体行免疫组织化学染色鉴定培养的HTFs。在培养基中分别加入0、1×10^-8、1×10^-8、1×10^-6mol／L紫杉醇,采用实时细胞电子分析系统（RT—CES）观察不同浓度紫杉醇作用后HTFs的细胞指数变化;采用DAPI染色法观察各组细胞的凋亡情况;用流式细胞术检测不同浓度紫杉醇作用后HTFs各细胞周期比例;采用实时定量PCR（real—timePCR）和ELISA法检测各组HTFs中MMP-1mRNA和蛋白的表达量,分别以MMP-1mRNA／GAPDHmRNA和MMP-1蛋白质量浓度（μg／L）表示。结果组织块原代培养7d内可见细胞游出,呈长梭形和不规则三角形,培养的细胞抗波形蛋白抗体染色阳性,而抗角蛋白抗体、抗结蛋白抗体和抗S-100抗体染色阴性。培养基中加入紫杉醇作用24h后,1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇组平均细胞指数值分别为1．09±0．191、0．665±0．093和0．473±0．117,均明显低于0mol／L紫杉醇组的1．514±0．283,差异均有统计学意义（均P=0．000）;紫杉醇作用后,HTFs的细胞核内可见呈DAPI蓝色荧光的颗粒状物质,荧光强度随着紫杉醇浓度的增加而增强。l×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇分别作用12h后,G,／M期HTFs的比例分别为（9．20±0．80）％、（12．37±0．45）％和（13．80±0．35）％,明显高于0mol／L紫杉醇组的（7．17±0．50）％,差异均有统计学意义（P=0．005、0．000、0．000）。与0mol／L紫杉醇组比较,1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇作用30min后HTFs中MMP-1mRNA的相对表达量均明显下降,差异均有统计学意义（均P=0．000）;1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇作用24h后,HTFs中MMP-1蛋白的表达量均明显低于0mol／L紫杉醇组,差异均有统计学意义（P=0．010、0．002、0．001）。结论1×10^-8～1×10^-6mol／L紫杉醇可抑制体外培养HTFs的增生,诱导细胞凋亡,阻断细胞的有丝分裂,其作用机制可能与下调细胞中MMP-1的表达有关。     

羟基喜树碱对人眼Tenon's囊成纤维细胞的抑制作用

目的：研究羟基喜树碱(HCPT)对人眼Tenon's囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts, HTFs)的细胞周期、细胞毒性的影响,探讨其抗纤维化作用机制。

方法：取本院眼库新鲜眼球(<6h)的Tenon's囊组织,用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养; 流式细胞仪测定HCPT和丝裂霉素C(MMC)对HTFs细胞周期的影响; 台盼蓝染色法鉴定HCPT和MMC对HTFs的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起; RT-PCR检测HCPT、MMC作用24h后HTFs的Smad7 mRNA基因表达。

结果：HTFs 体外生长良好,可用于实验研究。不同浓度HCPT(0,0.25,1,4mg/L)作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G2期细胞百分数的组间差异均有统计学意义(P<0.05); 不同浓度MMC(0,0.025,0.1,0.4mg/L)作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G1期细胞百分数的组间差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度HCPT和MMC作用后的HTFs活细胞率和空白对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。4mg/L HCPT,0.4mg/L MMC作用HTFs 24h后,Smad7 mRNA表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

结论：HCPT将HTFs阻滞于G2期,MMC将HTFs阻滞于G1期; HCPT,MMC抑制HTFs的作用和药物的细胞毒性无关; HCPT抑制HTFs的增殖可能是通过上调Smad7 mRNA的表达阻断TGF-β信号通路实现的。     

转化生长因子-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞表型转化的信号通路研究

目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)对人结膜下Tenon囊成纤维细胞(human subconjunctival Tenon's capsule fibroblast,HTCF)表型转化的作用及其信号转导通路.方法 白内障手术中取人结膜下Tenon囊组织块培养成纤维细胞.用第5～9代细胞,以10 μg/L TGF-β1诱导HTCF 48 h,使其表型转化为肌成纤维细胞(myofibroblast,MF).用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型.在诱导后不同时间点(0、5、30、60、120、180 min,12、24、36 h),用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术测定smad2、AKT、ERK、P38蛋白表达.结果 10 μg/L TGF-β1诱导HTCF后α-SMA在24 h达峰值,蛋白表达在48 h最高;10 μg/L TGF-β1诱导HTCF后smad2、AKT、P38表达具有时间双向性,smad2具有两个峰值.结论 TGF-β1能显著诱导HTCF,使其表型转化为MF,smad信号通路参与了这一过程.