沉默神经元HIF-1α和PTEN的表达对体外培养的大鼠神经元氧糖剥夺损伤的影响

目的 利用RNA干扰技术分别沉默神经元中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和磷酸酶并和张力蛋白同源物（PTEN）基因,论证它们在神经元体外氧糖剥夺（OGD）损伤后的功能调控作用。方法 构建并筛选靶向HIF-1α及PTEN基因的shRNA慢病毒载体;提取并将原代神经元分为4组：（1）NC组,仅加空载病毒;（2）NC+OGD组,加空载病毒后缺氧;（3）Si-hif-1α+OGD组,加Si-hif-1α病毒后缺氧;（4）Si-pten+OGD组,加Si-pten病毒后缺氧,均在培养第3天感染病毒,第7天OGD损伤模拟细胞缺氧。缺氧后24 h行荧光实时定量PCR（qRT-PCR）法检测干扰效率,行乳酸脱氢酶（LDH）检测及AnnexinV-FITC/PI检测神经元细胞损伤、凋亡变化,Western blot检测相应蛋白表达变化。结果 慢病毒介导的shRNA能有效沉默目的基因mRNA的表达;HIF-1α沉默后,缺氧细胞的损伤及凋亡加重,PTEN蛋白的表达升高,p-PTEN、p-AKT、NR2A及VEGFa表达降低（P<0.05）;PTEN沉默后,缺氧细胞的损伤及凋亡有所减轻,p-PTEN、p-AKT表达升高（P<0.05）,HIF-1α、NR2A及VEGFa的表达无显著变化（P>0.05）。结论 慢病毒介导的shRNA能有效沉默神经元HIF-1α及PTEN的表达,逆转神经元缺氧损伤中HIF-1α升高对PTEN活性的抑制,参与神经元损伤调控。     

HIF-1α靶向RNAi慢病毒载体的构建及对Panc-1细胞HIF-1α抑制作用的研究

目的：构建针对缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体,并研究其对胰腺癌Panc-1细胞HIF-1α基因表达的抑制作用。方法：针对HIF-1α基因序列设计合成4条shRNA片断并构建RNAi慢病毒载体,同时构建HIF-1α基因过表达质粒。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot进行外源筛靶。将外源筛靶成功的干扰质粒psc1516进行慢病毒包装,再感染Panc-1细胞,Western blot和荧光定量PCR检测沉默前后Panc-1细胞中HIF-1α的蛋白及mRNA的表达。结果：经PCR及测序证实4种干扰载体及1种过表达载体构建成功,Western blot外源筛靶显示4个靶点均能有效敲减目的基因的表达。细胞试验表明psc1516干扰载体能有效抑制Panc-1细胞中HIF-1α的mRNA及蛋白的表达,当MOI=4时,对HIF-1αmRNA的抑制率为87.4%,蛋白抑制率达90.0%以上。结论：RNAi慢病毒载体可有效地抑制胰腺癌Panc-1细胞中HIF-1α的表达。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对胃癌细胞生物学行为的影响

目的:观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胃癌细胞增殖﹑凋亡﹑侵袭性的影响并探讨其可能的分子机制。方法:将HIF-1α短发夹RNA(shRNA)重组质粒pGCsi-shHIF-1α稳定转染人胃癌细胞SGC-7901;采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α mRNA、蛋白表达水平,Western blot法检测葡萄糖转运蛋白1(Glut-1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及趋化因子受体CXCR4蛋白表达;MTT法、流式细胞仪、transwell试验分别检测转染细胞的增殖、凋亡及侵袭迁移能力。结果:稳定转染pGCsi-shHIF-1α后,SGC-7901细胞HIF-1α表达在mRNA及蛋白水平均受到明显抑制,Glut-1﹑MMP-2﹑CXCR4蛋白表达较对照组降低;细胞增殖能力较对照组明显降低,细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);细胞体外侵袭迁移能力受到明显抑制(P<0.01)。结论:pGCsi-shHIF-1α能有效沉默胃癌细胞SGC-7901 HIF-1α基因表达,抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭并诱导其凋亡,提示HIF-1α可能通过上调Glut-1﹑MMP-2和C...     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α对人乳腺癌细胞功能的影响

目的研究靶向针对缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的短发夹RNA(shRNA)对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞功能的影响。方法氯化钴模拟低氧环境。采用RNA干扰技术,构建针对HIF-1α的shRNA真核表达载体,转染MCF-7细胞。RT-PCR检测RNA干扰后MCF-7中血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化。实时定量PCR和Westernblot技术分别检测HIF-1αmRNA和蛋白质水平。Sub-G1测定、AnnexinⅤ荧光标记和DNAladder检测细胞凋亡。流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果缺氧后,MCF-7中的HIF-1α表达增加(P<0.01),而凋亡率较常氧降低(P<0.05)。shRNA转染MCF-7后,HIF-1α的表达下调91.63%(P<0.01)。阿糖胞苷诱导或无凋亡诱导剂时,干扰组凋亡率比未转染组分别增高1.75倍(P<0.01)和61.31倍(P<0.01)。与未转染组相比,干扰组中的VEGF下调66.8%(P<0.05)。干扰组细胞周期进程也较未转染组减缓。结论HIF-1α在MCF-7中发挥抗细胞凋亡的作用。本室构建的针对HIF-1α的shRNA能够促进MCF-7凋亡,下调VEGF表达,推迟细胞周期。     

shRNA SIRT3基因对乳腺癌细胞 MCF-7侵袭能力的影响及机制研究

目的：探讨shRNA SIRT3基因对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的影响及机制。方法：以人乳腺癌细胞系MCF-7细胞为实验对象。按照处理方法将乳腺癌MCF-7细胞分成3组,即空白对照组(不转染慢病毒的乳腺癌MCF-7细胞组)、阴性对照组(乳腺癌MCF-7细胞转染无序序列慢病毒载体)和shRNA干扰组(乳腺癌MCF-7细胞转染shRNA SIRT3序列慢病毒载体)。采用实时荧光定量PCR和Western blotting等方法检测SIRT3和凋亡相关因子caspase-3、caspase-9的表达水平;采用Transwell试剂盒检测细胞的侵袭能力。结果：shRNA干扰组SIRT3 mRNA相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01),caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。Western-blotting检测结果显示,shRNA干扰组SIRT3蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P<...     

HIF-1α慢病毒干扰载体构建及GL261小鼠胶质瘤稳定沉默细胞系的建立

目的 研究短发夹状RNA（shRNA）干扰慢病毒表达载体对小鼠胶质瘤GL261细胞系中乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因的沉默效应。方法 构建针对小鼠胶质瘤GL261细胞HIF-1α mRNA的不同干扰靶点的4个shRNA表达载体,筛选出HIF-1α基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA,构建pLenti6.3-shRNA3慢病毒载体感染靶细胞GL261,获得稳定沉默HIF-1α细胞株,利用实时定量PCR和Western blot方法检测稳定细胞株HIF-1α的沉默效应。结果 成功构建了具有HIF-1α沉默效应的慢病毒干扰载体,通过倍比稀释测定干涉病毒滴度为1.15×108TU/mL。实时定量PCR和Western blot实验均证实慢病毒转染后,GL261细胞株中HIF-1α表达水平明显降低。结论 针对HIF-1α基因不同位点的不同shRNA具有干扰效率的差异。特异性的shRNA可稳定地介导HIF-1α基因沉默。     

小RNA干扰技术在治疗肝细胞肝癌中的应用

目的 探讨利用小RNA干扰技术作用缺氧诱导因子1α2α稳定转染肝癌细胞后VEGFR蛋白表达情况.方法 构建HIF1α、HIF2α基因的真核表达载体HIF1α、HIF2α-pcDNA3.1,检测48h(Western Blots);同时用Western Blots方法检测VEGFR蛋白表达.结果 缺氧诱导因子1α2α小RNA干扰稳定转染肝癌细胞.与未转染组和转染空载体组相比,伴随HIF-1α、HIF-2α基因沉默同时VEGF的蛋白表达也下降.结论 缺氧诱导因子1α2α小RNA干扰转染肝癌细胞有效抑制HIF-1α与HIF-2α的表达.为肝癌治疗的新策略奠定了基础.     

HIF-2α-VEGF-Notch信号通路在高强度聚焦超声不完全消融后肝癌中的作用

目的 探讨HIF-1α、HIF-2α、VEGF、Notch等基因在高强度聚焦超声不完全消融肝癌血管新生中的表达及其作用.方法 实验共分5组,HIFU残留肝癌细胞亚系为实验组,未处理肝癌细胞为对照组,转染HIF-2α基因沉默重组慢病毒残留肝癌细胞为抑制HIF-2α组,转染VEGF基因沉默重组慢病毒残留肝癌细胞为抑制VEGF组,转染空载慢病毒残留肝癌细胞为空载组.免疫荧光检测实验组与对照组的VEGF表达.低氧(1％O2)处理实验组与对照组细胞0、6、12、24 h,荧光定量PCR和Westernblot检测HIF-1α、HIF-2α、VEGF mRNA和蛋白表达水平.荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞HIF-1α、HIF-2α、VEGF、Notch、DLL4 mRNA和蛋白表达水平.结果 VEGF蛋白在对照组与实验组细胞中均有表达.HIF-1α在低氧处理12 h达到顶峰,随后下降,而HIF-2α、VEGF随着低氧处理时间增加而呈上升趋势,且实验组HIF-2α、VEGF表达较对照组明显增高(P＜0.05).转染慢病毒后,抑制HIF-2α组HIF-2α、VEGF mRNA和蛋白表达均较实验组显著下调(P＜0.05),抑制VEGF组VEGF、Notch、DLL4mRNA和蛋白表达均较实验组显著下调(P＜0.05),实验组HIF-2α、VEGF、Notch、DLL4mRNA和蛋白表达均高于对照组(P＜0.05).结论 HIF-2α-VEGF-Notch信号通路参与调控高强度聚焦超声残余肝癌血管新生.     

shRNA干扰肾癌细胞株786-O和OS-RC-2中HIF-2α的表达对VEGF的影响

目的构建在哺乳动物细胞中表达的低氧诱导因子-2(HIF-2α)的短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,在体外模拟肿瘤常氧和低氧环境下研究对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。探讨HIF-2α、VEGF两者之间及其与肾透明细胞癌(CCRCC)的关系,HIF-2α可能为CCRCC潜在的新效靶。方法构建HIF-2α shRNA真核表达载体质粒, shRNA测序鉴定。150 umol/L氯化钴(Co Cl2)模拟细胞低氧环境。设对照组(空白、阴性)和实验组。空白对照组不做转染,阴性对照组转染空质粒,实验组转染HIF-2α shRNA重组质粒,每组均设置常氧和低氧环境组。采用Real time-PCR技术检测786-O和OS-RC-2细胞中HIF-2α基因表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测VEGF蛋白表达情况。结果 DNA测序证实重组质粒构建成功, shRNA转染786-O和OS-RC-2细胞,实验组中HIF-2α mRNA表达明显受到抑制,且常氧较低氧环境下HIF-2α mRNA表达降低,低氧环境下凋亡显著;常氧和低氧环境下,实验组VEGF蛋白表达量均下降,且常氧环境下蛋白表达下降明显。结论低氧环境下,HIF-2α mRNA表达量升高,促进VEGF蛋白表达。干扰HIF-2α基因后,细胞凋亡率升高,抑制VEGF蛋白表达。该基因可能为治疗CCRCC提供了新的效靶,为下一步实验鉴定奠定基础。     

PTEN基因对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT通路的影响

 【目的】探讨PTEN基因在子宫内膜癌PI3K/AKT通路中的作用,评估PTEN基因在抗肿瘤治疗中的意义。【方法】利用慢病毒载体系统, 构建人PTEN基因RNA干扰慢病毒载体和PTEN基因过表达慢病毒载体,分别转染PTEN野生型的HEC-1A细胞和PTEN突变型的Ishikawa细胞, 建立PTEN 基因敲减及过表达的细胞模型,Western Blot方法检测PTEN基因敲减或过表达前后PTEN蛋白的表达和AKT通路的活化情况, MTT法检测慢病毒转染前后细胞增殖的变化,流式细胞术检测慢病毒转染前后细胞周期及细胞凋亡率的变化。【结果】1. HEC-1A细胞转染PTEN基因干扰慢病毒载体后,细胞的增殖曲线和细胞凋亡率与对照组比较无明显变化。但Ishikawa细胞转染PTEN基因过表达慢病毒载体后,增殖曲线和细胞凋亡率显示其生长呈明显抑制状态。2.当HEC-1A细胞转染了RNA干扰病毒后（HEC-1A-RNAi）,Western Blot 结果显示PTEN蛋白表达下调,其EGFR, p-EGFR, mTOR, p-mTOR, AKT, p-AKT蛋白表达增强,当Ishikawa细胞转染了过表达载体病毒后（Ishikawa-PTEN）,Western Blot 结果显示其PTEN蛋白表达上调,p-EGFR,p-mTOR,AKT,p-AKT蛋白表达减弱。3.HEC-1A-RNAi细胞周期中G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,Ishikawa-PTEN细胞周期中G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少。【结论】PTEN 基因可以抑制细胞增殖过程, 有可能成为子宫内膜癌患者基因治疗的选择之一。     

预缺氧对大鼠低压缺氧性脑损伤保护作用的实验研究

目的 探讨预缺氧对严重低压缺氧引起大鼠海马神经细胞损伤及学习记忆能力降低的保护作用.方法 ①Wistar大鼠分为对照组、单纯缺氧组、预缺氧复合缺氧组.光镜和电镜观察大鼠海马CA1区神经元形态变化;TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡.②单纯缺氧组和预缺氧复合缺氧组大鼠进行穿梭箱主动回避训练,随后进行低压缺氧,观察大鼠学习记忆能力的改变.结果 预缺氧复合缺氧组大鼠CA1区神经元病理改变较轻,神经元凋亡显著低于单纯缺氧组(P＜0.05);预缺氧复合缺氧组大鼠在严重缺氧后受电击次数和主动逃避时间的增加显著低于单纯缺氧组(P＜0.05).结论 缺氧引起大鼠海马CA1区神经元凋亡等病理改变,并导致学习记忆能力降低;预缺氧对海马CA1区神经元的缺氧性损伤具有保护作用,并能有效减轻严重缺氧所导致的学习记忆能力下降.     

缺氧感受和信号转导

缺氧作为一种伤害刺激能够导致机体整体直至细胞水平发生相应的反应.对于外界氧分压的变化,氧感受器能够感受细胞内外氧分压的变化,产生活性氧(ROS),再由ROS激活下游激酶,直至缺氧相关转录因子的激活,产生诸如红细胞生成素(EPO)、血管衍生生长因子(VEGF)等,而使机体更好地适应外界变化.     

缺氧预处理对L02肝细胞缺氧复氧损伤的抗凋亡保护作用

目的研究缺氧预处理对正常肝细胞株L02缺氧复氧损伤的抗凋亡细胞保护机制.方法建立缺氧预处理细胞模型,随机分为正常对照组、缺氧复氧损伤组(hypoxia reoxygenation,H/R组)和缺氧预处理组(hypoxic precondition,H/P组).使用流式细胞术,检测细胞缺氧复氧处理后l、6、12、18、24 h细胞凋亡率,并分别检测各组细胞缺氧复氧处理后12 h时bcl-2、bcl-xl、bax和P53蛋白的表达量,同时通过透射电镜观察细胞超微结构变化.结果H/P组和H/R组比较,细胞凋亡率显著下降,bcl-2、bcl-xl蛋白表达显著升高,P53、bax蛋白表达量显著降低,透射电镜下可见细胞结构基本维持正常.结论缺氧预处理对缺氧复氧导致的L02肝细胞损伤有明显的保护作用.肝缺氧预处理过程中,bcl-2、bcl-xl、bax及P53蛋白参与了细胞凋亡调控作用.     

西洛他唑抗高原缺氧的药效学评价

目的:高原环境具有低氧分压的特点,氧分压降低导致肺泡携氧量降低,组织可利用氧气减少,从而引发机体组织损伤.西洛他唑是一种磷酸二酯酶III抑制剂,能够增加血红蛋白(hemoglobin,Hb)在组织中的释氧量.本研究旨在探讨西洛他唑的抗缺氧活性及在急进高原缺氧模型中的抗缺氧作用.方法:将40只雄性BALB/C小鼠随机分为...