Menin调控小鼠胚胎早期发育相关基因的研究

目的 研究1型多发性内分泌肿瘤综合征相关基因(Men1)编码的蛋白(menin)对小鼠胚胎早期发育相关基因的调控,并探讨其可能的作用机制.方法 以经丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层细胞培养未分化的小鼠胚胎干细胞,使其体外分化形成胚胎体.RT-PCR鉴定胚胎体胚胎发育期标志基因表达;染色体免疫共沉淀结合启动子基因芯片技术检测成熟胚胎体中menin调控的下游基因,Real-Time PCR鉴定结果.结果 RT-PCR结果表明胚胎体相当于小鼠胚胎发育的早期器官形成期.基因芯片检测显示,menin能调控8 640个备选基因中的784个;基因分析显示,menin能通过多个信号通路调控下游基因,包括Wnt信号通路的1500003O03Rik、Prkca、 Fosl1、 Nfatc3、 Dvl1;TGF-β信号转导途径的Thbs1、Tgfb3、Bmp4、Smurf2;凋亡信号通路的Casp6、1500003O03Rik、Prkar1a、Ripk1、Traf2、Capn5、Endog、Myd88;MAPK信号通路的Casp6、Arrb2、Fgf15、1500003O03Rik、Map3k4、Map2k1ip1、Tgfb3、Prkca、Traf2、Dusp7、Atf2等.结论 Menin可能通过Wnt、MAPK、TGF-β、凋亡等多种信号通路对小鼠胚胎早期发育相关基因进行调控.     

经程序化冷冻的小鼠休眠胚胎的基因表达谱差异分析

目的探讨小鼠休眠胚胎经程序化冷冻后基因表达谱的变化及相关信号通路的改变趋势。方法采用Affymetrix基因芯片检测小鼠正常休眠胚胎和经程序化冷冻后的休眠胚胎的差异表达基因;采用GO分析和Pathway分析等生物信息学方法进一步了解相关信号通路的改变。结果经程序化冷冻后的小鼠休眠胚胎与正常休眠胚胎相比,存在228个差异表达基因,其中50个基因表达上调,178个基因表达下调。Pathway分析显示黏着斑通路、细胞外基质受体相互作用通路、肌动蛋白细胞骨架调节通路、细胞凋亡通路、细胞通讯通路、泛素介导的蛋白质水解通路、甘油磷脂代谢通路、小细胞肺癌通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路等基因差异表达变化趋势明显。结论小鼠休眠胚胎经程序化冷冻后会导致一系列基因调控变化,并可能影响多条信号通路的协同变化。     

赶黄草调控Wnt4抑制TGF-β诱导肺纤维化相关基因表达的研究

目的 探讨赶黄草通过调控Wnt信号通路中的Wnt4抑制转化生长因子-β(TGF-β)诱导的肺纤维化.方法 从基因表达数据库GEO中搜索TGF-β组(6个组)和对照组(5个组)相关转录组学的差异基因RNAs,对信号通路中的Wnt信号进行差异基因GO、KEGG、REACTOME富集,分析TGF-β和Wnt信号通路中相关基因的联系,并在体外实验中验证TGF-β和Wnt信号通路中的相关基因的关系.随后加入赶黄草检测是否通过调控Wnt相关基因来抑制TGF-β诱导的肺纤维化.实验细胞分空白组、TGF-β组、Wnt4组和赶黄草+TGF-β组,采用实时荧光定量PCR法检测MRC-5细胞中的纤连蛋白(FN1)、平滑肌肌动蛋白A2(ACTA2)、Wnt4等基因表达情况,激光共聚焦检测FN1和Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)蛋白荧光定量情况.结果 基因转录组学分析发现,TGF-β通过激活Wnt信号通路中的Wnt4基因使其表达升高,且TGF-β和Wnt信号通路的激活呈正相关.MRC-5细胞的实时荧光定量PCR结果显示,与空白组比较,TGF-β组FN1、Wnt4基因mRNA表达水平明显升高,Wnt4组FN1基因mRNA表达水平明显升高(P<0.05).与TGF-β组比较,赶黄草+TGF-β组FN1、ACTA2、Wnt4 mRNA表达水平明显降低(P<0.05).激光共聚焦显微镜检测结果显示,与TGF-β组比较,空白组和赶黄草+TGF-β组FN1和COL1A1蛋白荧光明显降低(P<0.05).结论 赶黄草可能通过调控Wnt信号通路中Wnt4的表达来抑制TGF-β诱导的肺纤维化.     

Wnt家族基因敲除小鼠胚胎发育异常的研究现状

Wnt信号分子家族调控着多个组织脏器的胚胎发育.本文对目前已建立的Wnt经典传导通路的代表基因Wnt1以及Wnt非经典通路的代表基因Wnt5a等 Wnt家族基因敲除小鼠模型的胚胎发育异常进行综述.     

骨髓间充质干细胞神经分化中Wnt信号通路的基因芯片分析

目的通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)转导Wnt-3a并诱导向神经细胞分化后相关基因的表达变化,寻找Wnt信号通路中调控BMSCs神经分化的靶基因。方法密度梯度离心加差速贴壁法体外分离和纯化BMSCs,原代培养2周后传代。观察细胞形态特征。基于GatewayTM技术构建双表达慢病毒载体,将Wnt-3a转导至BMSCs。设置转导组、未转导组及对照组,其中转导组和对照组转导Wnt-3a,转导组为扩增后的BMSCs-Wnt-3a,对照组取同时期BMSCs-Wnt-3a,未转导组未转导Wnt-3a。诱导转导组和未转导组细胞神经分化,倒置相差显微镜下观察细胞形态。采用基因芯片技术检测Wnt信号通路基因的改变,用RT-PCR来验证相关基因的上调或者下调。结果找到2 959个基因上调,4 623个基因下调。在Wnt信号通路的89个基因当中,与神经系统发育和分化相关基因有不同的变化。从中挑选了2个基因做RT-PCR验证,结果表明与芯片结果一致。结论 Wnt通路激活后,下游的基因转录,促进神经分化。     

TGF-β信号通路与高盐诱发高血压的关系

TGF-β信号通路的基因多态性一直以来被报道与高血压相关,但是具体的关联机制仍存在争议,有研究认为TGF-β信号通路参与高盐诱导的高血压,与高盐诱导高血压正相关;而另有研究表明TGF-β信号通路与高血压负相关,转基因调控TGF-β1基因启动子制备出TGF-β1低表达的转基因小鼠,发现降低TGF-β1表达与提高血管紧张素-肾素-醛固酮系统活性相关,进而导致血压的增高。本文从TGF-β信号通路的基本构成、TGF-β信号通路与高盐诱导高血压的关系和中医心肾一体治疗理念三个方面介绍了TGF-β信号通路与高血压之间关系的最新研究进展。     

中医方药调控肾纤维化相关信号通路的研究进展

肾纤维化相关研究的信号转导通路包括TGF-β1/Smad通路、Wnt/β-catenin信号通路、mTOR信号通路、Sonic Hedgehog通路、ERK1/2通路、P38 MAPK信号通路和HGF/c-met信号通路等.大量实验研究表明,中医方药可通过多环节、多途径、多靶点调节相关信号通路的表达,干预肾纤维化进程.基于此,本文就中医药干预肾纤维化相关信号通路研究进展进行综述,以期为中医药防治肾纤维化疾病提供循证依据.     

Rif1通过BMP4信号传导通路影响小鼠胚胎干细胞自我更新和分化的作用机制

[目的]研究Rif1通过BMP4信号传导通路影响小鼠胚胎干细胞自我更新和分化的作用机制.[方法]从基因表达数据库中下载基因芯片数据(GSE 55129),采用R软件包分别对长期、短期干扰Rif1后的表达谱数据做预处理并筛选差异基因.取长期干扰Rif1的差异基因进行KEGG分析,采用RT-qPCR对KEGG结果进行验证,取短期干扰Rif1的差异基因进行GO分析,选择与胚胎发育有关的基因整合到相关的KEGG通路中.[结果]KEGG分析结果显示,Rif1与TGF-β(BMP4)信号传导通路高度相关(P<0.01);RT-qPCR验证结果证实BMP4表达明显升高(P<0.05);GO分析结果与活化BMP4通路后的效应相一致.[结论]Rif1通过BMP4信号传导通路影响小鼠胚胎干细胞的自我更新和分化.     

R-spondin1在促进人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究Wnt信号通路激活剂R-spondin1在人骨髓间充质干细胞(hBMSC)成骨分化中的作用.方法:用0、5、10、20 μg/L R-spondin1处理hBMSC,利用荧光素酶实验检测R-spondin1对hBMSC中Wnt信号通路的作用,Western blot检测R-spondin1对Wnt信号通路下游靶基因β-catenin蛋白表达的影响;在成骨分化培养基中添加20 μg/L R-spondin1诱导hBMSC成骨分化,检测R-spondin1对早期成骨分化指标ALP活性及成骨分化晚期钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响.结果:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路,R-spondin1增强ALP活性和钙沉积,促进OSX、OCN及RUNX2的表达.结论:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路的作用,促进hBMSC成骨分化.     

重组人 BMP-2 诱导 C3H10T1/2 间质干细胞定向成骨分化早期基因表达谱分析简

目的 研究间质干细胞早期定向成骨分化基因表达谱,为研究基因对早期成骨定向分化调控机制提供实验基础.方法 分别提取重组人骨形成蛋白2（rhBMP-2）诱导组和对照组C3H10T1/2细胞总RNA,进行扩增标记后,与ArraySTAR小鼠基因芯片杂交,应用生物信息学软件GeneSpring和GATHER对基因芯片数据进行分析.应用STRING在线软件对差异表达基因构建蛋白互作网络并进行网络分析.结果 C3H10T1/2早期成骨分化中,主要富集发育、器官形成等分子功能本体以及细胞因子-细胞因子受体作用信号通路.成骨分化1d和4d均上调表达基因42个,下调表达基因45个.网络分析研究表明：Egfr、Cxcl 12等信号分子参与调控rhBMP-2诱导成骨分化.结论 筛选的差异表达基因和信号分子对早期成骨分化调控具有重要作用,为进一步全面解析早期成骨定向分化提供实验基础.     

CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用

目的 观察Wnt/β-catenin信号通路激活剂CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞(mESCs)向心肌细胞分化中的作用.方法 采用悬浮一步培养法形成拟胚体(EBs),在EBs形成后第2天至第5天分别加入CHIR99021、Wnt3a,命名为CHIR99021组及Wnt3a组,将自动分化的EBs作为对照组.用免疫荧光法检测心肌特异性蛋白肌球蛋白重链(α-MHC)、肌钙蛋白T(cTNT)及膜联蛋白43(CX43)的表达.用qRT-PCR检测中胚层标志基因Brachyury、心肌前体细胞标志基因Nkx2.5、心肌细胞特异性标志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达.用Western blot法检测 α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达.结果 免疫荧光法提示各组mESCs能够向心肌细胞分化.在CHIR99021和Wnt3a诱导分化过程中,Brachyury在分化第7天达高峰;Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的mRNA表达量随着分化时间的延长而逐渐增加,第15天增加最为明显,且CHIR99021组和Wnt3a组高于对照组;CHIR99021组优于Wnt3a组(P<0.05,P<0.01).Western blot检测结果显示CHIR99021组和Wnt3a组α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达量明显高于对照组,CHIR99021组高于Wnt3a组.结论 CHIR99021和Wnt3a在分化早期阶段通过活化Wnt/β-catenin信号通路可促进mESCs心肌细胞分化,且CHIR99021促心肌分化作用优于Wnt3a.     

YAP/TAZ 调控多信号通路参与肝纤维化的发生与发展

肝纤维化是肝应对损伤的一种修复反应。肝星状细胞活化是肝纤维化的中心环节,这一过程涉及Hippo, Notch,Wnt/β-catenin,TGF-β/Smad等多条信号通路。YAP/TAZ是Hippo肿瘤抑制途径的一个重要细胞核影响因子,其 活性是整个器官生长、细胞增殖以及细胞在组织更新与再生过程中特异性扩增的关键。YAP/TAZ蛋白作为枢纽可能 通过调控Hippo,Notch,Wnt/β-catenin,TGF-β/Smad通路影响肝纤维化的发生与发展。     

Menin expression is regulated by transforming growth factor beta signaling in leukemia cells

Background  Menin is a ubiquitously expressed protein encoded by the multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) gene. Besides its importance in endocrine organs, menin has been shown to interact with the mixed lineage leukemia (MLL) protein, a histone H3 lysine 4 methyltransferase, and plays a critical role in hematopoiesis and leukemogenesis. Previous studies have shown that menin promotes transforming growth factor beta (TGF-β) signaling in endocrine cells. However, little is known regarding the impact of TGF-β pathway on menin in hematopoietic system. Here, with leukemia cell lines generated from conditional MEN1 or TGF-β receptor (TβRII) knockout mouse models, we investigated the possible cross-talk of these two pathways in leukemia cells.

Methods  MEN1 or TβRII conditional knockout mice were bred and the bone marrow cells were transduced with retroviruses expressing oncogeneic MLL-AF9 (a mixed lineage leukemia fusion protein) to generate two leukemia cell lines. Cell proliferation assays were performed to investigate the effect of TGF-β treatment on MLL-AF9 transformed leukemia cells with/without MEN1 or TβRII excision. Menin protein was detected with Western blotting and mRNA levels of cell proliferation-related genes Cyclin A₂ and Cyclin E₂ were examined with real-time RT-PCR for each treated sample. In vivo effect of TGF-β signal on menin expression was also investigated in mouse liver tissue after TβRII excision. 

Results  TGF-β not only inhibited the proliferation of wild type MLL-AF9 transformed mouse bone marrow cells, but also up-regulated menin expression in these cells. Moreover, TGF-β failed to further inhibit the proliferation of Men1-null cells as compared to Men1-expressing control cells. Furthermore, excision of TβRII, a vital component in TGF-β signaling pathway, down-regulated menin expression in MLL-AF9 transformed mouse bone marrow cells. In vivo data also confirmed that menin expression was decreased in liver samples of conditional TβRII knockout mice after TβRII excision.

Conclusion  These results provided the first piece of evidence of cross-talk between menin and TGF-β signaling pathways in regulating proliferation of leukemia cells, suggesting that manipulating the cross-talk of the two pathways may lead to a novel therapy for leukemia.   

     

活血潜阳颗粒对自发性高血压大鼠大脑组织基因表达谱的影响

目的采用基因芯片技术研究活血潜阳颗粒对自发性高血压大鼠（SHR）脑组织基因表达谱的影响,探讨该药保护高血压靶器官的分子机制。方法12只20周龄雄性SHR随机分为干预组（活血潜阳颗粒组）和对照组;从脑组织中抽提mRNA,经逆转录分别用Cy3、Cy5荧光标记,获得2组动物来源的cDNA探针;cDNA探针与基因表达谱芯片杂交,结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果SHR给予活血潜阳颗粒药物干预8周后,收缩压明显下降。全基因表达谱差异表达基因共有1290个,下调的基因有611个,361个能在Genbank上登陆;上调的基因679个,360个基因能在Genbank上登陆。其中活血潜阳颗粒组SHR脑组织中Wif-1、Ppp2ca、EPO、Crk、Daxx、PPARδ等存在显著基因差异表达。这些表达差异基因涉及Wnt、JAK-STAT、MAPK、PPAR等多个信号传导通路。结论活血潜阳颗粒可能通过Wnt、JAK-STAT、MAPK、PPAR等信号传导通路相关基因的干预从而对高血压慢性脑损害起一定防治作用。     

转录因子Bach1在小鼠胚胎发育时期的生物信息学分析

目的 研究转录因子Bach1在小鼠胚胎发育时期的表达情况并对其表达和调控机制进行生物信息学分析。方法 获取小鼠胚胎发育不同时期的转录组数据[来自Gene Expression Omnibus（GEO）数据库GSE92634],使用权重基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）方法进行分析。利用来自10个小鼠胚胎样品的8 933个基因构建17个共表达模块,并对含有Bach1特定模块的共表达基因进行Gene Ontology（GO）功能富集分析。结果 转录因子Bach1被鉴定为重要的时空监管中枢基因,其与Bach1在小鼠胚胎中共表达的基因与胚胎发育、血管发育密切相关,包括Vegfb、Tcf15、Znf622和Fam105b等,提示Bach1可能在小鼠胚胎发育和血管发育中起重要作用。小鼠胚胎发育过程中Bach1与Vegfb基因从胚胎E5.5到E7.5天表达趋势基本一致,用小鼠胚胎发育的另一个转录组数据库（GSE120963）分析发现Bach1与Vegfb基因表达趋势类似。Bach1在人胚胎干细胞Tcf15、Znf622和Fam105b基因启动子或增强子区具有较高的富集,可能直接调控这些基因的转录。分析与Bach1共表达基因的GO富集发现,Bach1与Wnt信号通路、蛋白修饰和翻译、染色质重塑、DNA损伤反应、细胞周期调节、泛素化修饰等密切相关。结论 通过生物信息学分析发现,Bach1在小鼠胚胎发育中可能起重要作用,并与血管发育密切相关。     

WNT信号转导在肝细胞癌发病中的作用

Wnt蛋白及其受体、调节蛋白等一起组成了复杂的信号通路，它与胚胎正常发育、细胞的增殖与分化以及肿瘤形成密切相关。Wnt信号通路与肝细胞癌的关系，近年来受到广泛关注，得到了深入的研究。作者就Wnt信号通路及其调节蛋白之间相互作用，Wnt信号通路与肝细胞癌发生发展、血管形成、侵袭和转移等方面的关系作一综述。     

利用表达谱芯片数据筛选不同表达丰度的内参基因

目的 基于表达谱芯片的检测结果,筛选多个内参基因,用于小家鼠肝脏组织中具有不同表达丰度基因的定量检测。方法 应用表达谱芯片技术,完成小鼠肝脏组织的表达谱检测;依据基因表达丰度将基因分为3组,并进一步通过变异系数（coefficient of variation,CV）组内筛选候选内参基因;采用实时荧光定量PCR技术（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）和geNorm软件确定内参基因。结果 表达谱芯片成功采集超过60000个小鼠肝脏组织中转录本的表达量数据,并将之分为低、中、高3个组合。最终筛选了低表达Casp2和Lrrc14、中表达Nrd1和Trpc4ap、高表达Atp5a1和Clu,共6个内参基因。结论 基于表达谱芯片数据筛选的6个内参基因,可适用于qPCR技术准确定量小家鼠肝组织转录组中不同表达丰度基因的表达量。     

抑制LIF/Stat3信号通路促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 研究LIF/Stat3信号通路对小鼠胚胎干细胞(mESCs)分化成心肌细胞的影响.方法 利用mESCs形成拟胚体(EBs)进行心肌分化.在野生型mESCs形成EBs的过程中加入Janus激酶(JAK)抑制剂以抑制LIF/Stat3信号通路(JAKi组).而在融合表达雌激素受体(ER)和Stat3的Stat3ER细胞株进行分化过程中添加4-羟基他莫西酚(4HT)以激活LIF/Stat3信号通路 (4HT组).用qRT-PCR检测心脏特异转录因子NKX25、α-肌球蛋白重链(α-MHC)和连接蛋白43(Cx43)以及mESCs自我更新基因oct4、nanog和Stat3下游基因socs3的表达水平.用Western blot检测和免疫荧光染色法验证α-MHC和Cx43的相对表达.结果 免疫荧光结果显示在自发搏动的EBs中出现α-MHC和Cx43的荧光,表明心肌细胞分化成功.随着分化时间的延长,NKX2.5、α-MHC和Cx43的mRNA表达量逐渐增加,至第15天时最为明显,且JAKi组高于对照组(P<0.01);对照组高于4HT组(P<0.01).而nanog、oct4随着分化时间的延长逐渐降低,且JAKi组低于对照组(P<0.05),而4HT组高于其对照组(P<0.05).Socs3的表达量在JAKi组一直较低且低于对照组,在4HT组表达较高且高于对照组(P<0.01).Western blot检测结果显示第15天的Cx43和α-MHC蛋白表达量JAKi组明显高于对照组(P<0.05),4HT组低于其对照组(P<0.05).结论 抑制LIF/Stat3信号通路促进小鼠胚胎干细胞分化成心肌细胞;激活LIF/Stat3信号通路抑制小鼠胚胎干细胞的心肌细胞分化.