肝豆状核变性的遗传学研究进展

肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)是一种铜转运障碍的常染色体隐性遗传病,以胆汁铜排泄及血浆铜蓝蛋白合成障碍而导致肝和肝外组织铜的过度蓄积为特征,进而出现肝硬化、豆状核变性和角膜的K-F环等一系列异常临床表现.WD是由ATP7B基因突变引起的,基因变异超过515种(至少379种可能为致病突变),广泛分布不同人种和地域,包括错义突变、无义突变、缺失突变、插入突变、置换突变和剪接突变等.其中最常见的突变类型欧洲患者为14号外显子His1069Gln错义突变,亚洲患者为位于8号外显子的Arg778Leu错义突变.基因突变分析有利于准确诊断及早期治疗,遗传缺陷的动物模型有助于开展实验性治疗和研究疾病的病理遗传机制.本文就肝豆状核变性的遗传学进展作一综述.     

WD患者ATP7B基因exon8 DNA突变检测方法的研究

目的对肝豆状核变性(又称Wilson病,WD)ATP7B基因的突变热点外显子8进行PCR扩增产物Msp I酶切和电泳分析及DNA直接双向测序,进而对实验中的方法进行优化研究。方法对102例患者和20例健康人提取基因组DNA,PCR扩增ATP7B基因第8号外显子,扩增产物进行Msp I酶切反应,并进行DNA直接双向测序;讨论分析改进PCR扩增、Msp I酶切的方法学,并对测序结果与临床表型做相关性研究。结果102例WD患者,用反复多次改进的实验方法研究分析后,发现35例存在Msp I酶切结果异常并经测序证实,8号外显子Arg778Leu纯合突变占所有WD病人的34.31%,其中1例伴Leu770Leu多态性同义突变;对照组未检出突变。结论改进实验方法后发现PCR扩增良好,适宜测序;WD突变热点8号外显子中Arg778Leu为主要突变形式,PCR-Msp I酶切反应可作为WD病人ATP7B8号外显子Arg778Leu突变的筛选方法,直接双向测序是确定8号外显子突变位点的可靠方法之一。     

肝豆状核变性基因表达产物及基因突变的研究

目的 探讨肝豆状核变性（Wilson's disease,WD)的发病机理。方法 将活检获得的WD患者肝标本体外分离,培养肝细胞,应用Western印迹法对WD患者肝细胞WD蛋白进行检测,同时扩增其基因组DNA并直接测序。结果 3例WD患者中有2例出现肝细胞WD蛋白特异条带密度降低。DNA测序发现其中一例患者存在ATP7B778位点CGG→CTG（Arg778Leu)杂合突变及770位点CTC→CTG改变。结论 WD基因在WD患者肝细胞的蛋白表达存在异常。可能与ATP7B基因突变有关。     

重组平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体的构建及表达

目的 构建重组全长平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)ATP结合位点突变体,以研究平滑肌MLCK的结构与功能.方法 利用试剂盒对MLCK ATP结合位点进行定点突变,构建全长平滑肌MLCK ATP结合位点突变体重组表达载体pCold/BsMLCK/△ATP,在大肠杆菌中表达:利用SDS-PAGE鉴定表达的重组全长平滑肌MLCK ATP结合位点突变体在细胞中的分布:运用亲和层析及凝胶过滤分离纯化重组全长MLCK并利用SDS-PAGE鉴定表达MLCK的纯度.结果 重组全长MLCK/△ATP(突变型)在大肠杆菌中以可溶的形式大量表达;在样品的上清和沉淀中均有重组全长MLCK/△ATP表达;经CaM-Sepharose 4B和Superose 6 HR纯化,SDS-PAGE鉴定得到单一的表达条带.结论 重组全长MLCK/△ATP(突变型)可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达;SDS-PAGE结果显示重组全长MLCK/△ATP可以通过亲和层析和凝胶过滤纯化得到单一的条带.     

共刺激分子配体B7-DC基因真核表达载体和转基因细胞的构建

目的：克隆小鼠B7-DC基因，并构建含该基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-V5His，证明该基因在CHO细胞中的表达方式，为建立B7-DC的转基因小鼠打下基础。方法：从小鼠胸腺中抽提总RNA为模板，通过RT—PCR技术，扩增出B7-DC编码区片段。按常规方法克隆进pEF6V5His载体中，重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞，48小时后进行间接免疫荧光实验，72小时后用blasticidin进行筛选，挑选出能稳定表达B7-DC的细胞株。结果：已成功克隆小鼠B7-DC基因并构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体，经间接免疫荧光实验（IFA）证明，该基因在CHO细胞中得到表达。经Western blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-DC基因。结论：构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-VSHis，并能在CHO细胞中稳定表达目的基因，为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

人酪氨酸激酶6原核表达载体的构建、表达、纯化与鉴定

目的构建人络氨酸激酶6(PTK6)与His融合蛋白重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。方法通过PCR在编码PTK6的cDNA序列两端添加EcoR I和BamH I酶切位点,双酶切后将编码PTK6的cDNA序列亚克隆至原核表达载体PHUE构建重组蛋白表达载体PHUE/PTK。重组载体经鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞。IPTG诱导重组蛋白表达。收集菌体裂解后,用尿素洗涤和溶解包涵体。溶解上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化产物。结果成功构建人PTK6重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为55 000,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度大于80%的目的重组蛋白。结论人PTK6 His融合蛋白的纯化为多克隆及单克隆抗体的制备以及结构和功能的研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒S基因129Leu和145Arg变异株的抗原表达与DNA免疫研究

目的 研究我国发现的乙肝病毒S基因突变株(129Leu和145Arg)表达HBsAg及DNA免疫的特性. 方法 用自乙肝疫苗免疫无保护婴儿血清中克隆的2株变异S基因(其中"a"决定簇突变,分别为nt540A→T,aa129Gln→Leu和nt587G→A,aa145Gly→Arg)片段,置换已知核苷酸序列并可表达及复制的HBV1.2个拷贝全基因野毒株重组质粒p3.8Ⅱ的S基因.将重组质粒转染HepG2细胞,用Abbott试剂和24种单抗检测转染细胞培养上清中HBsAg的结合力.用重组质粒DNA肌肉免疫小鼠. 结果 129Leu变异株转染细胞上清对HBsAg酶联免疫反应检测的吸光度(A)值高于p3.8Ⅱ野毒株,而145Arg变异株的A值低于p3.8Ⅱ;用24种单抗测定的总趋势为129Leu表达的HBsAg 的S/C值高于p3.8Ⅱ,而145Arg的结果则低于p3.8Ⅱ.三者表达的HBeAg水平相似.用DNA免疫经129Leu诱生的抗-HBs水平低于野毒株p3.8Ⅱ,但略高于145Arg. 结论 129Leu变异株表达的HBsAg与HBs多抗及单抗的结合力较野毒株明显增高,但129Leu 变异株DNA免疫诱生的抗-HBs水平却低于野毒株p3.8Ⅱ.免疫原性低下可能有利于129Leu致持续性感染.     

江苏徐州地区肝豆状核变性患者ATP7B基因8、13号外显子突变的检测和分析

目的研究徐州地区肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration,HLD)患者ATP7B基因8、13外显子突变情况,为本病的早期和产前诊断提供理论依据。方法采集33例HLD患者和30例对照组正常人外周血、提取DNA、PCR扩增ATP7B基因8和13外显子;对扩增产物分别进行限制性内切酶MspI及BtgI酶切分析,反应异常者行DNA测序,最后将突变结果与临床表型作相关性分析。结果 33例HLD患者中,15例存在MspI酶切异常,测序为Arg778Leu杂合或纯合突变,占45.45%(15/33);9例存在BtgI酶切异常,测序为Pro992Leu杂合突变,占27.27%(9/33)。30例正常对照组未检测出突变。结论 ATP7B基因第8、13外显子是徐州地区HLD患者的基因突变热区,筛选本地区HLD可疑患者时应优先检测。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

五羟色胺-N-乙酰转移酶基因真核表达载体的构建、表达及活性检测

目的构建pTARGET^TM—AANAT真核表达载体并转化L6成肌细胞，检测目的基因的表达并初步探讨AANAT转基因细胞的生物活性。方法提取大鼠松果体组织mRNA，RT-PCR技术扩增五羟色胺-N-乙酰转移酶基因（AANAT）cDNA，酶切连接pTARGET^TM载体，脂质体法导入L6成肌细胞。倒置显微镜观察转化细胞体外存活、RT-PCR及Western blotting技术检测pTARGET^TM-AANAT的基因表达产物及转化细胞的功能表达。结果酶切分析、DNA测序及凝胶电泳检测结果证实，pTARGET^TM-AANAT真核表达载体构建成功。RT-PCR及Western blotting检测表明，转化后的L6细胞表达AANAT mRNA，细胞具备AANAT蛋白的表达能力。结论成功构建pTARGET^TM-AANAT的真核表达载体，转化的L6细胞株能表达AANAT蛋白活性。     

BCL-3基因沉默对BCL-3高表达的人大肠癌RKO细胞增殖和药物敏感性的影响

 目的：构建针对人BCL-3基因的RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,观察其对大肠癌细胞株中BCL-3基因的沉默效应,以及基因沉默对细胞生物学行为及药物敏感性的影响。方法：运用RT-PCR及Western blotting方法检测5株大肠癌细胞株中BCL-3的表达状况;构建人BCL-3基因的RNAi慢病毒载体,并转染BCL-3高表达的大肠癌细胞株,运用Western  blotting方法鉴定其对BCL-3基因的沉默效果;BCL-3基因沉默后运用细胞增殖实验及软琼脂克隆形成实验检测其对细胞增殖能力的影响,运用MTT方法检测大肠癌细胞株对化疗药物敏感性的变化。结果：BCL-3高表达于大肠癌细胞株RKO中;成功构建了BCL-3　RNAi慢病毒载体,Western blotting实验显示其可抑制RKO细胞中BCL-3蛋白的表达;抑制BCL-3的表达后,增殖实验表明RKO细胞增殖能力下降,软琼脂克隆形成实验表明RKO细胞的克隆形成率下降;MTT实验表明BCL-3表达抑制后奥沙利铂对RKO细胞的半数抑制浓度（median inhibitory concentration, IC50）显著降低。结论: BCL-3表达抑制后,BCL-3高表达的大肠癌细胞株RKO的增殖能力下降,并且其对奥沙利铂的敏感性增强。     

人上皮细胞黏附分子融合蛋白真核表达载体的构建、表达及初步鉴定

目的 :构建pIg EpCAM及pEGFP EpCAM真核表达载体 ,并在COS7细胞中表达。方法 :用PCR扩增EpCAMcDNA ,酶切后分别与pIg及pEGFP两种载体连接 ,用脂质体法转染COS7细胞。用免疫沉淀法检测pIg EpCAM的表达产物 ;用荧光显微镜观察EpCAM GFP的表达。结果 :DNA序列测定的结果显示 ,pIg EpCAM及pEGFP EpCAM载体的构建正确。免疫沉淀的结果显示 ,转染pIg EpCAM的COS7细胞的培养上清中含有相对分子质量 (Mr)为 6 5 0 0 0的融合蛋白 ,该蛋白与抗人IgGFc段的mAb具有良好的免疫反应性。荧光显微镜观察可见 ,转染空载体pEGFP的COS7细胞中绿色荧光均匀地分布于胞质和胞核 ;而转染pEGFP EpCAM的COS7细胞中绿色荧光主要分布于细胞表面。结论 :成功地构建了两种EpCAM的真核表达载体 ,并在COS7细胞中表达 ,为EpCAM的功能研究创造了条件 ,并为制备抗EpCAM的mAb提供了免疫原     

信号肽-canstatin真核表达载体的构建及其在Eca-109细胞中的分泌表达

目的：构建信号肽-canstatin 真核表达载体并在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。 方法： 利用点突变技术将小鼠纤溶酶原信号肽(SP)序列插入到载体pEGFP-C1 EGFP编码序列起始密码的后面,构建pEGFP-C1-SP载体。以pMD18T-Can为模板, 扩增小鼠canstatin基因，构建信号肽-canstatin分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can。用脂质体转染法瞬时转染人食管癌细胞Eca-109。利用Western blotting检测小鼠canstatin 融合蛋白在Eca-109细胞中的分泌表达。 结果：DNA测序证明所构建的带信号肽的中间载体pEGFP-C1-SP正确;酶切和DNA测序表明信号肽-canstatin 分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can构建正确, EGFP-canstatin融合蛋白在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。 结论： 获得了能分泌canstatin融合蛋白的真核表达载体，并分泌到人食管癌细胞Eca-109的细胞外, 为小鼠canstatin的功能研究及应用于基因治疗提供了实验基础。     

非病毒载体介导Mn-SOD基因在小鼠肝脏的高表达

目的:研究非病毒载体介导Mn-SOD基因在小鼠肝脏的转染效率。方法:构建Mn-SOD真核表达质粒gWiz/Mn-SOD,通过肠系膜上静脉分支注射阳离子脂质体/质粒混合物,采用RT-PCR、Westernblot、SOD活力测定以及免疫组织化学染色等方法,观察小鼠肝脏Mn-SOD基因表达情况。结果:经肠系膜上静脉分支注射质粒/脂质体混合物几乎不对肝脏造成损伤,注射后8h即可检测到小鼠肝脏有明显的外源性Mn-SODmRNA和蛋白表达;转染前及转染后72h肝细胞线粒体SOD活性分别是(29±17)U/g和(272±56)U/g(P<0.01);免疫组化显示小鼠肝细胞转染率达70%。结论:阳离子脂质体可介导非病毒载体gWiz/Mn-SOD在小鼠肝脏高效安全表达。     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）F基因，构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F，并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物，通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因，然后克隆到pGEM-3zf载体中，序列测定正确后，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），行酶切鉴定，脂质体法转染COS-7细胞，应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列，序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后，利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因，并在真核细胞中获得表达。     

Clusterin抗原的表达、抗体制备及其初步鉴定

目的:制备Clusterin(CLU)多克隆和单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定.方法:以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CLU和PET-32a-CLU.GST-CLU融合蛋白在大肠杆菌中表达,被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb.采用ELISA法和Western blot鉴定抗CLU抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性.采用Western blot,间接免疫荧光,免疫组化鉴定mAb的特异性.结果:GST-CLU融合蛋白在相对分子质量(Mr)约54 000处呈现明显表达条带.Western blot鉴定表明,制备的抗CLU兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中Mr约52 000和58 000的CLU蛋白.获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU蛋白,其中有2株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白,4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白.结论:成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb,为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础.     

糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1融合蛋白在CHO/DHFR-细胞的稳定表达

目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B71(GPIB71)的CHO/DHFR-细胞表达体系。方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3GPIB71和pSV40DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westenblot检测。结果经G418筛选和MTX加压扩增,获得高效表达目的蛋白的细胞株。膜蛋白经WesternBlot检测具有生物活性。结论GPIB71在CHO/DHFR-细胞中高效表达,为临床应用与研究奠定了基础。     

人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

重组人血红蛋白δ链的制备与鉴定

目的克隆人血红蛋白δ（delta）链蛋白基因，并在大肠杆菌中进行表达，经纯化与鉴定，获得δ链蛋白，为建立β-地中海贫血的免疫学筛查方法提供特异性抗原。方法从K562细胞中提取总RNA，采用RT-PCR技术获得目的片段并将其克隆到pET-32a及pET43．1a载体中，经PCR、酶切及测序验证，以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以Ni^2＋亲和层析柱纯化，可溶性蛋白直接以Ni^2＋亲和层析柱纯化。采用Western Blot和ELISA分析鉴定表达产物。结果成功构建两种融合表达载体pET32-Hbδ及pET43．1-Hbδ，分别为包涵体表达和可溶性表达，纯化产物经Western blotting和ELISA鉴定均为δ链蛋白。结论克隆表达并获得了纯化的人血红蛋白δ链，为后续的抗体制备及地中海贫血的免疫筛选方法的建立提供了抗原。     

抗人黑色素瘤嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的：构建嵌合型抗人黑色素瘤抗体的真核表达载体，并实现真核表达。方法：从3株杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因，插入含有抗人Tac抗原信号肽以及人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中，转染293T细胞，进行嵌合抗体表达，并用RT-PCR、ELISA、Westem blot免疫印迹等对抗体表达鉴定。结果：成功构建了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体，并实现其真核表达。RT-PCR证实了该抗体在mRNA水平上的表达，ELISA和Westemblot证实了抗人黑色素瘤人，鼠嵌合抗体的表达。结论：成功表达了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体。