NF-κB抑制剂对脂多糖刺激的退变人椎间盘髓核细胞炎症因子表达的影响

目的 观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激退变人椎间盘髓核细胞前后,核因子kappB(NF-κB)与炎症因子表达及相互关系.方法 体外培养退变的人椎间盘髓核细胞,设立对照组、LPS (500 μg/mL)刺激组、NF-κB抑制剂(BAY11-7082)+LPS(500 μg/mL)刺激组.ELISA方法检测各组细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β的含量,免疫荧光法检测各组髓核细胞内p65的表达及定位,Western blot检测TNF-α、IL-1β、NF-κB结合蛋白p65以及磷酸化p-p65的表达,Real-time PCR检测TNF-α及IL-1β的表达.结果 LPS刺激髓核细胞后,p65入核增多,p-p65表达明显增加,ELISA实验结果表明LPS刺激组细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平升高(P＜0.05),Western blot及Real-time PCR检测结果也表明其髓核细胞内炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显上升(P＜0.05);而与LPS刺激组相比,NF-κB抑制剂+LPS刺激组p65入核减少,p-p65表达明显降低,细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平降低(P＜0.05),Western blot及Real-time PCR检测结果也表明其髓核细胞内炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显下降(P＜0.05).结论 LPS能够通过激活人退变髓核细胞NF-κB信号通路,促进炎性因子TNF-α及IL-1β表达增多,抑制NF-κB信号通路后可明显减轻炎性因子的表达.     

三七皂苷FC通过MAPK/NF-κB途径抑制RAW264.7细胞炎症及凋亡的机制研究

目的:基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)途径探讨三七皂苷FC对RAW264.7巨噬细胞炎症及凋亡的作用机制。方法:(1)采用不同浓度的三七皂苷FC(0、1、10、20、50、100μmol/L)分别干预RAW264.7细胞和脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞,CCK8法检测细胞活力,筛选合适的药物浓度。(2)将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组、LPS+三七皂苷FC低剂量(20μmol/L)组和LPS+三七皂苷FC高剂量(50μmol/L)组。先给予相应剂量的三七皂苷FC预处理6 h,再加入1μg/ml LPS。干预24 h后,PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)mRNA表达;Western blot检测TNF-α、iNOS、p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光检测NF-κB核转位;Transwell实验检测细胞迁移。结果:(1)20、50μmol/L三七皂苷FC干预24 h后,LPS诱导的RAW264.7细胞活力较对照组无显著差异(P0.05),用于后续实验。(2)与LPS组相比,低、高剂量的三七皂苷FC作用后,TNF-α、IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01);TNF-α、iNOS蛋白表达明显降低(P0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达比值显著下调(P0.05,P0.01);细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01);细胞核内NF-κB p65蛋白表达减少,阳性表达细胞数占比显著降低(P0.05);细胞迁移数显著减少(P0.01)。结论:三七皂苷FC能够显著改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应,减少炎症因子的释放,抑制巨噬细胞凋亡和迁移,其作用机制可能与下调MAPK/NF-κB通路磷酸化水平及抑制NF-κB核转位有关。     

苦参素预处理对肾缺血再灌注损伤的保护作用及对核转录因子-κB表达影响

目的:探讨苦参素(OMT)预处理对肾缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用及核转录因子-κB表达的影响。方法:将SD大鼠随机分为假手术组(S组)、I/R组、OMT高、低剂量组(H、L组),每组10只。H、L组在I/R造模前进行OMT给药干预,S、I/R组给予等体积0.9%氯化钠注射液处理。检测并比较各组动物肾损伤指标、炎性因子水平、氧化应激指标水平差异以及肾脏组织中核转录因子-κB(NF-κB p65)蛋白表达水平变化。结果:与S组比较,I/R组肾组织损伤明显,肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及丙二醛(MDA)水平均明显升高,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性明显降低,NF-κB p65蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与I/R组比较,OMT预处理组肾小管损伤明显减轻,Cr、BUN、IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA水平均明显降低,SOD和GSH-Px活性明显升高,NF-κB p65蛋白表达水平明显降低,且H组效果更明显(P<0.05)。结论:苦参素预处理对肾脏有保护作用,其机制可能与增强肾脏抗氧化能力,减轻炎症反应,抑制NF-κB p65表达有关。     

冬凌草甲素对LPS诱导Raw264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用

目的 研究冬凌草甲素对脂多糖(LPS)诱导的Raw264.7巨噬细胞炎症反应的影响.方法 选用小鼠巨噬细胞Raw264.7,CCK-8法确定冬凌草甲素作用的最适浓度;设立正常对照组、模型对照组(LPS组)、实验组(冬凌草甲素预处理+LPS组)和阳性药组(地塞米松预处理+LPS组),实时定量PCR法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和TLR4 mRNA表达水平的改变;Western blot法检测NF-κB p65、磷酸化p65(p-p65)蛋白表达水平的改变.结果 冬凌草甲素作用于Raw264.7细胞的最佳浓度为10 μmol/L;与LPS组比较,冬凌草甲素预处理实验组Raw264.7细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平明显下降,IL-10 mRNA表达水平明显升高,TLR4基因表达降低,NF-κB活化入核减少.结论 冬凌草甲素能下调LPS诱导的Raw264.7细胞促炎因子表达,其抗炎免疫作用机制与抑制TLR4-NF-κB信号通路的活化有关.     

黄芩苷对脂多糖诱导人牙龈成纤维细胞表达炎症因子的影响

  目的  从PI3K/Akt/NF-κB信号通路探讨黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞(HGFs)损伤的影响及机制。  方法  运用LPS诱导建立人牙龈成纤维细胞损伤模型,设置正常对照组、模型组和模型+黄芩苷(1、10和20μg/mL)组,每组设3个复孔,经不同浓度的黄芩苷干预后,Western blotting检测p-Akt、Akt、NF-κB p65等蛋白的表达,采用qPCR法检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6等基因的表达。用PI3K抑制剂LY294002作用半小时后,再用黄芩苷干预,qPCR和Western blotting法检测Akt、p-Akt、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-6等基因和蛋白的表达。  结果  与模型组比较,黄芩苷低、中、高剂量能有效降低TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达水平,促进p-Akt蛋白表达,抑制NF-κB p65核蛋白表达,并呈剂量依赖性(均P < 0.05)。与模型组比较,模型+黄芩苷组p-Akt表达升高(P＜0.05),NF-κB p65表达降低(P＜0.01)。PI3K抑制剂LY294002作用后,模型+黄芩苷组p-Akt/Akt表达量(0.63±0.18)较模型组(0.56±0.14)升高(P＜0.05),模型+黄芩苷组NF-κB p65、IL-6、IL-1β、TNF-α表达量较模型组降低(均P＜0.01)。黄芩苷对LY294002作用后,p-Akt/Akt、NF-κB p65、IL-6、IL-1β、TNF-α表达量与模型组比较,差异无统计学意义。  结论  黄芩苷可抑制LPS诱导的人牙龈成纤维细胞损伤引起的炎症反应,其作用机制可能与促进Akt的磷酸化,抑制NF-κB p65核转录和炎性因子的释放有关。      

沉默lncRNA NEAT1通过抑制NF-κB通路减轻LPS 诱导的支气管上皮细胞炎症反应

目的探究沉默长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1对脂多糖(LPS)诱导的人支气管上皮(HBE)细胞(16HBE)炎症反应的影响及机制。 方法16HBE细胞分为Control组、LPS组、LPS+si-NC组和LPS+si-NEAT1组。实时荧光定量PCR检测各组lncRNA NEAT1、白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达水平;MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blotting检测各组炎症因子水平及增殖细胞核抗原(PCNA)、p53、核因子κB抑制蛋白(IκB)α、核因子-κB(NF-κB)p65蛋白表达水平。 结果沉默lncRNA NEAT1后,IL-1β、IL-6、TNF-α及其mRNA表达水平、细胞凋亡率及p53、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白水平均明显降低,细胞增殖活力及PCNA蛋白水平均明显升高(P＜0.05),细胞中p-NF-κB p65相对荧光强度(细胞核/细胞质)降低(P＜0.05)。 结论沉默lncRNA NEAT1表达抑制16HBE细胞炎症反应,其机制可能与抑制NF-κB通路的激活有关。     

ω-3多不饱和脂肪酸对脂多糖诱导的脑损伤新生大鼠的神经保护作用

目的探讨ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFA)对脂多糖(LPS)诱导的脑损伤新生大鼠的神经保护作用。方法将48只3日龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为对照组、LPS组、ω-3 PUFA组和ω-6 PUFA组,每组12只。LPS组、ω-3 PUFA组和ω-6 PUFA组大鼠腹腔注射0.6 mg·kg~(-1)LPS建立脑损伤模型,然后分别立即腹腔注射等容积的生理盐水、ω-3 PUFA和ω-6 PUFA;对照组大鼠腹腔注射等容积的生理盐水。24 h后处死各组大鼠,取海马组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测各组大鼠海马组织中Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6的mRNA和蛋白表达。结果 LPS组、ω-3 PUFA组、ω-6 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA和蛋白表达均高于对照组(P<0.05);ω-6 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA和蛋白表达高于LPS组(P<0.05);ω-3 PUFA组新生大鼠海马组织中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA和蛋白表达均低于LPS组和ω-6 PUFA组(P<0.05)。结论ω-3 PUFA能下调大鼠海马组织中TLR4/NF-κB信号通路,减少炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放,对LPS所致的脑损伤新生大鼠有神经保护作用。     

多索茶碱对脂多糖诱导肺泡上皮细胞炎性损伤及NLRP3/IL-1β通路的影响

目的探讨多索茶碱对脂多糖诱导肺泡上皮细胞炎症损伤及NOD样受体蛋白3(NLRP3)/白细胞介素-1β(IL-1β)通路的影响。方法体外培养人肺泡上皮细胞(AEC),将细胞分为对照组(不做处理)、LPS组(10μg/mL LPS处理)、LPS+低剂量多索茶碱组(10μg/mL LPS+5 mg/L多索茶碱处理)、LPS+中剂量多索茶碱组(10μg/mL LPS+10 mg/L多索茶碱处理)、LPS+高剂量多索茶碱组(10μg/mL LPS+30 mg/L多索茶碱处理)。溴脱氧尿苷(BrdU)掺入实验检测细胞增殖比例,流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白印迹(WB)法检测各组细胞的IL-1β、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、NLRP3、凋亡相关斑点蛋白(ASC)、半胱天冬酶-1(caspase-1)蛋白表达,用凝胶电泳迁移率转变分析(EMSA)检测各组细胞核转录因子-κB(NF-κB)活性。结果与对照组比较,LPS组细胞增殖比例均下降,细胞凋亡率、细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达及NF-κB活性均升高,差异均有统计学意义(P0.05);与LPS组比较,LPS+低剂量多索茶碱组、LPS+中剂量多索茶碱组、LPS+高剂量多索茶碱组细胞增殖比例依次升高,细胞凋亡率、细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达及NF-κB活性均依次降低,差异均有统计学意义(P0.05),且呈剂量依赖性。结论多索茶碱可能通过抑制NLRP3/IL-1β通路活化,减轻脂多糖诱导肺泡上皮细胞炎性损伤。     

瑞马唑仑对颅脑损伤大鼠脑组织损伤及TLR4/MyD88/NF-κB通路的影响

目的:探讨瑞马唑仑(Rem)对颅脑损伤(BI)大鼠脑组织损伤及Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)通路的影响。方法:构建BI大鼠模型;将所有大鼠分为对照组(Control组)、颅脑损伤组(BI组)、瑞马唑仑低、中、高剂量组(Rem-L、Rem-M、Rem-H组)、瑞马唑仑高剂量+TLR4激活剂LPS组(Rem-H+LPS组);检测大鼠脑组织含水量;ELISA检测大鼠脑组织中的炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)水平;HE染色观察大鼠脑组织的形态学变化;TUNEL法检测脑组织神经元凋亡情况;Western blot法检测大鼠脑组织TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果:与Control组相比,BI组大鼠脑组织神经元变性坏死,数量减少,体积缩小,损伤严重,神经功能评分、脑组织含水量、神经元凋亡率和TNF-α、IL-1β、IL-6水平及Bax、TLR4、MyD88、NF-κB、p-NF-κB p65表达升高,Bcl-2表达降低...     

灯盏乙素抑制LPS诱导BV2细胞株炎症细胞因子表达的研究

目的研究灯盏乙素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导BV2细胞株炎症细胞因子表达的影响,探讨灯盏乙素抗炎作用机制。方法通过荧光素酶报告基因检测核转录因子NF-κB活性,并利用LPS刺激使BV2细胞和通过RT-PCR和蛋白免疫法检测TNF-α和IL-1β的mRNA及蛋白含量,研究灯盏乙素的抗炎作用。实验分为正常组、LPS刺激(1μg/ml)的模型组、灯盏乙素组(0.1、1、10和100μg/ml)。结果灯盏乙素预处理(1～100μg/ml)可抑制LPS引起pNF-κB 293的核转录因子NF-κB激活(P<0.05或P<0.01);灯盏乙素预处理(1～100μg/ml)能够抑制LPS引起BV2的TNF-α和IL-1βmRNA和蛋白含量升高(P<0.01)。结论灯盏乙素具有抗炎作用,其抗炎作用与抑制核转录因子NF-κB、抑制炎症细胞因子表达有关。     

双氢青蒿素抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应

目的 观察双氢青蒿素(dih ydroartemisinin,DHA)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症反应的影响及其机制.方法 LPS诱导BV-2小胶质细胞活化建立炎症模型,用不同浓度DHA(0.5、1、2、4μmol/L)处理细胞,CCK-8检测细胞活性;选取lμmol/L DHA干预细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化;RT-PCR检测iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达水平;ELISA检测培养基中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平;Western blot检测NF-κB、IκBα及TLR4的蛋白表达.结果 低剂量的DHA(＜2μmol/L)对BV-2细胞活性无明显影响(P＞0.05),DHA可抑制LPS引起的BV-2细胞形态变化,DHA抑制活化的BV-2细胞iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表达(P＜0.01),减少IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子释放(P＜0.01),明显降低TLR4的蛋白表达,减少细胞质内IκBα的表达,并抑制NF-κB向核内移位(P＜0.01).结论 DHA可能通过作用于TLR4/NF-κB通路,抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞NF-κB的激活,从而抑制炎症因子的产生,发挥抗炎作用.     

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对癫痫大鼠海马NF-κB及相关炎症因子表达的影响

目的 探讨癫痫大鼠海马组织核转录因子κB(NF-κB)随给药时间的变化规律及NF-κB信号传导通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对NF-κB、肿瘤坏死因子-α(TNF-a)和白细胞介素1β(IL-1β)的影响.方法 应用Western blotting检测戊四氮(PTZ)致痫大鼠海马核蛋白中NF-κB p65在不同时点( 14d、21d、28d、35d)及PDTC干预癫痫大鼠后的表达;应用实时定量PCR及ELISA检测TNF-α、IL-1βmRNA和蛋白水平在PDTC干预前后的变化.结果 NF-κB p65在癫痫大鼠海马核蛋白中含量于14d开始增高,持续至28d,35d后恢复至14d水平;PDTC干预后,NF-κB 165在干预组不同时间点的含量分别为[(0.54±0.07)、(0.65±0.08)、(0.78±0.10)、(0.78±0.10)],低于模型组[(1.20±0.11)、(1.42±0.14)、(1.88 ±-0.16)、(1.25 ±0.10)],差异具有统计学意义(P＜0.01).癫痫发作后海马组织内TNF-α、IL-1β mRNA分别为[(1.34±0.13,0.81±0.17)、(1.64 ±0.17,1.56 ±0.20)、(2.03±0.16,1.65±0.18)、(1.40±0.10,1.30±0.13)],明显高于对照组(P＜0.01),PDTC干预后显著降低TNF-α、IL-1β mRNA的表达[分别为(0.96±0.1,0.57±0.07)、(1.36±0.15,1.09±0.18)、(1.47±0.14,1.25±0.16)、(1.12±0.12,0.85 ±0.12)],与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01).ELISA检测海马组织内TNF-α、IL-1β蛋白含量与上述结果相似.结论 癫痫发作可诱发海马组织NF-κB的核转位及TNF-α、IL-1β的表达,PDTC能明显抑制癫痫诱发的NF-κB核转位及TNF-α、IL-1β的表达.     

过表达miR-27a对急性脑梗死大鼠海马神经元损伤的影响及其机制

目的 探究过表达miR-27a对急性脑梗死大鼠海马神经元损伤的影响及可能机制。 方法 将60只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、Agomir阴性对照组(Agomir-NC组)和miR-27a agomir组(Agomir组),每组15只。采用改良Longa线栓法构建急性脑梗死大鼠模型,于造模前1天和造模成功时,分别经侧脑室注射15 mg/kg的agomir-NC或miR-27a agomir。术后72 h,采用Zea-Longa评分法对大鼠神经功能缺损进行评分;采用氯化三苯基四氮唑染色法(TTC)测量大鼠脑梗死面积;原位缺口末端标记法(TUNEL)检测大鼠海马组织细胞凋亡水平;qRT-PCR法检测各组大鼠海马组织miR-27a的表达水平;流式细胞术(FCM)检测各组大鼠海马组织中Iba-1⁺/CD68⁺小胶质细胞所占百分比;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组大鼠海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS的表达水平;Western blotting 检测大鼠海马组织中TLR4信号通路相关蛋白TLR4、MyD88、p-NF-κB p65及NF-κB p65表达情况。 结果 与Sham组相比,Model组大鼠海马组织细胞凋亡水平及Iba-1⁺/CD68⁺小胶质细胞水平均显著增加(均P<0.001),海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和iNOS活性及TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),海马组织中miR-27a表达水平显著降低(P<0.001)。与Model组比,Agomir组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、海马组织细胞凋亡水平及Iba-1⁺/CD68⁺小胶质细胞水平均显著降低(均P<0.001),海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和iNOS活性及TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白表达水平均显著下降(P<0.05),海马组织miR-27a表达水平显著上升(P<0.001)。 结论 过表达miR-27a通过抑制小胶质细胞M1型极化减轻急性脑梗死大鼠海马神经元损伤,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路活化有关。     

槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞表达NF-κB的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB p65、TNF-α表达的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW264.7细胞,分为空白对照组、槐定碱预处理对照组、LPS模型组、槐定碱预处理＋LPS组。各组处理完毕后5、30、60、120min,分别获取细胞与细胞培养液。Western Blot和RT-PCR分别检测细胞NF-κB p65蛋白与mRNA表达,放免法检测细胞培养液TNF-α含量。结果单独槐定碱对NF-κB p65以及TNF-α表达无影响;LPS模型组各时间点NF-κB p65 mRNA与蛋白以及TNF-α表达均显著高于空白对照组（P〈0.01）,且随LPS刺激时间延长而持续升高,至120min未见下降;槐定碱预处理＋LPS组NF-κB p65mRNA与蛋白及其下游TNF-α表达均较同时间点LPS模型组降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论槐定碱预处理可通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB p65表达及TNF-α分泌发挥抗炎作用。     

丹红注射液对脂多糖诱导THP-1巨噬细胞促炎因子分泌的影响及机制

目的观察丹红注射液对脂多糖（LPS）诱导的THP-1巨噬细胞促炎因子分泌的影响,并探讨其机制。方法160nmol／L佛波酯孵育THP-1巨噬细胞24h后分为对照组、脂多糖组、丹红组和脂多糖＋丹红组,酶联免疫吸附法检测培养液中促炎因子的含量,Western blot检测核因子κB（NF—κB）、p65和rroll样受体4（TLR4）的蛋白表达水平。结果丹红注射液明显抑制LPS诱导的巨噬细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素1β（IL-1β）释放,下调核因子NF—κB和TLR4的表达。结论丹红注射液抑制脂多糖诱导的炎症反应,可能与其抑制TLR4和NF—κB的表达有关。     

靶向小鼠核因子κB P65的小干扰RNA逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向小鼠核因子κB（NF-κB）P65进行RNA干扰（RNAi）的逆转录病毒载体,鉴定其生物学效应。方法采用分子克隆技术构建靶向小鼠NF-κB P65 siRNA的逆转录病毒载体,转染293E细胞,包装成逆转录病毒,以不同滴度感染小鼠单核巨噬细胞J774A.1,用相同浓度的脂多糖（LPS）刺激,在不同时间点用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平上检测细胞NF-κBP65表达,并用RT-PCR和ELISA方法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达。结果成功构建靶向小鼠NF-κB P65基因的小干扰RNA逆转录病毒表达载体。经LPS刺激后,siRNA病毒组J774A.1细胞中NF-κB P65 mRNA的表达明显受到抑制,2 h即明显低于Scramble病毒组（0.91±0.03比1.02±0.02,P〈0.01）,此后持续降低;在LPS刺激后的24、36、48和72 h,siRNA病毒组NF-κB P65蛋白表达均明显低于Scramble病毒组（0.97±0.02比1.01±0.01,0.94±0.01比1.02±0.01,0.94±0.02比1.02±0.01,0.93±0.01比1.00±0.02,P〈0.05）。LPS刺激后2、6、12和24 h,siRNA病毒组TNF-α的mRNA表达水平均明显低于Scramble病毒组（P〈0.01）,而相同时间点siRNA病毒组细胞上清TNF-α的含量亦明显低于Scramble病毒组（P〈0.01）。结论将小干扰RNA片段连接到空白质粒中构建逆转录病毒表达载体的方法是可行的。采用RNA干扰技术抑制NF-κB的表达后,可以减少其下游炎症因子的释放,提示RNA干扰技术在炎性损伤性疾病如急性肺损伤的防治中具有潜在应用价值。     

常压高浓度氧对脑缺血-再灌注大鼠缺血核心区核转录因子-κB的适度调节作用

目的 探究常压高浓度氧治疗（normobaric hyperoxia,NBO）对脑缺血-再灌注大鼠脑内白细胞介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、核转录因子（nuclear factor-κB,NF-κB）及其抑制蛋白（inhibitor of κB,IκB）表达的影响,探讨NBO治疗对脑缺血后NF-κB介导的炎性反应损伤的作用。方法 将15只健康雄性SD大鼠（280~320 g）依据数字表法随机分为3组：假手术组（Sham,n=3）、正常氧浓度组（Normoxia,n=6）和NBO （n=6）组,应用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型,缺血90 min再灌注24 h。Sham组和Normoxia组大鼠术后呼吸普通空气,NBO组大鼠术后至再灌注前呼吸100%常压氧气。采用免疫荧光染色和Western blotting的检测方法,研究NBO治疗对脑缺血核心区炎性因子IL-1β、TNF-α和转录调节因子NF-κB及其抑制蛋白IκB表达的影响。结果 免疫荧光结果显示：1与Sham组相比,Normoxia组缺血核心区IL-1β、TNF-α及核移位NF-κB p65阳性细胞数目明显增多（P<0.05）,荧光强度增强;2与Normoxia组相比,NBO组缺血核心区IL-1β、TNF-α及核移位NF-κB p65阳性细胞数目明显减少（P<0.05）,荧光强度减弱。Western blotting结果显示：1与Sham组相比,Normoxia组缺血核心区NF-κB p65显著升高,IκB明显降低（P<0.05）,2与Normoxia组相比,NBO组缺血核心区NF-κB p65水平显著降低,IκB明显升高（P<0.05）。结论 NBO治疗可能通过调节缺血核心区转录调控因子NF-κB的适度活化来抑制脑缺血再灌注炎性损伤,从而实现脑神经保护作用。