肽核酸钳制PCR早期检测乙型肝炎病毒YMDD耐药变异

目的建立乙型肝炎病毒肽核酸钳制PCR（PNA-PCR）耐药监测方法,以提前监测乙型肝炎病毒YMDD耐药株的产生。方
法选取rtM204I（ATT）、rtM204V（GTG）突变型质粒与野生型质粒rtM204（ATG）按照不同比例混合后,用PNA-PCR法及直接测
序法对耐药位点进行检测,评价两种方法的灵敏度及特异性;选取临床耐药检测患者血清标本85例,采用PNA-PCR法及直接
测序法进行耐药检测,比较两种方法的耐药检出率。结果PNA-PCR法可在105倍野生型YMDD基因背景下检测出突变,灵敏
度为0.001%,可检测到最低限为101拷贝。而直接测序法可检测的基因突变的最低极限为104拷贝,检测灵敏度为10%。85例
临床耐药检测患者中,PNA-PCR法YMDD检测阳性率为85.9%（73/85∶YIDD∶40,YVDD∶23,YIDD+YVDD∶10）,而PCR产物
直接测序法检阳性率仅为40%（34/85∶YIDD∶21,YVDD∶11,YIDD+YVDD∶2）。阴性对照,两种方法均未测出HBV病毒,两种
方法的特异性均较好。结论PNA-PCR方法在灵敏度及特异性上均优于直接测序法,而且操作简便,快捷,在科研和临床上都有
很好的应用前景。
     

PCR-反向斑点杂交法检测HBV YMDD模序混合感染

目的为HBV感染临床个体化治疗、指导临床用药寻找一种能更好地检测HBV YMDD模序混合感染的方法。方法28份已知乙肝病人血清,其中10份为HBV YMDD模序感染,5份为HBV YIDD模序感染,5份为HBV YVDD模序感染,2份为HBV YMDD和YIDD模序混合感染,2份为HBV YMDD和YVDD模序混合感染,2份为HBV YIDD和YVDD模序混合感染,2份为HBV YMDD、YIDD和YVDD模序混合感染,都用PCR产物直接测序和PCR-流过式反向斑点杂交(Flowthrough-RDB)方法检测。结果HBV YMDD模序单一感染标本用两种方法检测准确性都达到100%,对混合感染标本PCR-流过式反向斑点杂交方法检测准确性也可达100%,然而用PCR产物直接测序方法只能检测其中一种或两种型别。结论PCR-流过式反向斑点杂交方法是一种敏感、特异和快速的检测HBV YMDD野生型及其突变型模序单一感染和混合感染的有效方法,比PCR产物直接测序更优越,更有利于实现临床个体化治疗和指导临床用药。     

HBV P基因YMDD变异的检测及临床应用的初步研究

目的采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测，对其临床意义进行初步的研究。方法应用分子克隆方法，构建YMDD、YVDD和YIDD变异的阳性质粒，并对该方法进行敏感性及特异性试验。对65例未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD和YIDD质粒构建成功，且该方法具有较好的敏感性和特异性。65例未经拉米夫定治疗的乙型肝炎患者存在YMDD变异，出现变异6例，阳性率为9．07％；其中YIDD和YI／YMDD各1例，YVDD3例，YV／YMDD1例。结论本检测方法简便、实用，在未经抗病毒治疗的患者中可存在YMDD变异，其与野生株一样是自然存在的，抗病毒药物压力不是导致HBV YMDD变异的唯一因素。     

拉米夫定耐药者体内乙型肝炎病毒水平与YMDD变异关系的研究

目的 :探讨拉米夫定耐药者 YMDD变异类型、变异率及与体内病毒水平的关系。方法 :荧光定量 PCR检测拉米夫定耐药者血清 HBV-DNA浓度 ,PCR产物直接测序检测 YMDD变异情况。结果 :5 2例拉米夫定耐药者 YMDD变异检测结果 ,其中有 2 4例发生 YMDD变异 ,占 46.1 5 % ,并且 YMDD(酪氨酸、蛋氨酸、天门冬氨酸、天门冬氨酸 )基序发生三种变异 ,第一种类型为 YVDD变异 ,共有 1 1例 (变异率 2 1 .1 5 % ) ,即核苷酸 A741→ G变异 ;第二种类型为 YIDD变异 ,共有 1 1例(变异率 2 1 .1 5 % ) ,即核苷酸 G743→ T变异 ,其中有 1例核苷酸 G743→ C变异也引起 YIDD变异 ;第三种类型为 YLDD变异 ,共有 2例 (变异率 3 .85 % ) ,即核苷酸 A741→ T变异。 YMDD野生型血清病毒浓度为 7.0× 1 0 6± 1 .3× 1 0 6 copies/ ml,YVDD、YIDD、YLDD变异型病毒浓度分别为 7.5×1 0 6 ± 1 .5× 1 0 6 copies/ ml、7.6× 1 0 6 ± 1 .7× 1 0 6 copies/ ml、6.9× 1 0 6 ± 1 .3× 1 0 6 copies/ ml;经 t检验 ,YMDD变异型与 YMDD野生型血清病毒浓度之间的差异无显著性意义 (P>0 .0 5 )。结论 :除已报道的拉米夫定耐药者 YMDD基序发生 YVDD和 YIDD变异外 ,还存在 YLDD变异 ;拉米夫定耐药者体内乙肝病毒水平与发生 YMDD变异及变异类型无     

拉米夫定耐药株感染者基因型、HBV DNA及多聚酶P区基因变异的关系

目的分析拉米夫定耐药株感染者的基因型、HBVDNA及多聚酶P区基因变异的关系。方法应用PCR扩增和直接测序法检测83例拉米夫定耐药患者HBV基因型、HBVDNA及多聚酶P区的基因变异。结果83例拉米夫定耐药患者B基因型26例,C基因型57例,B型YIDD变异率69．2％（18／26）、YVDD变异率30．8％（8／26）,C型YIDD变异率63．2％（36／57）、YVDD变异率33．3％（19／57）,B、c基因型发生YMDD变异模式无统计学差异（P〉0．05）;B型rtM204I突变率53．8％（14／26）,综合变异率46．2％（12／26）,C型rtM2041变异率26．7％（15／57）,综合变异率73．7％（42／57）,B、C基因型变异位点类型有统计学差异（P〈0．05）;耐药变异时c型HBVDNA水平（6．60±1．42）lg拷贝／毫升高于B型（5．88±1．46）1g拷贝／毫升,YIDD变异时c型（6．40±1．48）lg拷贝／毫升、B型（5．68±1．32）1g拷贝／毫升,YVDD变异时C型（6．18±1．87）1g拷贝／毫升、B型（6．82±1．45）lg拷贝／毫升;rtM204I变异时B型（6．12±1．45）lg拷贝／毫升、C型（5．57±1．45）lg拷贝／毫升（P〉0．05）;综合变异时c型（6．68±1．51）lg拷贝／毫升,B型（5．76±1．57）lg拷贝／毫升（P〈0．05）。结论c基因型拉米夫定耐药发生率高于B型;基因型与变异位点类型有关,与YMDD变异模式无关;耐药变异时HBVDNA水平c型高于B型,与综合变异有关,与YMDD变异模式无关。     

变性高效液相色谱法检测乙型肝炎病毒YMDD基序的变异

目的 建立变性高效液相色谱(DHPLC)检测HBV DNA聚合酶活性区酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)基序变异的方法.方法 分别采用荧光PCR法和DHPLC法检测61例慢性乙型肝炎(CHB)患者经拉米夫定治疗1年后HBV YMDD基序变异,并经基因测序法验证.结果 共检出10例野生型、5例DNA聚合酶活性区酪氨酸-异亮氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YIDD)完全突变型、2例DNA聚合酶活性区酪氨酸-缬氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YVDD)完全突变型,3例YMDD与YIDD混合突变型,1例YMDD与YVDD混合突变型,2种方法检出结果一致;21例PCR产物经过基因测序法得到证实. 结论 PCR结合DHPLC检测YMDD基序变异,经济便捷,适用于筛查CHB患者的YMDD基序变异.     

乙型肝炎病毒基因型、拉米夫定耐药突变的RFLP检测及临床相关性分析

目的对乙型肝炎（简称乙肝）肝病毒进行基因分型,检测患者服用拉米夫定后血清中乙肝病毒突变情况,并进行临床相关性分析。方法设计乙肝病毒突变及基因分型特异性引物和酶切位点,系用限制性片断长度多态性（RFLP）分析法检测突变类型并对乙肝病毒进行基因分型。结果在115份被检测的血清标本中,75份（65%）标本为野生型,18份（15.7%）标本为YIDD突变,10份（8.7%）标本为YVDD突变;在混合型突变中,YIDD+YVDD 存在于6份（5.2%）标本中,YMDD+YIDD存在于4份（3.5%）标本中,2份（1.7%）标本为YMDD+YVDD混合突变型;未检测到YSDD突变型。在180位点的突变检测中,98份（85%）标本为野生型,5份(4.3%)标本为rtL180M,L180M+M204I存在于8份(6.96%)标本中,另4份(3.5%)标本为L180M+M204V混合突变型。在115份标本中,102份标本为C基因型,13份标本为B基因型,未发现其他基因型。通过χ²检验,乙肝病毒YMDD突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间没有相关性(P＞0.05),而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性（P＜0.05）,用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180位点的突变和204位点突变具有相关性（P＜0.05）。结论采用RFLP分析法可以有效地检测乙肝病毒YMDD突变并对乙肝病毒进行基因分型。     

基因芯片检测拉米夫定引起的乙型肝炎病毒基因YMDD变异的研究

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)变异基因诊断芯片,对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测诊断。方法:设计特异性寡核苷酸探针。用点样法制备HBV变异基因诊断芯片。选择住院患者30例服用拉米夫定后,HBVDNA转阴[<500拷贝(opies/ml)]68周后又反跳≥5000copies/ml的患者进行基因芯片杂交检测。同时用PCR直接测序法对30例患者血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。结果:30例服药后HBVDNA反跳患者中基因芯片测得HBVYMDD变异21例,其中YVDD变异11例,YIDD变异10例。直接序列测定发现有核苷酸A741变为G,使氨基酸由蛋氨酸552变为缬氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YVDD)11例,有6例核苷酸A669变为C,使氨基酸由亮氨酸528变为蛋氨酸;核苷酸G743变为T,使氨基酸由蛋氨酸552变为异亮氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YIDD)10例。其中有3例伴有核苷酸T781变为C,使氨基酸由亮氨酸565变为脯氨酸。其结果与基因芯片完全一致。结论:HBV变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异,同PCR直接测序法比较,准确率达100%,无假阳性。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎发生病毒学反弹患者YMDD变异分析

选取402例服用拉米夫定后出现乙型肝炎病毒(HBV)DNA反弹的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清样品,应用荧光PCR法定性检测YMDD变异情况。402例中有309例(76.87%)检测出YMDD变异,其中120例为YVDD变异,74例为YIDD变异,115例为YVDD+YIDD联合变异;309例YMDD变异患者中同时检测出变异株与野生株占69.26%(214/309),仅检测出变异株占30.74%(95/309)。另外,93例为YMDD野生型阳性。     

Analysis of YMDD mutation in chronic hepatitis B patients with virologic breakthrough after lamivudine treatment

选取402例服用拉米夫定后出现乙型肝炎病毒(HBV)DNA反弹的慢性乙型肝炎 (CHB) 患者血清样品,应用荧光PCR法定性检测YMDD变异情况.402例中有309例(76.87%)检测出YMDD变异,其中120例为YVDD变异,74例为YIDD变异,115例为YVDD+YIDD联合变异;309例YMDD变异患者中同时检测出变异株与野生株占69.26%(214/309),仅检测出变异株占30.74% (95/309).另外,93例为YMDD野生型阳性.     

基因芯片技术在检测乙型肝炎病毒 P区YMDD变异中的研究

目的 用基因芯片检测未经抗病毒治疗的HBV DNA阳性血清中HBV P区YMDD变异情况,从分子生物学角度了解YMDD两种变异的状态,为科学合理地指导临床抗病毒治疗及预测患者临床预后提供有力的依据。方法 将150份未经抗毒治疗的HBV DNA阳性血清,用PCR方法扩增P区,扩增产物与基因芯片上的寡核苷酸进行杂交,杂交结果通过扫描仪扫描到计算机上,经软件分析可得到HBVY MDD野生型及其YVDD和／或YIDD变异型结果,并对部分阳性标本用基因序列测序证实。结果 150份HBV DNA阳性血清,用基因芯片方法检出阳性标本(包括YMDD野生型和变异型)共122例,占81．3％,阴性标本28例,占18．7％;在122例阳性标本中,单纯YMDD野生型(即无变异标本)有90例,占73．8％;YVDD变异28例,占22．9％;YIDD变异2例,占1．6％;YVDD和YIDD混合变异2例,占1．60A,,变异株检出率为26．2％,而且变异株均与野生株共存。其中8份阳性标本进行基因序列测序,证实与芯片检测结果完全一致。结论(1)用当前先进的基因芯片技术检测HBVP区YMDD变异,操作简便,结果可靠,特异性高。(2)基因芯片可快速、同时、多人份检出HBVYMDD野生株及其YIDD和／或YVDD突变株的共同感染。(3)部分HBV感染者在未经抗病毒治疗情况下已自然存在HBV YMDD变异,而且变异株均与野生株共存,其中以YVDD变异为多。(4)HBV感染患者在治疗前后有必要检测是否存在HBV YMDD变异株感染,为指导临床科学合理用药和制定治疗方案提供依据。     

LDR法检测HBV P基因区野生型和突变型片段

目的 探讨连接酶检测反应(LDR)方法同时检测HBV P基因区野生型和突变型片段的可行性.方法 针对拉米夫定、替比夫定、阿德福韦和恩替卡韦8个耐药位点上的氨基酸替换形式,设计15对特异性引物,采用多重PCR扩增HBV P基因区野生型和突变型目的 片段,然后进行多重LDR,最后在ABI3130测序仪上电泳,根据内参标记、LDR产物的长度进行结果判读.应用此方法对12例慢性HBV感染患者血清进行检测,焦磷酸测序技术对其验证,判断其特异性和准确性.结果 LDR法能有效区分包括rtL180M、YMDD、YIDD、YVDD、rtA181V/T、rtN236T、rtT184G、rtS202I、rtM250V野生株和部分突变株;4例HBVDNA大于106copies/ml患者检测出野生株和突变株,结果与焦磷酸测序一致.结论 血清HBVDNA大于106copies/ml时结合多重PCR的复合LDR可通过一次扩增检测产物中的多个单突变或野生型位点,有助于核苷(酸)类似物耐药的诊断和治疗.     

锁核酸探针多重荧光定量PCR检测HBV基因变异

[摘要] 目的 描述并评价锁核酸（locked nucleic acid,LNA）探针实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time PCR）检测乙型肝炎病毒（HBV）204位基因突变的方法及特点。方法 分别用直接测序法、锁核酸（LNA）探针实时荧光定量PCR检测109例接受拉米夫定（LAM）治疗6个月以上的慢性乙型肝炎患者的血清样本。结果 LNA探针实时荧光定量PCR能检测HBV野生型YMDD和其突变型YVDD,YIDD。而且,这种方法还可以检测HBV野生型和变异型的混合。LNA探针相比普通探针在检测野生型和突变型混合样本方面,更敏感,区分度更好。结论 LNA探针实时荧光定量PCR检测YMDD变异具有快速,灵敏,等特点,可以用于大量临床样本的快速筛查,在监测拉米夫定治疗疗效及发现新耐药突变型等方面具有广泛的应用前景。     

未予核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎病毒感染者YMDD变异及特点

目的探讨未予核苷(酸)类似物(NA)治疗乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者P基因YMDD基序变异对于血清肝脏生化指标的影响,及YMDD变异两种形式YIDD/YVDD与HBV e抗原(HBeAg)的关系。方法采用引物特异性实时荧光聚合酶链反应(PCR)法检测慢性HBV感染者外周血HBV P基因区YIDD/YVDD变异及HBVDNA载量,并检测HBeAg、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平。结果 334例未经NA抗病毒治疗的慢性HBV感染者中,HBV未变异300例,YVDD变异23例,YIDD变异9例,YIDD、YVDD共生株2例。慢性HBV感染者HBeAg阳性与YIDD变异有关(P<0.05),与YVDD变异无关(P>0.05)。YMDD变异者与未变异者AST、ALT水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而HBV DNA比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV感染者发生YIDD/YVDD变异者,其血清ALT、AST水平均低于未变异者。HBeAg阳性者可能更易发生HBV YIDD变异,而YVDD变异可能与HBeAg状态无关。     

拉米夫定与HBV-YMDD变异关系的研究

目的探讨惠州地区慢乙肝（CHB）患者拉米夫定治疗与HBV～YMDD变异的发生和发展的关系。方法选取在肝病专科就诊的176例CHB患者，在服用拉米夫定前及服药后每半年进行HBV—DNA定量及YMDD变异检测，并选取35份发生YMDD变异和10份野生型YMDD血清样本进行DNA测序。结果176例CHB患者样本中，拉米夫定治疗前检出YMDD变异7例（其中YM／YVDD型2例、YVDD型3例、YIDD型2例），变异率3．98％；治疗2年后共检出62例（其中YVDD型9例、YIDD型36例、YM／YVDD混合型9例、YM／YIDD混合型3例、YV／YIDD混合型5例），变异率35．23％。6例CHB患者在拉米夫定治疗过程中其YMDD变异类型会发生改变。结论惠州地区CHB患者经拉米夫定治疗，随着病情发展，变异类型可能会发生改变，YIDD可能是最终的变异类型，YM／YVDD、YVDD和YM／YIDD可能都是过渡的变异类型。     

慢性乙型肝炎替比夫定相关耐药突变15例回顾性分析

目的研究慢性乙型肝炎(CHB)患者替比夫定(LdT)相关耐药的HBV聚合酶基因突变模式及临床特点。方法对LdT治疗中病毒学突破的HBeAg阳性CHB,经焦磷酸测序法证实为LdT耐药突变的15例患者进行回顾性分析。结果共检出4个耐药突变位点呈5种模式,分别为rtM204I 9例,rtM204I+rtL180M 3例,rtM204I+rtV173L、rtM204I+rtV173L+rtL180M和rtM204I+rtV173L+rtA181V各1例。治疗24周时患者血清HBV-DNA均<104拷贝/mL,其中60%(9/15)的患者<103拷贝/mL;耐药突变发生于用药后40～111周,均未出现HBeAg血清学转换。结论 rtM204I是LdT耐药的主要突变模式,对未出现HBeAg血清学转换的患者,即使在24周HBV-DNA<103拷贝/mL,仍需关注其耐药突变。     

拉米夫定耐药HBV毒株伴随变异与YMDD变异的关系

目的研究拉米夫定耐药（LAMr）HBV毒株伴随变异及其与YMDD变异的关系。方法PCR方法扩增LAMr病人血清的HBVRT区基因，直接测序PCR产物。对测序发现含有LAMr变异的105例病人血清检测变异时HBVDNA载量，分为第1组含rtV173L／M或rtV207M／L／I变异、第2组含rtS213T变异、第3组不含此3种变异，共3组进行分析。结果①拉米夫定（LAM）治疗B、C基因型乙型肝炎病毒（HBV）感染的慢性乙型肝炎（CHB）病人耐药主要变异位点为YMDD变异，可以伴随rtL180M、rtV173L／M、rtV207M／L／I、rtS213T等变异，LAMr变异形式构成与基因型无关（P=0．2620）。②rtM204I、rtM204V、rtM204V／I变异分别有38．8％、89．2％、73.3％伴随其它位点变异（P〈0．0001）。③3组测序发现变异时HBVDNA载量分别为（7．43±0．16）log10拷贝／mL、（5．01±0．90）log10拷贝／mL、（5.75±0．34）log10拷贝／mL（F=4．48，P=0．0240）。结论LAM治疗B、C基因型HBV感染的CHB病人耐药变异形式构成无显著差异，rtM204V变异较rtM204I变异更易伴随其它位点变异，伴随变异rtV173L／M、rtV207M／L／I可以增强YMDD变异HBV毒株的复制能力。     

异柠檬酸脱氢酶1基因突变焦磷酸测序检测方法的建立

目的建立异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase 1,IDH1）基因突变的焦磷酸测序检测方法,确定该方法的检测灵敏度。分析焦磷酸测序法与直接测序法对于鉴定IDH1突变的差异。方法构建携带野生型和突变型IDH1基因的质粒,使用质粒优化焦磷酸测序方法。使用已知比例的野生型和突变型质粒作为模版,确定突变的检测灵敏度。针对96例胶质瘤患者手术切除标本的基因组DNA,分别使用直接测序法和焦磷酸测序法,鉴定IDH1基因突变类型,并比较。结果使用焦磷酸测序能够检测到低至2%的IDH1突变。直接测序检出突变阳性率为32.3%、焦磷酸测序检出突变阳性率为74.0%。结论焦磷酸测序法检测IDH1基因突变灵敏可靠,适合临床分子诊断。     

乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用

目的 建立直接测序法检测HBV P区耐药变异情况并分析基因型.探讨HBV基因型与临床病情的关系.方法 检测46例乙肝患者血清样本,采用特异的引物对待检标本HBV P区进行PCR扩增后作基因序列检测,利用Chromas2.23软件对测序结果 进行分析有无突变产生,测序结果 用软件clustalx1.81进行基因分型分析.结果 可通过一次测序反应完成对HBV.DNA P区的基因检测及基因型分析.检出YMDD变异株8例,其中YIDD 5例,YVDD 3例.在检测的46例标本中23例为B基因型,阳性率为50.0%;有21例为C基因型,其阳性率45.6;D基因型2例,阳性率4.4%.B基因型HBV感染者中HCC 2例,占8.7%;C基因型HBV感染者中HCC 8例,占38.1%.结论 直接测序法分析HBV常见耐药突变位点及基因型准确可行,B基因型乙肝患者预后优于C基因型患者.     

拉米夫定治疗引起HBVYMDD变异的检测及临床意义

目的 探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎引起的HBVYMDD变异与HBVDNA病毒载量与血清谷丙转氨酶(ALT)之间的关系.方法 140例拉米夫定治疗48～96周的慢性乙型肝炎患者为研究对象.用荧光定量PCR法检测HBVDNA,基因序列分析检测HBVYMDD变异,全自动生化分析仪检测ALT水平.结果 140例检测标本46例存在YMDD变异,变异率为32.86%,其中29例(20.71%)为rtM204V/rtL180M变异,16例(11.43%)为rtM 204 I变异,1例(0.72%)为rtM204I/rtL180M变异.HBVDNA＞105拷贝/mL的发生率变异株组(40/46,86.96%)明显高于野生株组(6/94,6.38%)(χ2=90.889,P＜0.01).血清ALT水平变异株组(143.96±192.97)u/L明显高于野生株组(41.29±31.54)u/L(F=25.409,P＜0.01).结论 慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定48～96周YMDD变异率为32.86%,变异类型以rtM204V/rtL180M为主,其次为rtM 204I.变异时HBV-DNA病毒载量及ALT水平升高.