多巴胺D5受体转基因小鼠的建立

目的建立人多巴胺D5受体突变基因F173 L（D5F173L）,S390G（D5S390G）及正常人D5基因（hD5 WT）的转基因小鼠,利用该转基因动物模型来研究D5受体在原发性高血压中的发病机制。方法利用显微注射的技术将插入CMV启动子下游的D5F173L,D5S390G及hD5 WT基因的转基因载体注射入C57BL/6小鼠体内,建立多巴胺D5F173L,D5S390G及hD5 WT的转基因小鼠。通过PCR鉴定转基因小鼠的基因型。利用Western Blotting方法鉴定该受体蛋白在肾脏的表达情况。使用智能无创血压测量仪测量转基因小鼠的血压值。结果分别建立了多巴胺D5F173L,D5S390G及hD5 WT转基因C57BL/6小鼠,Western Blotting方法鉴定结果显示,与非转基因C57BL/6小鼠比较,D5转基因小鼠D5受体在肾脏有较高的表达。3-6月龄D5 F173L转基因小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉血压均明显高于多巴胺D5S390G及hD5 WT转基因小鼠（n=6-8,P〈0.05）。结论多巴胺D5受体在原发性高血压发病中具有重要作用,但作用机理还有待于进一步研究。     

不同鼠龄的人多巴胺D5~(F173L)突变基因转基因高血压小鼠血压及心脏结构与功能分析

目的通过对不同年龄多巴胺D5F173L突变基因及D5正常基因转基因小鼠的血压和心脏结构与功能进行分析,了解多巴胺D5受体在高血压发生发展过程中的作用。方法利用无创血压测量仪和高分辨率小动物超声系统检测两种转基因小鼠的血压和左心室壁厚度、左心室内径、左心室容积、射血分数、短轴缩短率和左心室质量等心脏功能指标。结果 D5F173L转基因小鼠4月龄、6月龄、16月龄时收缩压、舒张压都明显高于D5转基因小鼠;4月龄、6月龄的D5F173L转基因小鼠与D5转基因小鼠相比舒张期和收缩期左室壁厚度均明显增大、左室内容积均明显变小、左心室重量增加;16月龄的D5F173L转基因小鼠与D5转基因小鼠相比左心室前壁增厚、心腔内径缩短,心腔容积下降、心室重量增加、射血分数提高、短轴缩短率提高;在18月龄时D5F173L转基因小鼠相比于D5转基因小鼠左心室收缩期前壁厚度增加,后壁厚度减少,舒张期前壁厚度增加,后壁厚度减少;另外在18月龄时D5F173L转基因小鼠与其16月龄时相比,射血分数、短轴缩短率明显降低,收缩期左心室容积明显增大。结论 D5F173L转基因小鼠的血压及心脏功能与结构的分析结果符合原发性高血压的特征。D5F173L转基因小鼠可作为原发性高血压动物模型。     

降钙素基因相关肽转基因小鼠的建立及血压动态分析

目的 建立降钙素基因相关肽α(calcitonin gene-related peptide, CGRPα)和β(CGRPβ)转基因小鼠,并对其血压进行动态对比分析,建立可用于高血压研究的动物模型。方法 把人CGRPα和CGRPβ基因分别插入鸡β-肌动蛋白启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J CGRPα和CGRPβ转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型。采用Western Blot鉴定CGRPα和CGRPβ在心脏、肺、肾脏和肝脏组织中的表达,筛选高表达转基因品系。用无创血压测量仪分析转基因小鼠动态血压变化。结果 建立了在心脏、肺、肾脏和肝脏组织中均高表达CGRPα基因的CGRPα转基因小鼠;在肺和肝脏组织中高表达CGRPβ基因的CGRPβ转基因小鼠。CGRPα转基因小鼠血压正常,CGRPβ转基因小鼠在12月龄时表现出显著的血压降低。结论 CGRPα和CGRPβ转基因小鼠可作为用于CGRP对外周血管阻力和高血压抵抗机制研究的动物模型。     

氧化应激在D5多巴胺受体基因敲除小鼠血压升高中的作用研究

目的探讨还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶在D5受体基因敲除（D5-/-）小鼠血压升高发生机理中的作用.方法利用第六代D5-/-小鼠和其对照（D5＋/＋）小鼠,检测其肾脏NADPH氧化酶的活性和表达;利用D5受体基因转染的HEK-293细胞作为研究对象,刺激D5受体,研究D5受体对超氧阴离子（O2^-）和过氧化氢（H2O2）的影响.结果 D5-/-小鼠的血压、肾脏NADPH氧化酶的活性和p47^phox蛋白的表达均明显高于D5＋/＋小鼠.多巴胺D5受体激动剂Fenoldopam可降低D5转染HEK-293细胞的O2^-和H2O2的产量.结论氧化应激和NADPH氧化酶活性增强参与了D5-/-小鼠血压升高的发生过程,多巴胺D5受体具有抗氧化应激的功能.     

人心肌肌钙蛋白C两种突变转基因小鼠模型建立与对比分析

目的为建立心肌组织特异性表达人cTnCD145E和cTnCG159D突变基因转基因小鼠,为对比分析两种不同心肌病的发生发展建立模型。方法利用定点突变技术分别制备人cTnC基因的cTnCD145E和cTnCG159D两个突变体,随后插入心肌特异性表达启动子α-MHC下游构建人cTnCD145E和cTnCG159D基因转基因载体。通过显微注射法建立转基因C57BL/6小鼠。利用心脏超声和病理观察对比分析不同年龄转基因小鼠心脏的结构与功能。结果建立了心肌组织高表达人cTnCD145E和cTnCG159D突变基因转基因小鼠,cTnCD145E和cTnCG159D转基因小鼠随年龄增加,有分别向HCM和DCM发展的趋势,12月龄时,cTnCD145E转基因小鼠收缩末期和舒张末期左室容积(left ventricle end-diastolic volume and end-systolic volume,EDV and ESV)与同窝阴性小鼠相比下降,射血分数(ejection fraction,EF)和收缩末期左心室后壁厚度(left ventricle end-systolic posterior wall thickness,ESPWT)增加,而cTnCG159D转基因小鼠EDV和ESV与同窝阴性小鼠相比上升,EF和ESPWT减少。结论心肌组织特异性表达人cTnCD145E突变基因转基因小鼠表现肥厚型心肌病病理表型,而心肌组织特异性表达人cTnCG159D突变基因转基因小鼠表现扩张型心肌病病理表型,二者可作为对比研究由不同发病机制导致的心肌病模型。     

miR-5572转基因小鼠构建病态窦房结综合征疾病模型的繁殖与鉴定

目的 探讨miR-5572转基因小鼠构建病态窦房结综合征疾病模型的可行性。方法 繁殖与鉴定了miR-5572 F1及F2代野生型纯合子及杂合子小鼠,并通过形态学、心电图记录及窦房结组织Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表达水平测定来观察疾病模型。结果 F2代miR-5572纯合子敲入小鼠在形态上较野生型小鼠生长缓慢,体型较小。相较于杂合子和野生型小鼠,纯合小鼠的平均心率明显偏低（P<0.05）,差异有显著性。miR-5572纯合子小鼠窦房结组织Cav1.2、Cav1.3 mRNA和蛋白表达水平低于野生型（P<0.05）,差异有显著性。结论 过表达miR-5572转基因小鼠可以构建病态窦房结综合征疾病模型。     

三转基因银屑病小鼠模型建立与表型分析

目的 尿激酶型纤溶酶激活剂(PLAU)、尿激酶型纤溶酶激活剂受体(PLAUR)和信号传导与转录激活因子3(STAT3)是参与银屑病病理发生的重要基因。本文目的是制备皮肤特异性表达PLAU、PLAUR和STAT3三种基因的转基因小鼠,建立可进行性再现银屑病病理进程的小鼠模型。 方法 将PLAU、PLAUR和STAT3基因分别插入牛角蛋白5启动子(BK5)下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立在皮肤组织同时高表达PLAU、PLAUR和STAT3三种基因的转基因C57BL/6J小鼠。利用PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,HE染色观察皮肤病理表型。 结果 PLAU、PLAUR和STAT3三种基因在选定的转基因小鼠皮肤组织均有明显表达;转基因小鼠与同龄野生型小鼠相比表皮状态差,炎症明显;4月龄的转基因小鼠真皮变簿,表皮过度角化、棘层增厚,毛囊减少、发育异常、部分毛囊内未见毛干,角化不全区域内可见Munro氏小脓肿,真皮炎细胞浸润。 结论 建立了稳定传代的皮肤特异性表达PLAU、PLAUR和STAT3基因的转基因小鼠品系,转基因小鼠具有进行性的银屑病表型,可以作为多病因综合银屑病小鼠模型。     

雄性生殖细胞特异性表达绿色荧光蛋白小鼠的繁殖及其表型鉴定

目的 繁殖雄性生殖细胞特异性表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)小鼠, 为进行小鼠生殖系统毒性研究提供有效的工具。方法 将Ddx4-cre转基因雄鼠与Rosa26mT/mG转基因雌鼠交配, 产生子代动物, 利用分子生物学、组织病理学及活体成像等技术, 分别从分子、细胞和组织水平对子代及其亲代小鼠进行表型鉴定。结果 PCR结果表明在子代小鼠的睾丸组织中发生了Cre酶介导的特异性基因重组;活体成像可以看到在F1代小鼠的睾丸组织中具有GFP的表达;睾丸冰冻切片及精子荧光观察显示GFP主要表达于次级精母细胞、精子细胞和精子中。结论 雄性生殖细胞特异性表达GFP小鼠繁殖成功。     

维生素E经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路抑制oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤

【目的】 复制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein,oxLDL)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)损伤模型,建立慢病毒介导的LOX-1-shRNA转染HUVEC细胞模型,从LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路研究维生素E(Vit E)对oxLDL诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用。 【方法】 以200 μg/mL oxLDL与HUVEC细胞共孵育24 h,用于复制细胞损伤模型;实验设计分为:正常对照组、oxLDL模型组、药物组(200 μmol/L Vit E);以MTT检测细胞存活率,DCFH-DA检测细胞内ROS及蛋白质印迹法检测LOX-1、NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p47phox、p67phox)蛋白经时改变(3、6、12、24 h);real-time PCR检测24 h后LOX-1、NADPH氧化酶亚基(p22phox、gp91phox、rac1)mRNA的表达,采用慢病毒介导的基因沉默技术抑制LOX-1表达48 h后,用oxLDL诱导24 h,检测LOX-1蛋白、NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白和ROS的含量。采用SPSS 17.0进行统计学分析。 【结果】 与正常组比较,oxLDL处理后细胞生存率仅为50.31%,LOX-1蛋白伴随细胞氧化损伤在3、6、12、24 h表达量显著增加,且在3 h和24 h时呈现两个表达高峰(P<0.05),NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达水平在各时间点均显著升高(P均<0.01),24 h达高峰,ROS检测结果表明其动态经时改变在3 h和24 h达峰值( P<0.05)。Real-time PCR结果显示,LOX-1 mRNA及NADPH氧化酶亚基(gp91phox、p22phox、rac1) mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。慢病毒介导LOX-1基因沉默后,最佳转染效率为73.23%。oxLDL诱导24 h后,LOX-1及NADPH氧化酶亚基(p47phox、p67phox、gp91phox)蛋白表达下调,ROS生成量相应降低。VitE组下调LOX-1和NADPH氧化酶的mRNA及蛋白质表达并降低ROS生成。 【结论】 oxLDL经LOX-1/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HUVEC细胞损伤。200 μmol/L的VitE可通过抑制LOX-1/NADPH氧化酶/ROS信号通路的活化而发挥对oxLDL诱导的HUVEC细胞损伤的保护作用。     

CLCN3/MMTV-PyMT转基因小鼠杂交群体的建立及鉴定

目的 建立并鉴定CLCN3/MMTV-PyMT双转基因小鼠杂交群体,构建氯通道ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型.方法 将CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠分别进行繁殖,选取阳性子代鼠进行配对,培育杂交后代,然后通过PCR鉴定基因型、通过组织免疫荧光方法、Western blot检测转基因小鼠蛋白表达情况.结果 成功繁育CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠,经PCR鉴定成功构建CLCN3/MMTV-PyMT双转基因鼠杂交群体,并成功保种和扩群,经组织免疫荧光和Western-blot分析双转基因小鼠的ClC-3蛋白的表达高于MMTV-PyMT转基因小鼠.结论 成功构建ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型,为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移中的功能提供了良好的动物模型.     

分子克隆技术制备D5S2845基因座的等位基因分型标准物及其法科学应用研究

目的:调查D5S2845基因座在华东汉族人群的群体遗传学数据,解决长期困扰短串联重复序列(shorttandem repeat,STR)分型上存在的准确性和标准化问题。方法:首先利用PCR结合聚丙烯凝胶电泳技术调查华东汉族群体的等位基因频率及基因型分布,再用PCR扩增出D5S2845基因座的8个等位基因片段,将其插入pUC重组质粒中,经DNA测序分析证实插入片段的结构及大小,用国际标准将插入的等位基因片段进行命名,最后经转染、扩大培养、扩增及再鉴定后,制备出标准的D5S2845等位基因分型标准物。结果:D5S2845基因座在华东汉族群体中均有较高的多态性,其非父排除概率及个人识别能力分别为0.558和0.896,应用分子克隆技术制备出大量的D5S2845基因座等位基因分型标准物。结论:D5S2845基因座是一个适合于群体遗传学研究和法科学应用的遗传标记。分子克隆方法制备的STR基因座等位基因分型标准物在法科学实践中应用价值较高。     

连接酶反应分析ALOX5AP基因?PDE4D基因与江苏南京地区腔隙性脑梗死的易感性

目的:分析江苏省南京地区汉族人群腔隙性脑梗死患者的ALOX5AP基因?PDE4D基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),并研究其与脑梗死的发病是否存在相关性?方法:运用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和连接酶检测反应(ligase detection reaction,LDR),观察280例腔隙性脑梗死患者和258例对照组人群的ALOX5AP基因及PDE4D基因的4个SNP位点,并进一步分析其基因型?结果:PDE4D基因rs966221?rs456009的等位基因?基因型频率在两组间没有显著性差异,单倍体型构成在两组间亦无显著性差异;ALOX5AP基因的两SNP(rs 4073259?rs4769055)的等位基因和基因型频率在两组间差异均有显著性(P < 0.05),SNP单倍体型(GA?GC)在两组间差异更为明显(P < 0.01)?结论:本研究未发现PDE4D基因与腔隙性脑梗死的发病相关,但ALOX5AP基因可能为中国江苏省南京地区腔隙性脑梗死的易感基因?     

EQ-5D和SF-6D测量脑卒中患者健康效用值的比较

目的采用6维健康调查简表(SF-6D)和欧洲5维健康量表(EQ-5D)测量我国脑卒中患者健康效用值,并对两种方法进行比较,为今后开展相关成本效用分析提供支持。方法对596例在2010年1月至2016年6月入住四川大学华西医院的首发卒中患者进行前瞻性随访调查,在患者住院期间进行面对面问卷调查,并在出院后每3个月进行一次电话随访。每次调查采用EQ-5D和SF-6D量表评估患者健康效用值。采用Bland-Altman plot分析和组内相关系数(intraclass correlation coefficient, ICC)评价两量表的一致性;采用logistic回归分析健康效用值的影响因素。结果EQ-5D和SF-6D测量脑卒中患者的平均健康效用值及其95%可信区间分别为0.78（0.76,0.80）和0.74（0.73,0.76）,中位数及四分位数间距分别为0.86(0.68,1.00)和0.73(0.62,0.86);ICC为0.67(95%可信区间:0.62,0.71),Bland-Altman plot分析示95%一致性区间为-0.28~0.35,两量表测量结果不一致;EQ-5D具有较强的天花板效应;脑卒中患者发病后效用值在急性期内（<3月）变化明显,急性期后几无变化。无论是EQ-5D还是SF-6D,疾病严重程度都是健康效用值的主要影响因素。结论SF-6D是较为合适的我国脑卒中患者健康效用值测量工具。     

EQ-5D-5L对维持性血液透析患者生活质量与心理社会因素的评价

【摘要】目的 探讨欧洲五维度健康量表（EQ 5D 5L）对维持性血液透析（MHD）患者的生活质量与心理社会因素的评估价值。方法 选用EQ 5D 5L对2018年7月~10月在四川大学华西医院肾内科血液透析中心接受维持性血液透析的176例患者进行问卷调查,分析其与一般资料、匹兹堡睡眠质量指数量表、综合医院焦虑抑郁量表（HADS）、社会支持评定量表、Piper 疲乏修订量表的相关性,并进行单因素和多因素分析其与影响因素的相关性。结果 MHD患者EQ 5D 5L得分为（086±012）分。匹兹堡睡眠质量指数得分、HADS得分、Piper疲乏量表得分与ED 5Q 5L得分均呈负相关（P＜005）,社会支持得分与ED 5Q 5L得分呈正相关（P＜005）。患者HADS、年龄、疲乏、透析后有无工作均是ED 5Q 5L的影响因子（P＜005）。结论MHD患者HADS、年龄、疲乏、失业均影响其生活质量,焦虑抑郁、睡眠质量及疲乏程度越严重,生活质量就越低,患者得到的社会支持越多,生活质量越高。EQ 5D 5L对MHD患者健康相关生活质量与心理社会因素的评估具有重要价值,可在临床推广应用,以提高MHD患者的生活质量。     

中国南方食管鳞癌D5S107和D5S408杂合性丢失与微卫星不稳定性

 【目的】研究中国南方食管癌高发地区（潮汕地区）食管鳞癌5号染色体长臂（5q）部分微卫星标记的杂合性丢失（LOH）和微卫星不稳定（MSI），为食管鳞癌相关抑癌基因的定位提供依据。【方法】采用PCR银染技术，检测58例配对食管鳞状细胞癌标本多个微卫星标记（D5S107；SHGS31088；D5S816；D5S625和D5S408）的杂合性丢失和微卫星不稳定。【结果】SHGS31088，D5S816和D5S625杂合性丢失率和微卫星不稳定都较低；而D5S107和D5S408的杂合性丢失率分别为48.5%和34.3％，微卫星不稳定率分别为9.1％和5.7％。【结论】中国南方食管鳞癌D5S107和D5S408的杂合性丢失率较高，提示在D5S107和D5S408附近可能存在食管癌相关基因。5q区域5个微卫星标记的微卫星不稳定发生率都较低，提示微卫星不稳定在中国南方食管癌发生过程中可能不占主导地位。     

实验克汀病大鼠几项生化指标的观察

作者观察用0.5％NaClO_4饮水复制克汀病大鼠几次生化指标。实验克汀病大鼠某些表现与人类克汀病相似。实验大鼠甲状腺相对重量和血清TSH水平明显高于对照组;血清T_4水平和肝脏α-GPD活性明显低于对照组,证实实验大鼠机体处于甲状肿腺功能低下状态。实验大鼠下丘脑5HT,5HIAA和5HIAA/5HT明显高于对照组证实了下丘脑组织中5HT系统在甲状腺低功条件下代谢旺盛。而另一方面,这种神经介质代谢的变化可能是神经克汀病某些异常行为的生化基础。     

哮喘小鼠肺组织中水通道蛋白5和黏蛋白5AC的表达变化及其相关性研究

目的探讨支气管哮喘(以下简称哮喘)小鼠肺组织水通道蛋白5(AQP5)和黏蛋白MUC5AC基因和蛋白的表达变化及其两者的相关性。方法制作小鼠哮喘模型,测定支气管肺泡灌洗液细胞分类及肺组织湿干重比值,应用Real-time PCR法测定哮喘组(OVA组)和对照组肺组织中AQP5和MUC5AC mRNA的表达,应用免疫组化法测定AQP5在肺组织中的分布,免疫印记法、ELISA法测定AQP5和MUC5AC蛋白在肺组织中的表达。结果小鼠哮喘组肺组织中AQP5表达较对照组明显减低(P<0.01),而MUC5AC表达显著升高(P<0.01),两者呈负相关(r=0.901,P<0.01)。结论哮喘时肺组织中AQP5表达的减低可能与气道MUC5AC表达的升高有关,从而促进了气道黏液过度分泌。     

Immune Intervention Effects of the Induction of Experimental Autoimmune Thyroiditis

To explore immune intervention effects of the combined use of cycloporin A(CsA) and 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25(OH)2D3]at low doses on experimental autoimmune thyroiditis (EAT),porcine thyroglobulin (pTG) was injected into a CBA mouse at the dose of 100μg on day 0 and day 14 to establish the model of EAT.The immune prevention group from day 0 to day 28,and treatment group from day 10 to day 38 were daily administered CsA (10mg/kg) intragastrically and /or 1,25(OH)2D3(0.2μg/kg)ip.After immunized by pTG,the mice were sacrificed on day 28 and day 38 to examine their thyroid gland pathologically,and to check the levels of serum porcine thyroglobulin antibodies (pTGAb),porcine thyromicrosomal antibodies (pTMAb).The incidences of EAT in the immune prevention group and treatment group,with administration of low dose of CsA and 1,25(OH)2D3,were decreased respectively by 44.44% and 37.50%.Those of severe disease in the two groups were decreased respectively by 71.43% and 60.33%.The levels of serum pTGAb and pTMAb in the immune prevention group were lower than those of the positive control group.It was concluded that combined use of CsA and 1,25(OH)2D3 at low doses could effectively prevent EAT with a synergic effect.     

核黄素在5甲基四氢叶酸光降解过程中的作用

目的了解核黄素在5甲基四氢叶酸光降解过程中的作用。方法用溶液吸收光谱仪和荧光光谱仪记录待测液体的吸收光谱,并通过光谱分析来研究叶酸的光降解过程。结果5甲基四氢叶酸的吸收光谱在紫外光和蓝色光的照射下保持不变。加入核黄素后,在250nm处很快出现5甲基四氢叶酸光降解产物——5甲基二氢叶酸所特有的峰值。结论紫外光(UVA)和蓝色光不能使叶酸发生光降解,但加入核黄素后,5甲基四氢叶酸很快光降解为5甲基二氢叶酸。     

食管癌HSD17B4基因表达及其杂合性丢失分析

目的探讨HSD17B4基因在食管癌中的变化及其可能的意义.方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),分析HSD17B4基因mRNA表达状态,同时运用PCR银染技术,检测HSD17B4基因内微卫星标记D5S1384在食管癌组织基因组DNA水平的缺失.结果40例食管癌及其癌旁组织标本微卫星标记D5S1384分析发现,26例为信息个体,12例肿瘤组织存在D5S1384的杂合性丢失,丢失率为46.2%.HSD17B4基因mRNA表达下调的比例为62.5%(25/40).结论HSD17B4可能是5q23区域内的候选食管癌抑制基因.