FRK通过N-cadherin/E-cadherin途径抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移

目的探讨抑癌基因FRK(Fyn-related kinase)影响胶质瘤细胞侵袭和迁移的机制。方法将真核表达质粒pcDNA3.0-FRK和对照质粒pcDNA3.0转入人胶质瘤U25l细胞中,western blot技术检测FRK/N-cadherin/E-cadherin蛋白表达,细胞划痕试验检测细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果与对照组比较,转染pcDNA3.0-FRK质粒24 h后U25l细胞侵袭能力下降47%、迁移能力下降64%,差异均有统计学意义(P0.01);转染pcDNA3.0-FRK可以明显增加N-cadherin/E-cadherin的表达。结论FRK可以通过增加N-cadherin/E-cadherin的表达,进而抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移能力。     

FRK通过FAK信号通路抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭作用的研究

目的研究酪氨酸相关激酶(fyn-related kinase,FRK)是否通过粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)信号通路抑制脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭。方法采用Western blot(WB)检测FRK质粒的转染效果,细胞划痕和Transwell侵袭实验检测过表达FRK及下调FAK对胶质瘤U251细胞迁移和侵袭能力的影响;WB检测过表达FRK对FAK、P-FAK蛋白水平的影响以及下调FAK对FRK蛋白水平的影响。结果FRK质粒转染成功。过表达FRK后胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭能力下降。FAK siRNA干扰效率达到70%,下调FAK后胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭能力下降。过表达FRK后P-FAK的蛋白水平明显下降,而FAK蛋白水平无明显变化,下调FAK对FRK的蛋白水平无明显影响。结论 FRK可能通过抑制FAK的磷酸化来调控胶质瘤的侵袭与迁移。     

FRK通过抑制ERK信号通路对脑胶质瘤细胞增殖作用的研究

目的研究FRK是否通过抑制ERK信号通路进而影响脑胶质瘤细胞的增殖。方法应用PolyJet~(TM)将FRK质粒转染入脑胶质瘤U251细胞中,Western blot(WB)检测转染效率及P-ERK、ERK蛋白水平的变化,EDU实验观察脑胶质瘤细胞增殖能力的变化;用ERK抑制剂PD98059处理U251细胞,WB检测细胞中FRK、P-ERK、ERK的蛋白水平,EDU实验检测脑胶质瘤细胞增殖能力的变化。结果 WB检测显示FRK质粒转染成功,过表达FRK使U251细胞增殖能力降低。过表达FRK降低了P-ERK的蛋白水平,但对ERK总蛋白水平无影响。与对照组相比,ERK抑制剂PD98059组P-ERK的蛋白水平明显降低,但对FRK的蛋白水平无明显影响。ERK抑制剂PD98059处理后,脑胶质瘤U251细胞增殖能力明显降低。结论 FRK可以通过抑制ERK的活性,从而降低脑胶质瘤细胞的增殖。     

FRK通过调节EGFR-Y1173磷酸化促进脑胶质瘤细胞凋亡作用的研究

目的研究FRK是否通过调节表皮生长因子受体(EGFR)-Y1173磷酸化促进胶质瘤细胞的凋亡。方法应用PolyJet~(TM)将FRK质粒转染入脑胶质瘤U251细胞中,western blot(WB)检测质粒转染效果及EGFR蛋白水平和EGFR-Y1173磷酸化水平的变化,流式细胞术检测脑胶质瘤细胞凋亡的变化;转染EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)质粒,或共转FRK和EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)质粒,流式细胞术检测脑胶质瘤U251细胞凋亡的变化。结果成功将FRK质粒转染入脑胶质瘤U251细胞,过表达FRK促进脑胶质瘤U251细胞的凋亡。过表达FRK增加EGFR-Y1173磷酸化水平,而对EGFR蛋白水平无影响。过表达EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)质粒,细胞凋亡均减少,分别减少了25%和75%。WB结果显示,共转FRK和EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)质粒成功;流式细胞术结果显示,与对照组相比,过表达FRK促进了细胞凋亡,EGFR抑制了细胞凋亡,且转染EGFR(Y1173F)质粒组的作用比转染EGFR(WT)的效果更明显。此外,转染EGFR(Y1173F)质粒可逆转过表达FRK对胶质瘤细胞的促凋亡作用。结论 FRK可以通过促进EGFR-Y1173磷酸化从而调节胶质瘤细胞的凋亡。     

人CD80基因转染U251瘤株细胞的实验研究

目的 构建编码人CD80基因的真核表达载体，转染神经胶质瘤细胞株U251，并检测CD80基因在U251中的表达。方法 PCR法扩增人类CD80基因的开放阅读框（ORF）全长，酶切法连接入真核表达载体pcDNA3．1。构建为重组质粒pcDNA3．1／CD80，双酶切及测序鉴定。利用脂质体法将pcDNA3．1／CD80转染U251细胞株，应用RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学法、Western blotting等技术从细胞及分子水平检测人CD80分子在U251细胞表面的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3．1／CD80双酶切可切出约900bp目的片段。测序结果和NCBI检索CD80序列吻合；RT-PCR检测到pcDNA3．1／CD80转染后的U251细胞中CD80mRNA表达；荧光显微镜下观察可见大量免疫荧光标记的绿色荧光细胞，检测转染效率约31．8％；Western blotting可检测到约60kD蛋白条带。结论 本实验成功构建了pcDNA3．1／CD80真核表达载体，并实现了在神经胶质瘤细胞株U251中的表达，为后续研究CD80的表达对肿瘤细胞免疫原性的影响以及制备神经胶质瘤肿瘤疫苗提供了重要的实验材料。     

RhoE表达上调抑制U87细胞增殖与侵袭

目的探讨RhoE在胶质瘤发生发展过程中的作用。方法将包含RhoE基因的质粒转染U87细胞后,采用四唑盐（MTr）法检测细胞增殖能力的变化;Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力的改变;Westernblot分析细胞基质金属蛋白酶（MMP）-2和-9的表达变化。结果RhoE蛋白在U87和U251细胞系中表达明显低于正常人脑胶质细胞;上调RhoE表达,U87细胞增殖和侵袭能力明显下降（P〈0．05）;Westernbolt检测显示上调RhoE表达能够降低U87细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达水平（P〈0．05）。结论上调RhoE的表达能够抑制胶质瘤U87细胞的增殖和侵袭能力。     

FOXC2过表达通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进胶质瘤U87细胞增殖、迁移

目的 探讨FOXC2过表达对胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移的影响及其机制。方法 体外培养人脑胶质瘤U87细胞和人脑胶质细胞HEB。U87细胞随机分为空白组（未转染任何质粒）、空载体组（转染pcDNA3.1空载体质粒）、FOXC2过表达组（转染pcDNA3.1-FOXC2过表达质粒）、FOXC2+抑制剂组[转染pcDNA3.1-FOXC2质粒+Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535（20 μmol/L）]。采用qRT-PCR和免疫印迹法检测mRNA和蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖活性,克隆形成实验分析细胞克隆形成能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力。结果 与HEB细胞比较,U87细胞FOXC2 mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。FOXC2过表达,显著促进U87细胞增殖、侵袭、迁移（P<0.05）,显著增加Vimentin、Wnt1、β-catenin蛋白表达水平以及细胞克隆形成率（P<0.05）,显著降低E-cadherin蛋白表达水平（P<0.05）。抑制Wnt/β-catenin信号通路,显著抑制FOXC2过表达对U87细胞的作用（P<0.05）。结论 FOXC2过表达可通过激活Wnt/β-catenin信号通路,促进U87细胞发生上皮间质转化,从而增加胶质瘤U87细胞增殖、侵袭、迁移能力。     

CREPT对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制

目的 探讨肿瘤高表达细胞周期相关蛋白（CREPT）对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响及可能机制。方法 体外培养人胶质瘤细胞株U373、U251、A172、U87-MG、SHG44，并构建过表达或沉默CREPT的U251细胞；免疫印迹法检测蛋白表达水平；CCK-8法检测细胞增殖能力；Transwell实验检测细胞侵袭能力；细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 U251细胞CREPT蛋白表达水平最高，SHG44细胞最低。沉默CREPT后，U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显下降（P<0.05），p-Wnt和p-β-catenin蛋白表达水平下降（P<0.05）。过表达CREPT后，U251细胞增殖、侵袭和迁移能力明显增强（P<0.05），p-Wnt和p-β-catenin蛋白水平明显升高（P<0.05）。Wnt/β-catenin通路抑制剂KYA1797K可逆转过表达CREPT对细胞增殖、侵袭和迁移的影响（P<0.05）。结论 CREPT可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭和迁移。     

下调磷酸甘油酸激酶1增强胶质瘤U251细胞的放射敏感性

目的研究磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对胶质瘤U251细胞放射敏感性的影响。方法建立放射抵抗的U251(RR-U251)细胞;LipofectamineTM2000方法将抑制PGK1表达的shRNA-PGK1质粒或对照shRNANC转染至U251细胞;荧光定量PCR及Western Blot检测PGK1的表达;MTT检测细胞相对存活率,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果与正常U251细胞相比,RR-U251细胞中PGK1的表达明显增高;放射处理后,RR-U251细胞的相对存活率升高,迁移能力及侵袭能力增强。转染shRNA-PGK1的细胞接受放射处理后,与对照组相比,细胞的相对存活率降低,迁移能力以及侵袭能力减弱。结论下调U251细胞中PGK1的表达可增加其放射敏感性,提示PGK1可能成为增强放射敏感性的调控靶点。     

N-cadherin、E-cadherin及β-catenin在胶质瘤中的表达及意义

目的探讨神经-钙粘素（N—cadherin），上皮-钙粘素（E—cadherin）及B—catenin在人脑胶质瘤中的表达及意义。方法采用S—P免疫组化方法检测N—cadherin、E—cadherin、β—catenin在42例不同级别胶质瘤及8例正常脑组织中的表达。结果N—cadherin，E—cadherin及β—catenin的表达在正常脑组织与胶质瘤之间以及胶质瘤的高低级别组间存在显著差异（P〈0．05），并且在生存时间〉2年组与生存时间≤2年组间差别显著（P〈0．05）；N—cadherin与β—catenin的表达随着肿瘤级别的升高而增高，且二者在胶质瘤中的表达呈正相关（P〈0．05，r=0．778）。E—cadherin的表达随着肿瘤级别的升高而下降，E—cadherin与N—cadherin、β—catenin的表达呈负相关（P〈0．05，r1=-0．747，r2=-0．783）；结论提示N—cadherin与β—catenin的过度表达和E—cadherin的表达下调在胶质瘤的侵袭及恶性进展中起着重要作用。N—cadherin与β—catenin的表达可能与胶质瘤患者的预后密切相关，提示可作为反映胶质瘤恶性程度与预后的指标。     

肉桂醛对神经胶质瘤U251细胞生物学行为的影响

目的 探讨肉桂醛对胶质瘤细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法 体外培养胶质瘤细胞系U251细胞,分为对照组、低剂量肉桂醛组（40 μmol/L）和高剂量肉桂醛组（80 μmol/L）。采用平板克隆和CCK-8试验检测细胞增殖水平;流式细胞术分析细胞凋亡率;Transwell小室实验和细胞划痕试验评估细胞迁移和侵袭水平;免疫印迹法分析凋亡相关蛋白、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达。结果 肉桂醛明显抑制胶质瘤U251细胞增殖、侵袭、迁移能力（P<0.05）,促进细胞凋亡（P<0.05）;抑制Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、 cycling D、C-Myc、β-catenin表达（P<0.05）,促进Cleaved-Caspase-3、Bax表达（P<0.05）;而且,随剂量增大,肉桂醛的作用明显增强（P<0.05）。结论 肉桂醛抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移,促进细胞凋亡,其机制可能与下调PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路有关。     

miR-92b对神经胶质瘤细胞U251增殖及迁移侵袭的 影响

目的 探究miR-92b对神经胶质瘤细胞U251增殖及迁移侵袭的影响以及其可能机制.方法 利用miRNA芯片筛选出在神经胶质瘤细胞U251和人脑正常胶质细胞HEB中差异表达的miRNA;化学合成法制备miR-92b抑制剂,转染后用real-time PCR技术验证表达变化;CCK-8实验检测转染后细胞的增殖能力;划痕实验和Transewll实验检测转染后细胞的迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞中胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)、β-catenin和E-cadherin的表达;荧光酶素实验验证IGFBP-3是否为miR-92b的靶基因.结果 基因芯片结果显示miR-92b在神经胶质瘤细胞中表达水平高于人脑正常胶质细胞(P<0.05);CCK-8实验结果显示转染miR-92b抑制剂后,U251细胞增殖能力降低(P<0.05);划痕实验和Transwell实验结果显示转染miR-92b抑制剂后,U251细胞迁移和侵袭能力降低(P<0.05);Western blot结果显示抑制miR-92b后,IGFBP-3和E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05),β-catenin表达减少(P<0.05);荧光素酶实验结果显示,miR-92b能直接靶向调控IGFBP-3.结论 miR-92b在神经胶质瘤中表达显著增加,其可能通过抑制IGFBP-3蛋白表达,从而促进肿瘤细胞的增殖及迁移侵袭.     

RNA干涉CD44基因抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖与侵袭性研究

目的通过合成靶向分化抗原簇44(CD44)基因的siRNA片段,下调CD44在脑胶质瘤细胞U251中的表达,揭示其在胶质瘤增殖、迁移和侵袭中所起的作用。方法根据CD44基因序列设计并合成的siRNA片段转染U251细胞,利用荧光实时定量(qRT-PCR)检测细胞中CD44基因mRNA水平的变化;蛋白印迹实验(Western blot)检测CD44基因蛋白水平的变化;四甲基偶氮唑蓝染色(methyhhiazolyl tetrazolium,MTT)法检测U251细胞增殖;单细胞划痕愈合实验、Transwell小室侵袭实验检测U251细胞的迁移与侵袭能力变化。结果体外合成的CD44-siRNA能有效抑制U251细胞中CD44基因在mRNA水平与蛋白水平的表达(P0.05),并抑制细胞的增殖(P0.05)和迁移侵袭能力(P0.05)。结论 CD44-siRNA能够有效抑制U251脑胶质瘤细胞的增殖及其迁移侵袭力,为以CD44为靶点的肿瘤基因治疗奠定了基础。     

白藜芦醇通过下调CD44表达抑制胶质瘤U251细胞增殖和侵袭

目的 探讨白藜芦醇对脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响及可能的分子调控机制。方法 体外培养胶质瘤U251细胞,分别用浓度为0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L白藜芦醇继续培养48 h,参考Lipofectamine2000TM说明书将pcDNA3.1/CD44（CD44过表达）、pcDNA3.1（过表达对照）等质粒转染胶质瘤U251细胞并培养24 h进行后续实验。利用CCK-8法检测细胞增殖,利用Transwell实验检测细胞侵袭;RT-PCR和免疫印迹法检测细胞CD44、CyclinD1、CDK4、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达。结果 白藜芦醇明显抑制U251细胞的增殖和侵袭能力（P<0.05）,而且呈浓度依赖性（P<0.05）;所以,用150 μmol/L白藜芦醇进行CD44干预实验。白藜芦醇明显抑制U251细胞CD44、CyclinD1、CDK4、MMP2和MMP9的mRNA和蛋白表达（P<0.05）,而且呈浓度依赖性（P<0.05）。CD44过表达明显抑制白藜芦醇对胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的抑制作用（P<0.05。结论 白藜芦醇抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭,其机制与下调CD44的表达有关。     

槐定碱通过Wnt/β-catenin信号通路抑制人胶质瘤U87细胞迁移、侵袭

目的 探讨槐定碱对人胶质瘤U87细胞迁移、侵袭能力的影响及其作用机制。方法 体外培养人胶质瘤U87细胞,加入槐定碱[0 mg/ml（对照组）,1.0 mg/ml,2.0 mg/ml,3.0 mg/ml]共培养24 h,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,免疫印迹法检测细胞β-catenin、E-cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白表达,RT-PCR检测细胞Vimentin、MMP-9 mRNA表达。结果 槐定碱明显抑制U87细胞迁移、侵袭能力（P<0.001）,而且随浓度增加抑制作用明显增强（P<0.001）。槐定碱明显抑制U87细胞β-catenin蛋白、Vimentin和MMP-9 mRNA和蛋白表达（P<0.01）,明显增强E-cadherin蛋白表达（P<0.01）,而且随浓度增加抑制作用明显增强（P<0.01）。结论 槐定碱能抑制人胶质瘤U87细胞的迁移和侵袭,机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性,阻断细胞上皮间质转化过程。     

CXCR4表达上调对U251细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的 探讨CXC趋化因子-4受体（CXCR4）表达上调对U251细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及其作用机制。方法 构建携带CXCR4基因的质粒,采用电转染法将携带CXCR4基因的质粒整合到胶质瘤U251细胞的基因组中,然后将细胞分为空白对照组、阴性对照组和CXCR4上调组,分别从mRNA水平和蛋白水平检测CXCR4及其他相关基因的表达;MTT试验检测细胞增殖能力的改变;划痕试验检测细胞的迁移能力;Transwell侵袭试验检测细胞侵袭性的变化。结果 与空白对照组和阴性对照组相比,CXCR4上调组U251细胞CXCR4在mRNA和蛋白水平上表达都增强,细胞增殖、侵袭和迁移能力均显著增强;而空白对照组和阴性对照组之间并无明显变化。结论 CXCR4在胶质瘤的增殖、侵袭、迁移行为中发挥着重要的作用,可以被视为胶质瘤治疗的靶向基因。