FRK通过FAK信号通路抑制脑胶质瘤细胞迁移与侵袭作用的研究

目的研究酪氨酸相关激酶(fyn-related kinase,FRK)是否通过粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)信号通路抑制脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭。方法采用Western blot(WB)检测FRK质粒的转染效果,细胞划痕和Transwell侵袭实验检测过表达FRK及下调FAK对胶质瘤U251细胞迁移和侵袭能力的影响;WB检测过表达FRK对FAK、P-FAK蛋白水平的影响以及下调FAK对FRK蛋白水平的影响。结果FRK质粒转染成功。过表达FRK后胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭能力下降。FAK siRNA干扰效率达到70%,下调FAK后胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭能力下降。过表达FRK后P-FAK的蛋白水平明显下降,而FAK蛋白水平无明显变化,下调FAK对FRK的蛋白水平无明显影响。结论 FRK可能通过抑制FAK的磷酸化来调控胶质瘤的侵袭与迁移。     

FRK通过调节EGFR-Y1173磷酸化促进脑胶质瘤细胞凋亡作用的研究

目的研究FRK是否通过调节表皮生长因子受体(EGFR)-Y1173磷酸化促进胶质瘤细胞的凋亡。方法应用PolyJet~(TM)将FRK质粒转染入脑胶质瘤U251细胞中,western blot(WB)检测质粒转染效果及EGFR蛋白水平和EGFR-Y1173磷酸化水平的变化,流式细胞术检测脑胶质瘤细胞凋亡的变化;转染EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)质粒,或共转FRK和EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)质粒,流式细胞术检测脑胶质瘤U251细胞凋亡的变化。结果成功将FRK质粒转染入脑胶质瘤U251细胞,过表达FRK促进脑胶质瘤U251细胞的凋亡。过表达FRK增加EGFR-Y1173磷酸化水平,而对EGFR蛋白水平无影响。过表达EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)质粒,细胞凋亡均减少,分别减少了25%和75%。WB结果显示,共转FRK和EGFR(WT)、EGFR(Y1173F)质粒成功;流式细胞术结果显示,与对照组相比,过表达FRK促进了细胞凋亡,EGFR抑制了细胞凋亡,且转染EGFR(Y1173F)质粒组的作用比转染EGFR(WT)的效果更明显。此外,转染EGFR(Y1173F)质粒可逆转过表达FRK对胶质瘤细胞的促凋亡作用。结论 FRK可以通过促进EGFR-Y1173磷酸化从而调节胶质瘤细胞的凋亡。     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

FRK通过N-cadherin／E-cadherin胶质瘤细胞侵袭和迁移途径抑制

目的探讨抑癌基因FRK（Fyn-relatedkinase）影响胶质瘤细胞侵袭和迁移的机制。方法将真核表达质粒pcDNA3．0-FRK和对照质粒pcDNA3．0转入人胶质瘤U251细胞中,westernblot技术检测FRK／N．cadherin／E—cadherin蛋白表达,细胞划痕试验检测细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果与对照组比较,转染pcl）NA3．0-FRK质粒24h后U251细胞侵袭能力下降47％、迁移能力下降64％,差异均有统计学意义（P〈0．01）;转染pcDNA3．0-FRK可以明显增加N—cadherin／E—cadherin的表达。结论FRK可以通过增加N．cadherin／E—cadherin的表达,进而抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移能力。     

重组人类肝细胞生长因子对胶质瘤细胞增殖及VEGF表达的影响

目的探讨重组人类肝细胞生长因子(rhHGF)对胶质瘤细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法用5、10、20、30μg/L不同浓度的rhHGF作用于体外培养的U251胶质瘤细胞并设立空白对照组,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖;免疫组化及Westernblot检测增殖细胞核抗原(PCNA)和VEGF表达。结果与对照组相比,rhHGF明显促进U251细胞的增殖和生长,其作用呈时间效应关系和一定浓度范围内的剂量效应关系(P<0.05)。Westernblot及免疫组化检测显示,20μg/LrhHGF作用后U251细胞PCNA和VEGF表达上升,呈时间依赖性(P<0.05);细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂PD98059呈剂量依赖性抑制rhHGF诱导的PCNA和VEGF表达增加。结论rhHGF可能通过ERK信号途径促进胶质瘤细胞增殖和VEGF表达,从而影响胶质瘤的生长和血管发生。     

shRNA干扰Survivin基因后胶质瘤细胞中Survinvin及mcm2的表达及意义

目的观察小发夹状RNA(shRNA)干扰生存素(Survivin)对脑胶质瘤细胞株U251中Survivin及微小染色体维持蛋白2(MCM2)表达的影响。方法通过脂质体介导对脑胶质瘤细胞株U251、转染Survivin shRNA质粒PG-sur(p Genesil-Suvrivin)及无意义shRNA质粒PG,采用RT-PCR、Western-blot分别对未转染组(U251)、转染无意义序列组(U251-PG)及转染干扰序列组(U251-sur)检测Survivin的mRNA及蛋白表达情况,流式细胞术(FCM)定量测定各组细胞的细胞周期和细胞凋亡,MTT检测细胞增殖能力。采用RT-PCR、Western-blot分别检测转染前后细胞MCM2的mRNA和蛋白的表达情况。结果与其他两组比较,转染干扰序列组细胞Survivin基因的mRNA及蛋白表达抑制效果显著,细胞增殖能力降低,细胞周期G2/M期阻滞显著,细胞凋亡率升高(p<0.05)。MCM2的mRNA和蛋白表达显著降低。结论靶向Survivin基因的特异性shRNA能够在体外明显抑制U251细胞的生长并诱导其发生凋亡及细胞周期阻滞。且本试验结果表明MCM2是一可靠的细胞增殖标记物,且与Survivin之间不是各自孤的,两者间可能起协同作用共同参与胶质瘤的发生。     

β-catenin介导蛋白激酶D2对脑胶质瘤细胞增殖的影响

目的研究蛋白激酶(PKD2)是否通过β-catenin来调控脑胶质瘤细胞的增殖。方法采用EDU掺入实验观察下调PKD2或β-catenin后U251细胞增殖能力的变化;免疫印迹实验检测下调PKD2后β-catenin总蛋白水平及其在细胞膜、细胞浆及细胞核中的变化。结果与对照组相比,下调PKD2后U251细胞增殖能力降低;β-catenin总蛋白水平无明显变化,但细胞浆β-catenin水平明显增多,细胞核中明显减少,差异有统计学意义(均P0.01)。与对照组相比,下调β-catenin后,U251细胞增殖能力降低,差异有统计学意义(P0.01)。结论下调PKD2可能通过抑制β-catenin向细胞核转位而抑制脑胶质瘤细胞的增殖。     

PI3K抑制剂AZD8835对人脑胶质瘤细胞生物学功能的作用

目的探究PI3K抑制剂AZD8835体外对人脑胶质瘤细胞(U87细胞和U251细胞)生物学功能的作用。方法在U87细胞和U251细胞中加入不同浓度的AZD8835,应用CCK8法和EDU实验检测AZD8835对胶质瘤细胞增殖能力的影响,应用Transwell实验检测AZD8835对胶质瘤细胞侵袭能力的影响,应用流式细胞术检测AZD8835对胶质瘤细胞凋亡的影响。结果 AZD8835显著抑制胶质瘤细胞U87和U251增殖能力和侵袭能力,并诱导细胞凋亡,其对胶质瘤细胞生物学功能的影响呈明显剂量依赖性。结论 AZD8835能有效抑制胶质瘤细胞U87和U251增殖与侵袭,诱导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。AZD8835可作为一种潜在提高胶质瘤疗效的辅助疗法。     

STIP1对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨下调磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）表达对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，及其对JAK2/STAT3信号通路的调控作用。方法 免疫印迹法检测体外培养的正常胶质细胞（SVG）和人胶质瘤细胞（U251、U87和U37）STIP1蛋白表达水平。NC-siRNA或STIP1-siRNA质粒转染U251细胞，CCK-8法检测U251细胞增殖；Transwell实验检测U251细胞侵袭能力；流式细胞术检测U251细胞凋亡率；免疫印迹法检测JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平。结果 与正常胶质细胞SVG比较，胶质瘤细胞U251、U87和U373的STIP1蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）。与NC-siRNA组比较，STIP1-siRNA组STIP1蛋白表达水平、细胞增殖活力和细胞侵袭力明显明显降低（P<0.05），细胞凋亡率明显增高（P<0.05），而且，p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 STIP1在胶质瘤细胞中呈高表达，抑制STIP1表达可以抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭、促进凋亡，机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。     

应用siRNA敲低MMP-9基因表达后对人U251胶质瘤细胞增殖和侵袭的作用

目的 研究siRNA靶向抑制MMP-9基因对U251细胞的增殖和侵袭的抑制作用.方法 采用oligofectamine转染试剂将siRNA导入到胶质瘤细胞U251,分别采用半定蕈PCR及Western blotting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用细胞生长曲线、MTT和流式细胞法检测siRNA对细胞增殖的影响,应用2D、3D生长实验(Two,three-dimensional growth experiment)和Transwell实验检测转染MMP-9 siRNA后对细胞侵袭的影响.结果 半定量PCR以及Western blotting显示MMP-9基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到抑制;细胞生长曲线、MTT检测及流式细胞仪检测结果显示MMP-9基因表达被抑制后,U251细胞增殖率明显受到抑制,2D、3D生长实验和Transwell侵袭实验证实转染后U251细胞体外侵袭能力明显降低(P＜0.01).结论 应用siRNA敲低胶质瘤细胞MMP9基因表达后,胶质瘤细胞的侵袭和增殖能力明显下降.     

RNAi沉默c-Met基因对人脑胶质瘤U251细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 探讨RNA干扰技术沉默c-Met基因表达对人脑胶质瘤U251细胞生长活力及体外侵袭能力的影响。方法 将设计好的c-Met基因干扰载体转染至U251细胞中,根据转染质粒不同分为空白对照组（不转染任何质粒）、空载体组（转染空载体）和干扰组（转染重组质粒）。采用四唑盐比色法（MTT）检测细胞的生长活力的变化;采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化。结果 MTT检测结果显示干扰组光密度值（0.156±0.164）显著低于空白对照组（0.21±0.146;P<0.05）和空质粒组（0.191±0.138;P<0.05）,而空质粒组和空白对照组无显著差异（P>0.05）。细胞体外侵袭能力检测结果显示,干扰组穿膜细胞数[（13.60±3.34）个]显著低于空白对照组[（32.90±6.49）个;P<0.05]和空质粒组[（23.10±2.77）个;P<0.05],而空质粒组和空白对照组无统计学差异（P>0.05）。结论 沉默c-Met基因表达能明显抑制U251细胞的生长活力及其侵袭能力。     

抑制SSRP1对胶质瘤细胞增殖、化疗敏感性的影响

目的 探讨结构特异性识别蛋白1（SSRP1）与胶质瘤预后的相关性,以及抑制SSRP1对胶质瘤细胞增殖及化疗敏感性的影响。方法 应用生信分析方法,检索中国胶质瘤数据库CGGA数据集,分析SSRP1表达与胶质瘤预后相关性。体外培养胶质瘤U251、U87细胞,应用CBL0137抑制SSRP1,应用替莫唑胺（TMZ）检测化疗敏感性。应用CCK8法检测细胞增殖,利用免疫印迹法检测MAPK信号通路（p-38、ERK及JNK）表达。结果 生信分析结果显示,胶质瘤SSRP1呈高表达,随胶质瘤级别增加,SSRP1表达明星上调（P<0.05）;SSRP1高表达胶质瘤总生存期明显缩短（P<0.05）。抑制SSRP1,明显抑制体外培养U251、U87细胞增殖（P<0.05）,增加U251、U87细胞对TMZ化疗敏感性（P<0.05）,对U251、U87细胞p-38、ERK及JNK蛋白表达水平无明显影响,但明显降低U251、U87细胞p-38、ERK及JNK蛋白磷酸化水平（P<0.05）。结论 胶质瘤SSRP1呈高表达,与病人不良预后有关;抑制SSRP1,明显抑制胶质瘤细胞增殖,并增加其对TMZ的化疗敏感性,其机制可能与抑制MAPK信号通路有关。     

NEDD4-1 shRNA对U251胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨NEDD4-1 shRNA对U251胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法构建NEDD4-1 shRNA表达载体。以不同比例质粒和脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜观察细胞存活情况,优化转染效率。转染48 h后采用Western blot、RT-PCR分别检测NEDD4-1蛋白及mRNA的表达,流式细胞术检测细胞周期,MTT法检测细胞增殖,DAPI荧光染色检测细胞凋亡。结果 NEDD4-1 shRNA表达载体构建成功。脂质体与质粒的最佳转染效率比例为2.5μl∶1μg,48 h转染效率在60%～70%。与对照组比较,转染NEDD4-1 shRNA后,U251胶质瘤细胞NEDD4-1的蛋白及mRNA表达水平均下降(均P<0.05),细胞大多停滞在G0-G1期(均P<0.05),增殖率明显降低(均P<0.05),凋亡率显著增加(均P<0.05)。结论 NEDD4-1作为PTEN泛素连接酶,为胶质瘤基因治疗提供靶点。     

质粒介导外源性微小RNA干扰PTTG1表达抑制恶性人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭

目的 观察垂体瘤转化基因1(PTTG1)在恶性人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭中的作用.方法 设计并合成2对靶向PTTG1 mRNA的寡核苷酸片段,将其连接pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体构建表达微小RNA真核载体MIR-1、MIR-2;将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定;脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,同时设转染阴性对照序列的阴性对照组(转染Neg组)和空白组;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)分析PTTG1 mRNA抑制效牢:Western印迹测定PTTG1蛋白的表达量改变:MTT法检测U251细胞增殖的改变:Matrigel侵袭实验检测U251细胞侵袭力的改变.结果 转染后,转染MIR-2组PTTG1 mRNA较空白组和转染Neg组下降为87.6%,PTTG1蛋白表达明显少于其他组:转染MIR-2组U251细胞不同时间点生长抑制率为10.7%～34.7%;Matrigel侵袭实验结果 示MIR-2组穿过人工基底膜U251细胞数减少.相对百分率为12.3%±1.0%,明显低于空白组(24.7%±1.4%)和转染Neg组(24.0%±2.0%),差异有统计学意义(P＜0.05).结论人脑胶质瘤U251细胞的PTTG1表达可被质粒导入的外源性微小RNA有效抑制,进而抑制细胞增殖,逆转恶性胶质瘤U251细胞侵袭、浸润.     

FAK siRNA重组质粒的构建及其对胶质瘤U251细胞 增殖及侵袭能力的抑制作用

目的 探讨应用RNA干扰技术沉默黏着斑激酶（FAK）基因表达对人脑胶质瘤U251细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 将构建成功的FAK siRNA重组质粒转染至U251细胞,合成与FAK基因序列无关的siRNA作为阴性对照,以野生型U251细胞作为空白对照组。运用PCR和免疫印迹法观察FAK mRNA和蛋白表达情况,实时细胞分析仪检测观察细胞增殖情况,Transwell小室侵袭模型研究细胞侵袭能力。结果 重组质粒pBSilence1.1-FAK构建成功;与空白对照组和阴性对照组相比,干扰组细胞增殖减慢（P <0.05）;Transwell小室体外侵袭结果 显示,干扰组穿膜细胞数仅为（17.1±1.0）,明显低于空白对照组（68.2±4.5;P <0.05）和阴性对照组（67.0±2.3;P <0.05）。结论 沉默FAK基因表达可有效抑制人胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。     

过表达TBX2对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨TBX2表达对胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响。方法 采用RT-qPCR和免疫印迹法检测53例胶质瘤组织和瘤旁组织TBX2mRNA和蛋白表达水平。体外培养胶质瘤细胞（U251、U87和SHG-44）和正常星型胶质细胞（HA1800）,采用RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平。构建TBX2过表达或低表达U251细胞株,分别采用WST-1法检测胶质瘤细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 胶质瘤组织TBX2 mRNA和蛋白表达水平明显高于瘤旁组织（P<0.05）,而且,高级别胶质瘤TBX2表达水平显著高于低级别胶质瘤（P<0.05）。相比于人正常星型胶质细胞系HA1800,胶质瘤细胞系U251、U87、SHG-44细胞TBX2 mRNA和蛋白表达水平均明显增高（P<0.05）;而且,U251细胞TBX2表达水平显著高于U87和SHG-44细胞（P<0.05）,因此使用U251细胞进行后续实验。过表达TBX2显著增加U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）,低表达TBX2显著抑制U251细胞增殖和侵袭能力（P<0.05）。结论 胶质瘤TBX2呈高表达,与胶质瘤增殖、侵袭能力有关。     

MSP58基因RNA干涉后对人脑胶质瘤细胞裸鼠移植瘤的影响

目的观察RNA干涉法（RNA interference,RNAi）抑制人脑胶质瘤U251细胞的MSP58基因表达后,对其在裸鼠体内成瘤性及增殖、侵袭性的影响。方法将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3．1．MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251（U251．S）,同时构建相应的阴性对照组U251-NC,以及空载体组U251-H1neo。运用逆转录酶-多聚酶链反应（RT—PCR）及蛋白质印迹法（Westernblot）检测各组细胞的MSP58mRNA和蛋白表达水平。用各组U251细胞建立人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型。结果成功建立了具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞。U251-S细胞MSP58的表达无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均较U251组、U251-H1neo组及U251-NC组细胞显著降低（P〈0．01）。与接种U251、U251-H1neo和U251-NC细胞的裸鼠相比,接种U251-S细胞的裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均明显减小（P〈0．01）。结论MSP58基因RNAi后抑制了移植瘤细胞MSP58mRNA及蛋白的表达,进而明显抑制移植瘤的增殖和侵袭能力。