高尔基体蛋白73单克隆抗体的制备和鉴定

目的探讨高尔基体蛋白73(GP73)鼠源单克隆抗体的制备方法并进行鉴定。方法用GP73重组抗原蛋白免疫5只小鼠获得血清抗体,免疫小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,经过筛选后选择GP73抗体阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养,通过腹水制备获得高特异性和高效价的GP73单克隆抗体(单抗)。结果成功筛选出11株能稳定分泌特异性GP73单抗的杂交瘤细胞株,经多次复苏传代仍能稳定分泌特异性强、效价高的抗体。11株单抗均能结合天然状态下的GP73蛋白,与无关蛋白均无交叉反应,提示有较强的特异性。应用筛选出的配对GP73单抗可检测出浓度为1ng/ml的GP73基因工程表达抗原。结论制备的GP73杂交瘤细胞株分泌的抗体对GP73蛋白具有特异亲和性,并且有较高效价,为GP73蛋白诊断试剂的研制提供了关键技术基础。     

抗蛋白S单克隆抗体的制备

目的 制备抗蛋白S(protein S)单克隆抗体.方法 用微量蛋白S抗原对Balb/c小鼠脾内包埋免疫,取小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合,融合后对杂交瘤细胞进行筛选克隆化培养,建立了10株稳定分泌抗蛋白s单克隆抗体的杂交瘤细胞株.结景对其中的一株2E3进行研究,其分泌的抗体为IgG1亚类.腹水效价1:106阳性,采用饱和硫酸铵盐析法纯化腹水,Western blot测定显示单克隆抗体2E3可特异性地识别分子量为69,000的抗原分子.此杂交瘤细胞株体外传代培养6个月以上,ELISA检测抗体滴度无明显降低.结论脾内包埋法成功制备抗蛋白S单克隆抗体,使蛋白S的临床深入研究和应用成为可能.     

抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选

目的获得稳定、高效分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法以CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞,体内诱生腹水法大量制备单抗。捕获ELISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型,间接ELISA法测定腹水效价;用两步硫酸铵法和G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果成功建立了一株分泌抗CAP单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞4D10。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1,杂交瘤染色体数目90-110条,间接ELISA检测诱生小鼠腹水的抗体效价达1∶2.56×105,纯度达95%,该细胞连续培养生物学性状稳定。结论成功制备的抗氯霉素单克隆抗体4D10效价高、纯度高,为利用该单抗研制检测氯霉素残留试剂盒提供原材料。     

抗ANXA2单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备ANXA2特异性单克隆抗体(McAb),为研究ANXA2的生物学功能和检测该蛋白提供有力的抗体工具。方法用经IPTG诱导表达的基因重组PGEX-4T-1-ANXA2抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法筛选抗ANXA2杂交瘤细胞,用ELISA法鉴定所得单抗腹水的效价及Western blot鉴定McAb特异性。单抗纯化和Eu3+标记后,分别包被聚苯乙烯板及作为铕标单抗,利用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)筛选出检测ANXA2蛋白的最佳配伍单抗。结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了16株可分泌高效价单抗的杂交瘤细胞,间接ELISA显示16株McAb与空载体PGEX-4T-1均未发生交叉反应,抗体特异性良好,16株抗体腹水效价为1∶8 000~1∶256 000,培养上清效价为1∶256~1∶512,纯化的腹水单抗经配对试验,2D6和9H9-Eu3+配对最佳。结论获得16株能稳定分泌高特异性抗ANXA2的杂交瘤细胞,能用于后续研究。     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株,诱发小鼠产生单抗腹水,用(NH4)2SO4盐析纯化腹水,用间接ELISA法测定单抗效价,用Western blotting测定抗体特异性。结果建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株,其中2B6杂交瘤细胞株抗体效价最高,其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价,分别为1∶50 000和1∶10 000。用Western blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量31 000左右位置出现明显的一条染色条带。结论自行制备的抗人SP-A单抗,其具有特异性强、效价高的特点。     

抗猪囊尾蚴KD26抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株建立和特性鉴定

目的: 建立针对猪囊尾蚴KD26抗原的单克隆杂交瘤细胞株,生产相应的单克隆抗体,用于囊虫病免疫保护机制的基础研究和囊虫病临床免疫诊断的应用。方法: 用SDS-PAG E电泳,分离纯化制备猪囊尾蚴KD26抗原免疫6周龄BALB/C小鼠3次,无菌取出脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/O(比率10:1),在50% PEG (4 000MW)作用下进行细胞融合,随后在HT培养液中进行选择性培养、筛选和克隆;常规的中期染色体法分析染色体,单克隆抗体鉴定采用免疫双扩散法测定其免疫球蛋白亚类,采用ELISA法测定单抗效价并作特异性鉴定。结果: 用常规的有限稀释法对杂交瘤细胞进行了3次筛选和克隆化后,获得了1株杂交瘤XH,染色体数为96,能稳定分泌抗猪囊尾蚴KD26单抗,单抗类型为IgG1,抗体滴度为1:1 000,其与血吸虫、弓形虫、细粒棘球绦虫抗原均不发生交叉反应。结论: 应用杂交瘤技术获得了1株能稳定分泌高滴度抗猪囊尾蚴KD26抗原的单克隆抗体细胞株。     

分泌载脂蛋白AII单克隆抗体杂交瘤的建立

以人血清载脂蛋白AⅡ为抗原,免疫BALB/C小鼠,将脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,经HAT选择性培养,特异性筛选及克隆化,获得1-C1、2-C2两株分泌抗人血清载脂蛋白AⅡ单克隆抗体杂交瘤细胞株。免疫双扩散确定它们分泌抗体的亚型均为IgG1;吸收试验及ELISA交叉试验表明单克隆抗体的特异性;ELISA测定其培养上清中抗体效价都为1:100,诱生腹水效价分别为1:10000和1:5000;两株杂交瘤细胞染色体均数分别为96.34±6.06、95.01±5.38;采用Protein A Sepharose 4B层析柱纯化了1-C1杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体。     

抗FLT3受体单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗FLT3受体的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以PET46-FLT3-His-tag表达蛋白作为免疫原免疫BALB／C小鼠,取其脾细胞与SP2／0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可以稳定分泌抗FLT3受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA、Western blot、免疫组化对此抗体特性进行鉴定。结果筛选到两株能稳定分泌抗FLT3受体单克隆抗体的细胞株5F381181和D3H2C12,亚类鉴定两种单抗为IgG1,ELISA法测定两株细胞腹水抗体效价分别为1：409600和1：102400,抗体相对亲和力为7．85×10^6L／mol。Western blot显示抗体能特异识别免疫原。细胞免疫组化显示此单抗可以特异的识别急性髓系白血病病人骨髓中原始细胞表达的FLT3受体。结论成功制备抗FLT3受体单克隆抗体,为进-步研究其与白血病等血液疾病的关系奠定了基础。     

睫状神经营养因子单克隆抗体制备

目的：制备睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)单克隆抗体。方法：将CNTF免疫的BALB/c小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次克隆化培养,获得分泌CNTF单克隆抗体的杂交瘤细胞株;然后进行体内诱生获取含大量CNTF单克隆抗体的腹水和血清;再进行CNTF单克隆抗体鉴定和效价测定。结果：获得5株分泌CNTF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体亚型为IgG2a;腹水和血清中该抗体效价分别为1∶107-1∶108和1∶106;该抗体能特异性地显示SD大鼠脑内表达CNTF的神经元,其中1株单克隆抗体能抑制CNTF促进体外培养新生SD大鼠骨骼肌细胞增殖的功能。结论：制备成功高效且特异的CNTF单克隆抗体,为CNTF结构、功能和机制的研究提供了有效工具。     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白(hLN)的单克隆抗体(McAb)。方法用纯化的人层粘连蛋白(hLN)作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株(2A1、3B5、2C4、4D1),培养上清的ELISA效价分别为:1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为:1×106、1×107、1×106、1×105;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及其病毒蛋白特异性的识别

应用呼吸道合胞病毒(RSV)武汉地方株滴鼻加用病毒感染的Hela细胞免疫Balb/C鼠,取脾细胞与来自实体瘤的SP2/0细胞融合,培育出分泌抗RSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株8株其中3株有中和病毒作用。应用RSV感染Hela细胞作为RSV抗原建立了RSV的免疫转印方法,并应用免疫转印对各单抗的病毒蛋白特异性进行了初步识别:发现1株单抗识别RSV M蛋白,1株识别22 K蛋白,2株识别G蛋白,另外4株单抗的蛋白特异性尚待进一步研究确定。     

抗人SOCS1单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

目的锏备高效价的抗人SOCS1单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以重组GST-SOCS1融合蛋白免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与Sp2／0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA及Westernb1ot鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、Ig亚类及相对亲和力。结果筛选到一株可稳定分泌抗人SOCS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Westernb1ot显示在相对分子量为6．0×10^4处出现特异性反应带。杂交瘤细胞培养上清效价为1：1280,腹水效价为1;102400,Ig亚类为IgG1,相对亲和力达1．17×10^7L／mol。结论成功制备出能特异性识别人SOCS1的单克隆抗体,为进一步研究人体细胞因子信号传导的负反馈调节及SOCS1在微生物感染中的免疫调节作用奠定了基础。     

抗—P^30单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

BALB/c mice were immunized with the purified p30 antigen. SP2/0 myeloma cells and immune spleen cells were fused with 50% PEG (Sigma, MW 3,350-4,000). The cell fusion rate was 93.95%, and the antibody producing rate 21.01%. The technique of limiting dilution was used for cloning of the hybridoma cells. Two hybridoma cell lines E8 and G1 secreting McAb against p30 antigen were obtained. The number of chromosome of both E8 and G1 cell lines was 98.7 +/- 6.54 and 97.7 +/- 7.77, respectively. Results of the PAGE of the ascites generated by the hybridoma cell lines E8 and G1 showed a thick protein band at the gamma-region which was absent from the ascites generated by the SP 2/0 myeloma cells. The immunoglobulin of the McAb E8 and G1 belonged to IgG2 subclass. The results of the immunohistochemical method using the horseradish peroxidase conjugated antibody showed that both E8 and G1 McAb only reacted with epithelial cells of the normal human prostatic glands and their ducts, but did not cross-react with other thirty-four different kinds of normal human tissues. The results of inhibiting ELISA test showed that both E8 and G1 McAb were only inhibited by the human seminal plasma and p30, weakly inhibited by the adult male's urine, but were not inhibited by other eight different kinds of human body fluids and secretions as well as semen from eight different species of animals. It was concluded that McAb of E8 and G1 were organ and species specific.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

抗重组人白细胞介素12单克隆抗体的制备及其生物学特性

以纯化的重组人白细胞介素12（rhIL-12）蛋白为抗原,制备具有生物活性的rhIL-12单克隆抗体（McAb）,并对其特性进行研究鉴定,为肿瘤及免疫相关性疾病的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。方法： 以纯化的rhIL-12p70免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术,用间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及多次克隆化,培养制备杂交瘤细胞系,用clutathione sepharose 4B进行纯化。采用间接ELISA及Western blotting等方法对McAb的Ig亚类（型）腹水效价及特异性进行鉴定。结果：建立了3株持续分泌rhIL-12p70　McAb的杂交瘤细胞株,3株细胞染色体数目均为100条左右,证实为杂交瘤细胞,所分泌的抗体为2株IgG1亚类及1株IgG2a亚类,轻链属k型,小鼠腹水效价测定分别为1∶5.9×106、1∶2.9×10⁷、1∶3.6×10⁷,亲和力依次为EM5>EM6>EV9。结论：成功地制备了3株能稳定分泌抗rhIL-12p70的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高。     

人巨细胞病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

目的制备具有中和人巨细胞病毒(HCMV)感染作用的单克隆抗体并对其进行生物学活性鉴定.方法用HCMV抗原免疫Balb/c小鼠5、6次后,取致敏的脾脏B淋巴细胞和HGPRT-SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,间接ELISA法筛选克隆.挑取分泌抗体的杂交瘤株,再用间接ELISA进行鉴定,最终获得抗HCMV的阳性杂交瘤细胞株,用Ouchterlony法鉴定McAb的亚类.小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞,取腹水经盐析法提纯IgG.Lowry法测定蛋白质浓度,在第6代HF细胞株及原代培养新生乳鼠脑神经细胞上进行微量中和实验.结果获得了4株杂交瘤细胞株,制备的F9McAbs盐析后蛋白质浓度为11.2 g/L,血清学试验证明该McAbs能和HCMV抗原进行特异性结合,制备的IgG具有高度特异性.且体外实验已证实,该McAb具有中和抗体的性质.结论通过杂交瘤技术制备的HCMV单克隆抗体能在体外中和HCMV致病变效应,为该McAb作为抗人巨细胞病毒治疗药物的研发奠定了基础.     

抗hnRNP B1单克隆抗体的制备与鉴定

目的　建立分泌抗不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hn RNP) B1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对分泌的单克隆抗体进行免疫学鉴定。方法　用人工合成的19肽hn RNP B1作为免疫原,采用皮下多点注射及腹腔注射方法免疫BAL B/ c小鼠,取其脾细胞与SP2 / 0小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞采用间接EL ISA法筛选。结果　获得稳定分泌抗hn RNP B1单克隆抗体的杂交瘤细胞2株。EL ISA法检测腹水效价为1∶1.8×10 5,免疫组织化学染色法显示该单克隆抗体特异性强。结论　成功构建hn RNP B1单克隆抗体抗体杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体对肺癌的诊断具有较好的特异性。     

DEN2重组E蛋白单克隆抗体的制备及其生物学活性

[目的]研制登革病毒E蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其各种生物学特性.[方法]用纯化的Pichia pastoris酵母表达的DEN2重组E蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的细胞融合、有限稀释法克隆化杂交瘤细胞,制备稳定分泌McAbs的细胞株.采用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的McAbs,用ELISA、IFA、Western Blot和空斑减数中和实验等鉴定McAbs的各种生物学活性.[结果]用ELISA、IFA检测证实5株杂交瘤细胞产生的McAbs与DEN2重组E蛋白和DEN全病毒均有较高的亲和力;Western Blot分析发现其中3株杂交瘤细胞(3G3,6G11,4E3)分泌的McAbs能与其相对分子质量Mr=(66～69)×103的DEN2重组E蛋白结合.空斑减数中和实验证实所获得的单克隆抗体具有中和登革病毒感染C6/36细胞的作用.[结论]成功地制备了5株抗登革病毒E蛋白特异性的McAbs,为进一步研究E蛋白的结构和功能及临床诊断试剂盒研发打下了基础.     

抗狂犬病疫苗单克隆抗体的制备和初步鉴定

用狂犬病疫苗为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/O融合,经过培养、克隆、ELISA鉴定,筛出3株分泌抗狂犬病疫苗单克隆抗体细胞株。双扩散结果证明:3株细胞均分泌IgG1。     

抗AIB1-C单克隆抗体的制备及初步应用

目的:建立分泌抗AIB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对分泌的单克隆抗体进行特异性鉴定。方法:以纯化GST-AIB1-C蛋白为免疫原,免疫BAL b/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,杂交瘤细胞采用间接ELISA筛选。结果:成功筛选出4株稳定分泌抗AIB1-C单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经Western-blot和免疫细胞化学法鉴定,这些McAb特异性高,亲和力强。结论:成功研制出抗AIB1-C单克隆抗体,为双抗体夹心法ELISA试剂盒的研制奠定基础。