腺病毒介导BMP-2和BMP-6对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的作用研究

目的 研究骨形态发生蛋白(BMP)-2和BMP-6对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的作用.方法 分别用重组腺病毒AdBMP-2、AdBMP-6和AdGFP感染骨肉瘤细胞MG63和U2OS,利用台盼蓝拒染法、TUNEL法、吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)荧光双染法、Transwell小室和碱性磷酸酶(ALP)活性测定法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移以及成骨分化能力的变化.结果 与感染AdGFP的相应骨肉瘤细胞株(对照组)相比,分别感染AdBMP-2和AdBMP-6的两种骨肉瘤细胞株的细胞存活率随时间延长逐渐降低,凋亡率逐渐增加,细胞穿膜数逐渐减少,ALP活性逐渐增加.结论 BMP-2和BMP-6可以抑制人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的增殖和迁移,并诱导它们凋亡和向成骨细胞分化.     

镉对体外培养成骨细胞增殖、凋亡、分化及矿化的影响

目的探讨镉对体外培养成骨细胞（osteoblast,OB）增殖、凋亡、分化及矿化的影响。方法用混合酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养;成骨细胞与不同浓度的Cd2＋作用后,MTT法测定细胞增殖;AO/EB双染法进行凋亡形态学观察;PNPP法检测碱性磷酸酶活性;矿化结节计数和面积测量分析镉对成骨细胞矿化能力的影响。结果各剂量组氯化镉均可抑制成骨细胞增殖,其中2.0μmol/L以上剂量组与对照组相比差异有统计学显著意义（P〈0.01）;16.0μmol/L、32.0μmol/L剂量组OB可见较多凋亡细胞;各时点、各剂量组氯化镉均能抑制ALP活性,尤其是48h以上影响作用更明显（P〈0.01）;0.5μmol/L、1.0μmol/L浓度的氯化镉可明显抑制成骨细胞矿化能力。结论镉离子可以抑制成骨细胞增殖、分化及矿化能力,促进成骨细胞凋亡,对成骨细胞的骨形成能力有明显抑制作用。     

微波诱导鼠成骨肉瘤细胞凋亡的研究

目的:探讨微波诱导鼠成骨肉瘤细胞系UMR106细胞凋亡及其适宜作用剂量、作用时间.方法:以微波不同剂量和时间作用于鼠成骨肉瘤细胞系,采用形态学观察、MTT法、软琼脂集落形成实验、FCM等方法观察微波诱导成骨肉瘤细胞的凋亡.结果:不同剂量的微波照射大鼠成骨肉瘤细胞后细胞形态发生了改变,随照射剂量的增高,细胞逐渐脱离基质;成骨肉瘤细胞在不同剂量的微波进行相同时间(1h)照射下存活率均显著下降,并呈剂量依赖性;微波作用于UMR106细胞的IC50为100W/m2微波辐射下不同时间后,细胞的存活率显著下降,呈时间依赖性;微波辐射下大鼠成骨肉瘤细胞出现G1期阻滞.结论:微波辐射可诱导大鼠成骨肉瘤细胞凋亡,其最佳作用时间和剂量为1h和100W/m2.     

六种染色后光镜观察法检测肝癌细胞凋亡

目的:探讨简便易行的在光镜下通过形态学观察检测细胞凋亡的方法,并对其进行比较。方法:首先用6%的乙醇作用6h诱导人肝细胞癌细胞系HCC-9204细胞凋亡,然后进行未固定细胞的台盼蓝染色、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染色,细胞固定后的Hoechst33258荧光染色、May-Grunwald-Giemsa(MGG)染色和常规HE染色等形态学观察,并进行末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测。结果:用低浓度乙醇诱导细胞凋亡后,大部分肝癌细胞为台盼蓝拒染,TUNEL阳性着色。除了台盼蓝染色法以外,AO/EB、Hoechst33258、MGG和HE等染色法,以及TUNEL检测法均能够不同程度地显示典型的细胞变圆,细胞核深染,染色质边集、呈环状、团块或新月体状,以及细胞浆浓缩和“出泡”现象等细胞凋亡的形态学特征。AO/EB双染色法还能够显示呈致密浓染的黄绿色染色或出现黄绿色碎片的早期凋亡细胞,呈致密浓染的鲜红色染色或出现鲜红色碎片的晚期凋亡细胞,以及呈鲜红色膨大状的坏死细胞。结论:上述六种染色方法均可作为检测细胞凋亡的手段。除了台盼蓝染色以外,其余5种染色方法均可用于观察凋亡细胞的形态学变化。其中,从AO/EB双染色法还可以区分早期凋亡。晚期凋亡和坏死细胞。TUNEL法不仅能够通过检测凋亡细胞的DNA片段化来判别细胞凋亡,还可以从形态学上观察凋亡细胞。     

hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达

目的:研究人骨形态发生蛋白(Human bone morphogenetie protein,hBMP)9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达,为下一步研究hBMP9对骨肉瘤的体内外作用奠定实验基础.方法:利用免疫细胞化学法和Western blot法检测hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中的内源性表达.结果:在MG63、U2OS和143B中,hBMP9均呈不同程度的阳性表达,并且两种检测方法所得结果一致.结论:hBMP9在人骨肉瘤细胞株MG63、U2OS和143B中均有内源性表达.     

乙醇诱导肝癌细胞凋亡的形态学观察

目的：探讨在乙醇诱导下发生凋亡时,原发性肝细胞癌（简称肝癌）细胞的形态学变化。方法：用含60mL.L^-1乙醇的培养液持续作用6h诱导人肝癌细胞系HCC－9204凋亡,进行凋亡活细胞的台盼蓝,吖啶橙／溴化乙啶（AO／EB）染色,凋亡细胞固定后的May-Grunwald-Giemsa (MGG),HE染色和透和透射电镜观察,并进行TUNEL法凋亡检测。结果：60mL.L^-1乙醇可使HCC－9204细胞产生明显的细胞固缩,变圆,胞核和胞质浓染,胞核呈颗粒状,环形或新月体状,胞质可见“出泡”现象等凋亡形态学变化,大部分细胞为台盼蓝拒染,并呈TUNEL阳性着色,部分TUNEL阳性细胞也可见明显的凋亡形态学变化。结论：乙醇可使肝癌细胞产生明显的凋亡形态学变化。TUNEL法可原位同时显示凋亡细胞的形态和分布。     

氯硝柳胺联合顺铂抑制肾上腺皮质癌的实验研究

目的 研究氯硝柳胺和低剂量顺铂联合应用对人肾上腺皮质癌SW-13 细胞株增殖、凋亡,以及 迁移力、侵袭力的影响,并探讨其作用机制。方法 体外培养SW-13 细胞,CCK-8 法检测氯硝柳胺和不同 浓度顺铂对细胞增殖的影响。设对照组、氯硝柳胺组、顺铂组、联合用药组,分别用Annexin V/PI 和吖啶 橙/ 溴化乙锭（AO/EB）染色检测细胞凋亡率的变化,Transwell 实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭、迁移 能力的变化,Western blot 检测B 细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、波 形蛋白（Vimnetin）、E- 钙黏蛋白（E-cadherin）表达的变化。结果 氯硝柳胺增强顺铂对SW-13 细胞增 殖的抑制作用。Annexin V/PI 和AO/EB 染色结果表明,与联合用药组比较,氯硝柳胺、顺铂促进细胞凋亡 （P <0.05）。Transwell 和划痕实验结果表明,与联合用药组比较,氯硝柳胺、顺铂降低SW-13 细胞的侵袭能 力（P <0.05）。Western blot 检测结果表明,与联合用药组比较,氯硝柳胺、顺铂抑制Bcl-2、Vimentin 的表达, 促进Caspase-3、E-cadherin 的表达（P <0.05）。结论 氯硝柳胺能够增强低剂量顺铂对SW-13 细胞增殖的 抑制作用,促进细胞凋亡,抑制侵袭及迁移能力,可能与其抑制Bcl-2、Caspase-3、E-cadherin、Vimentin 的 表达有关。     

重组腺病毒介导P21WAF1/CIP1诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的体外实验研究

目的：研究基因转移P21^WAF1/CIP1过量表达对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法：构建缺陷型重组腺病毒载体：在CMV启动子控制下的p21 cDNA(Ad-P21)，其编码人P21蛋白。通过流式细胞仪，RT－PCR进行P21表达检测；应用TUNEL法，荧光显微镜和流式细胞仪进行相关凋亡检测，分析。结果：RT－PCR检测5株亲本胶质瘤细胞表达p21 cDNA，而流式细胞仪未检测到P21表达；Ad-P21转染的胶质瘤细胞株均过量表达P21；在体外通过细胞形态学，分子生物学检测均证实Ad-P21能诱导胶质瘤2细胞向终末分化并诱导细胞凋亡。结论：基因转移P21^WAF1/CIP1为研究基因治疗恶性脑胶质瘤提供了有效的手段。     

柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02细胞增殖和凋亡的初步观察

目的:探讨柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine,SASP)对正常肝细胞和肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖和凋亡的影响.方法:以正常人肝细胞株(L02细胞)和大鼠肝星状细胞株(HSC-T6细胞)为研究靶细胞,用CCK-8比色法检测细胞增殖;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染检测HSC-T6细胞凋亡率;AO/EB染色法观察细胞凋亡形态.结果:同对照组比较,一定浓度范围的SASP对HSC的增殖具有显著的抑制作用,呈现时间和剂量效应.膜联蛋白(Annexin V)/碘化丙啶(PI)双染显示SASP诱导HSC-T6凋亡也旱现时间和剂量效应;AO/EB染色出现凋亡细胞的特征性改变.而SASP干预L02后,与对照组相比,增殖和凋亡率均无统计学意义,AO/EB染色后,未出现凋亡细胞.结论:同等干预浓度的SASP能够选择性的抑制HSC增殖,诱导其凋亡.     

巯基乙酸-碲化镉量子点对人肝细胞毒性和DNA损伤的诱导作用

目的：研究巯基乙酸（TGA）包覆的碲化镉(CdTe)量子点（QDs）对人正常肝HL-7702细胞的毒性和DNA损伤的作用,为QDs毒理学研究和安全性评价提供实验依据。方法：实验设立对照组和不同浓度CdTe QDs作用组（浓度分别为6.25、12.50、25.00和50.00 mg/L）。CdTe QDs作用于HL-7702细胞后,分别采用MTT法检测细胞增殖变化,单细胞凝胶电泳法（SCGE）检测细胞DNA损伤情况,PI单染流式细胞术（FCM）检测细胞周期变化,AO/EB双荧光染色法和Annexin Ⅴ- FITC/PI双染FCM检测细胞凋亡情况。结果：MTT法,CdTe QDs可抑制HL-7702细胞增殖,并存在剂量-效应和时间-效应关系;SCGE和PI单染FCM法,CdTe QDs作用于HL-7702细胞24 h后,随着剂量的增加,DNA损伤率逐渐增高,G0/G1期细胞百分率显著下降,S期和G2/M期细胞百分率明显上升（P<0.05）;AO/EB检测,CdTe QDs作用后细胞出现凋亡形态学改变;Annexin Ⅴ-FITC/PI双荧光标记FCM法,CdTe QDs染毒可促进细胞凋亡,各剂量组细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：CdTe QDs可影响细胞存活,引起DNA损伤、细胞周期阻滞,并诱导细胞凋亡。     

促红细胞生成素对新生猪胰岛细胞 增殖分化和凋亡的影响

［摘要］目的：研究促红细胞生成素在体外对新生猪胰岛细胞增殖分化和凋亡的影响。方法：采用胶原酶消化和组织培养方法分离纯化新生猪胰岛细胞,检测其纯度和活性,再分为实验组和对照组。实验组培养基中添加促红细胞生成素（10.0 μmol/L）,对照组不添加促红细胞生成素,培养5 d后行低糖和高糖刺激胰岛素释放试验;并行细胞计数及MTT比色法测细胞增殖活性;流式细胞仪和EB/AO染色荧光检测细胞凋亡百分率,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR法检测胰岛细胞胰岛素促进因子-1(PDX-1),葡萄糖转运载体2（GlUT-2）,bcl-2,bax,caspase-3 mRNA的表达。结果：促红细胞生成素干预后新生猪胰岛细胞不改变形态和功能,对葡萄糖刺激胰岛素分泌的反应正常;细胞计数示实验组新生猪胰岛细胞数目均比对照组增多（P＜0.05）;随着培养时间延长,实验组和对照组吸光度值均呈上升趋势,且实验组的吸光度值均高于对照组（P＜0.05）,实验组PDX-1 mRNA表达稍有上调（P＜0.05）,而GlUT-2 mRNA表达无明显差别（P=0.34）。流式细胞仪和EB/AO染色荧光检测实验组的凋亡百分率均较对照组降低（P＜0.01）。RT-PCR示实验组bcl-2 mRNA较对照组上调,而bax和 caspase-3 mRNA明显下调（P＜0.01）。结论：促红细胞生成素在体外能促进新生猪胰岛细胞的增殖分化,对形态和功能无影响。促红细胞生成素对新生猪胰岛细胞有抗凋亡保护作用,可能是通过上调bcl-2 mRNA的表达,下调bax, caspase-3 mRNA的表达来实现的。     

蜕皮甾酮对H2O2诱导的PC12细胞毒的保护作用

目的观察蜕皮甾酮(ecdysterone,ECR)对H2O2作用不同时间诱导PC12毒的保护作用。方法通过MTT(3-4,5-d im ethylth iazolyl-2,5-d iphenyltetrazolium brom ide,MTT)法检测H2O2对PC12的毒性及ECR的保护作用。PC12细胞的形态学改变通过荧光显微镜观察(acrid ine orange/eth id ium brom ide染色,AO/EB),完整无损的PC12细胞呈绿色,受损或死亡细胞呈橘黄色和红色。结果1、25、50和100μmol.L-1ECR与PC12细胞分别作用6h,12hand 24h时,PC12细胞的MTT吸光值无明显改变;50、100、200μmol.L-1H2O2分别与PC12作用6h,12h,24h时,PC12细胞的MTT吸光值明显降低(P<0.05,P<0.01 andP<0.01);如果用不同浓度的ECR(1、25、50 and100μmol.L-1)预处理PC12细胞0.5 h后,再加入H2O2(100μmol.L-1)并分别作用6h,12h,24h,则PC12细胞的MTT吸光值相对增加(P<0.05 at 50μmol.L-1,P<0.01 at 100μmol.L-1)。AO/EB染色后荧光显微镜下观察,ECR对H2O2引起的PC12细胞损伤有保护作用。结论ECR能够相对增加PC12细胞的存活率,对H2O2的PC12细胞毒性有保护作用。     

二氮嗪、环孢菌素A拮抗Aβ1 42致胆碱能神经元凋亡的研究

目的研究ATP敏感性钾离子通道开放剂二氮嗪、环孢菌素A及两者协同对β 淀粉样蛋白（Aβ1 42）致原代培养基底前脑胆碱能神经元凋亡的影响。方法采用2?μmol/L的Aβ1 42对原代培养大鼠胆碱能神经元进行干预,建立阿尔茨海默病（AD）细胞凋亡模型;采用500?μmol/L二氮嗪(预处理1?h)、20?μmol/L环孢菌素A以及两者协同对其干预,作用不同时间（24、72?h）后置于倒置显微镜下观察细胞形态;采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞存活率,Wes tern blot法检测细胞内凋亡相关蛋白表达水平的变化。结果① Aβ1 42作用胆碱能神经元72?h后,Bcl 2表达量降低（P＜0.01）,细胞色素C、Caspase 3、Cleaved caspase 3的表达量增加（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.01）,Bax未见明显变化,Bcl 2/Bax比值降低（P＜0.01）,细胞形态发生明显损伤性变化,细胞存活率明显降低（P＜0.001）;② 二氮嗪、环孢菌素A以及两者协同作用24?h后Bcl 2的表达增加（P＜0.05, P＜0.01,P＜0.01）,作用72h能明显增加Bcl 2的表达(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01),并提升Bc 2/Bax比率而抑制细胞色素C、Caspase 3、Cleaved caspase 3表达量(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001),细胞存活率均增高(P＜0.01,P＜0.001)。结论Aβ1 42作用胆碱能神经元72?h能促使细胞凋亡,二氮嗪与环孢菌素A及两者协同可以明显拮抗Aβ1 42致细胞凋亡作用。     

p38MAPK信号通路抑制剂对NMDA诱导的体外培养的皮层神经元损伤的保护作用及机制

目的 观察MK801及SB203580对N-甲基-D-天（门）冬氨酸（NMDA）诱导的皮层神经元损伤的影响, 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK)信号通路在神经元损伤中的作用和机制。方法 培养7d的新生SD大鼠皮层神经元随机分为对照组、NMDA损伤组、MK801干预组、SB203580干预组、联合干预组（SB203580+MK801）。MTT比色实验评价细胞生存力,乳酸脱氢酶(LDH)释放率测定细胞损伤程度,吖啶橙/溴化乙锭 (AO/EB) 双重荧光染色观察细胞凋亡形态和数目,Western blotting检测大鼠皮层神经元各组p38MAPK、BCL-2和BAX表达情况。结果 与对照组比较,NMDA损伤组神经细胞存活力降低、培养上清液中LDH含量增加、凋亡细胞增多、p38MAPK和BAX表达增加(P均＜0.01),BCL-2表达降低(P＜0.05);与NMDA损伤组比较,各个干预组细胞生存力提高、LDH释放率降低、凋亡减少、p38MAPK及BAX的表达减少、BCL-2表达增多(P均＜0.01)。结论 MK801,SB203580对NMDA诱导的皮质神经元损伤具有保护作用,p38MAPK通路可能参与介导MK801的保护作用,其共同机制是通过抑制p38MAPK信号通路介导的凋亡相关蛋白实现的。     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞 凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki 4组细胞24和48 h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加(P＜0.05)。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达(P＜0.01),而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P 3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变(P＞0.05)。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24 h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48 h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞(P＜0.05),且两组细胞48 h的HPV16E6 mRNA表达均较24 h显著增高(P＜0.05);在24和48 h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少(P＜0.01);但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6 mRNA表达量无统计学差异(P＞0.05)。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型(p53mt/p53wt )无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的研究TRAIL对胃癌细胞株MKN28细胞体外诱导凋亡的作用及机制,并研究此过程中Caspase-3的表达规律及与凋亡效应的相关性。方法培养细胞,MTT法分析细胞增殖抑制率及细胞存活率,流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期,细胞免疫组化检测细胞Caspase-3的表达水平,AO/EB染色观察凋亡细胞。结果 TRAIL可明显抑制MKN28细胞的增殖,并可诱导细胞的凋亡。细胞阻滞于G0/G1期,Caspase-3在MKN28细胞中低表达,经TRAIL处理细胞后高表达。AO/EB染色后可见典型细胞凋亡特征。结论 TRAIL可诱导MKN28细胞株的凋亡,并呈剂量依赖性。TRAIL通过上调Caspase-3的表达,阻滞细胞周期,诱导MKN28细胞的凋亡。     

紫外线对晶状体上皮细胞凋亡、水含量及SOD活性的影响

目的 :探讨紫外线对体外培养的晶状体上皮细胞凋亡作用以及对晶状体水含量和超氧化物歧化酶 (superoxidedismutase,SOD)活性的影响 .方法 :紫外线诱导离体牛晶状体白内障形成 ,以TUNEL技术检测紫外线照射后培养 3,6 ,12 ,2 4h的晶状体上皮凋亡细胞 ,并测定晶状体水含量和SOD活性 .结果 :TUNEL法显示 ,照射组晶状体上皮细胞经紫外线照射后培养 6h出现凋亡细胞 ,对照组晶状体上皮细胞中无明显的凋亡细胞 ;照射组 12h后水含量明显升高 (P <0 .0 1)及SOD活性明显降低 (P <0 .0 1) .对照组水含量和SOD活性无明显变化 .结论 :紫外线诱导晶状体上皮细胞发生凋亡 ,并使晶状体水含量和SOD活性发生改变 ,紫外线诱导的晶状体上皮细胞凋亡是白内障形成的早期机制之一