人角膜缘干细胞初步建系研究

目的：探讨建立人角膜缘干细胞系，为组织工程研究提供足够的细胞储备。方法：取健康人角膜缘深部色素区组织块，经消化后，在含有RPMI—1640、20％胎牛血清的培养瓶和以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中分别进行体外培养，并对连续传代的细胞行光镜、扫描电镜观察，比较细胞形态的变化并进行细胞计数与冻存处理。结果：人角膜缘干细胞具有人上皮细胞培养的特性，在培养液中传33代后，细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力，并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长；目前我们冻存细胞的复苏率为82．2％。结论：将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系。     

兔角膜缘上皮细胞培养联合羊膜行自体移植的实验研究

目的：用体外培养的角膜缘上皮细胞联合人羊膜的方法，行自体移植治疗角膜缘干细胞完全缺乏的兔眼。方法：制作10只兔右眼于细胞缺乏的模型，取其中7只兔的左眼上方角膜缘取一小块组织进行体外培养，并传代在无上皮细胞的人羊膜上。1个月后，手术切除10只兔受伤眼角膜表面被覆的新生血管膜和结膜上皮，7眼接受了含自体培养上皮细胞的羊膜移植，另3眼仅移植无上皮细胞的羊膜。结果：1周后原代培养的角膜缘上皮细胞融合，传代至无上皮细胞的人羊膜上继续生长2～3周，角膜上皮细胞可牢固的附着于羊膜上。移植了含有角膜上皮细胞的羊膜的兔子，术后早期都形成了角膜上皮化，并明显抑制了新生血管的再生，而接受羊膜移植的兔子，术后又出现明显的新生血管。结论：利用无上皮细胞的羊膜作为载体，培养角膜缘上皮细胞并自体移植可以恢复角膜上皮化、抑制新生血管生长。     

兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究

 【目的】观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。【方法】24只新西兰兔随机分为2组。实验组：培养有人MSCs的羊膜移植组，将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔眼表结膜缺损区；对照组，单纯羊膜移植组。分别于移植后1，2，3，4，6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3／12（CK3／CKl2）和角蛋白13（CK13）的表达。【结果】MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区，术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。【结论】人羊膜可作为MSCs的载体，采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植，MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖。     

EGF,bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响

目的探讨EGF,bFGF及二者共同作用对培养的兔角膜缘干细胞增殖的影响。方法用DMEM和F12(1:1)培养基,20%胎牛血清,加入不同浓度EGF,bFGF和二者的混合液,采用MTT法检测细胞的OD值。结果EGF的5~160ng/mL各浓度组增殖效应均明显大于对照组(P<0.05),10ng/mL组明显大于其它各浓度组(P<0.01),bFGF各浓度组从5~80ng/mL各组均明显大于对照组(P<0.025),20ng/mL各组明显大于与其它各组(P<0.025);EGF与bFGF混合液各浓度组从5~80ng/mL各组增殖效应均明显大于对照组及单独使用EGF或bFGF组(P<0.05),EGF10ng/mL+bFGF20ng/mL组促增殖效果最强(P<0.025)。结论EGF,bFGF对培养的兔角膜缘干细胞有促增殖作用,此作用均呈剂量依赖性,EGF和bFGF共同表现为明显的促增殖作用。     

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块 细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。     

Characterization and safety assessment of bioengineered limbal epithelium

Transplantation of cultivated limbal epithelium on substrates such as amniotic membrane is an established treatment for severe ocular surface disease with limbal stem cell deficiency. In this study, we adapted an established method to generate sheets of limbal epithelium on amniotic membrane and characterized the cells contained in these sheets and tested them for safety with regard to microbial contamination. Human limbal biopsies were cultivated on denuded amniotic membranes. After three weeks of culture, the phenotypes of cultivated cells were analyzed by immunohistochemistry and real-time RT-PCR for the expression of a panel of specific markers. Cultivated limbal epithelial cell sheets were also analyzed by scanning (SEM) and transmission (TEM) electron microscopy. Sterility tests and mycoplasma assays were conducted for the safety of product. A confluent layer of polygonal cells was formed in 2 weeks and 1-3 stratified layer of cells were observed after three weeks of culture. Cultivated cells were positive for p63, K3, K19, and involucrin but negative for K14, integrin alpha9 and ABCG2 when analyzed by immunohistochemistry. Expression of molecular markers was detectable with real-time RT-PCR. SEM showed multilayer of flat squamous polygonal epithelial cells. Desmosomal and hemidesmosomal attachments were evident. Our study showed that cultivated limbal epithelium consists of limbal progenitors as well as differentiated corneal epithelial cells. SEM and TEM analysis showed cultivated cells demonstrated typical features of corneal epithelium. The risk of contamination is low and can be prevented by culturing the cells in a clean room facility complying to Good Manufacturing Practice standard.     

自体角膜缘干细胞联合羊膜移植治疗翼状胬肉

目的：回顾性分析在我院接受的翼状胬肉64例患者,探讨角膜缘干细胞移植联合羊膜移植治疗翼状胬肉的效果。方法：46例翼状胬肉患者接受了翼状胬肉切除加角膜缘干细胞联合羊膜移植。18例接受了翼状胬肉切除加丝裂霉素治疗。结果：接受翼状胬肉切除加角膜缘干细胞联合羊膜移植的46例患者中,术后2例翼状胬肉复发;18例接受翼状胬肉切除加丝裂霉素治疗的患者中有4例复发。结论：接受翼状胬肉切除加角膜缘干细胞联合羊膜移植后复发率低,术后刺激症状较轻,是治疗翼状胬肉的理想方法。     

不同部位自体角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉的临床对比研究

目的 观察翼状胬肉切除联合自体不同部位角膜缘干细胞移植治疗原发性翼状胬肉的疗效.方法 将原发性翼状胬肉患者51例（62眼）随机分成A、B两组.A组行胬肉切除联合自体上方角膜缘干细胞移植辅助丝裂霉素C治疗.B组行胬肉切除联合自体下方角膜缘干细胞移植辅助丝裂霉素C治疗.观察比较两组患者术眼不适症状持续时间、角膜上皮愈合时间以及翼状胬肉复发情况.结果 两组术后不适症状持续时间差异有统计学意义（P〈0.05）,角膜上皮愈合时间差异无统计学意义（P〉0.05）,翼状胬肉复发率差异无统计学意义（P〉0.05）.结论 下方角膜缘干细胞移植治疗原发性翼状胬肉可取得与上方角膜缘干细胞移植相同的效果,且术后异物感持续时间较短.     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

手术切除联合角膜缘干细胞移植、羊膜移植及单纯手术切除治疗翼状胬肉临床疗效分析

目的 探讨手术切除联合角膜缘干细胞移植、羊膜移植及单纯手术切除治疗翼状胬肉的临床疗效.方法 选择本院2008年3月至2010年5月收治的角膜缘翼状胬肉患者90例,随机分为三组,角膜移植组给予手术切除联合角膜缘干细胞移植,羊膜移植组给予手术切除胬肉联合羊膜移植治疗,单纯手术组仅给予翼状胬肉手术切除；观察三组治疗效果.结果 三组术后随访两年,角膜移植组、单纯手术组术后创面愈合时间短于羊膜移植组,差异有统计学意义(P＜0.05),角膜移植组创面愈合时间与单纯手术组差异无统计学意义(P＞0.05)；角膜移植组术后治愈28例,复发2例,羊膜移植组术后治愈25例,复发5例,单纯手术组术后治愈22例,复发8例,三组术后复发率比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 手术切除联合角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉,术后复发率低,并发症少,愈合时间短,值得应用.     

EFFECT OF HUMAN AMNIOTIC MEMBRANE ON CORNEAL EPITHELIUM AND YAC-1 CELL

Objective To study the effect of the amniotic membrane on enhancing the proliferation ofcorneal epithelia and YAC-1 cell. Methods After the primary culture of the rabbit's corneal epithelia and YAC-1 cells, they were seeded on the upper surface or stromal matrix side of amniotic membrane respectively. The proliferation results were observed by MTT test. Results The amniotic membrane was found significantly enhancing the proliferation of corneal epithelia on the d1 ,d3 , and d5 after culture. The proliferation rate was 28.93% ,23.32% ,23.41 % (P<0 .05) respectively, but the d7 proliferation rate was 20.72% (P> 0.05). On the dl , d3 , d7 after culture , the YAC-1 cells proliferation rate was 34 .87% ,36 .28% ,33 .86% (P< 0.01) respectively. Conclusion Our results demonstrated that the amniotic membrane could enhance the proliferation of both corneal epithelia and YAC-1 cells significantly. Although amniotic membrane has been suggested as an ideal material for reconstruction of ocular surface, special atte     

角膜缘上皮细胞与脱细胞角膜材料移植修复碱烧伤角膜的实验研究

目的 探讨应用角膜缘上皮细胞(limbal epithelial cells,LECs)及脱细胞角膜材料(decellularized porcine cornea,DPC)移植修复碱烧伤兔角膜的疗效.方法 培养同种异体兔LECs,鉴定其中的角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),制备DPC作为支架材料,将LECs和DPC两者复合培养后板层移植到碱烧伤的兔眼角膜,观察移植后4个月内的角膜修复情况.结果 免疫细胞化学及RT-PCR检测培养的LECs中有表达ABCG2的LSCs.大体观察LECs-DPC移植后碱烧伤角膜的混浊度减轻,新生血管消退.HE、Masson Trichrome染色显示移植后上皮面的细胞复层化生长,炎性细胞浸润减少,DPC纤维整合于碱烧伤的角膜植床,角膜胶原排列趋于规则.透射电镜检查有桥粒及微绒毛结构形成.结论 体外培养的同种异体角膜缘上皮细胞联合脱细胞角膜材料移植能够修复碱烧伤的兔眼角膜.     

不同手术方式治疗翼状胬肉对角膜屈光状态的影响

目的探讨翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植和翼状胬肉切除联合羊膜移植对角膜屈光状态的影响。方法将86例(86眼)翼状胬肉患者随机分为两组,每组43例,A组采用翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植治疗,B组采用切除联合羊膜移植治疗,比较两组患者手术前后裸眼视力、角膜曲率和角膜散光度。结果两组患者术后裸眼视力、角膜曲率较术前提高(P<0.05),角膜散光度较术前减低(P<0.05),三项指标组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植和联合羊膜移植均为治疗翼状胬肉的有效的手术方法,临床可根据具体情况选择应用。     

羊膜上皮细胞促进共培养神经干细胞存活及分化

目的：探讨羊膜上皮细胞是否能在体外促进胚胎脑神经干细胞的存活及分化。 方法：Neurosphere法分离、克隆E12~14 d Wistar大鼠脑组织的神经干细胞,同时从羊膜中分离羊膜上皮细胞。将神经干细胞与羊膜上皮细胞在不同条件下共培养,通过免疫组织化学法对羊膜上皮细胞及神经干细胞的分化进行检测。 结果：羊膜上皮细胞表达神经干细胞及神经元、神经胶质细胞表面抗原;与羊膜上皮细胞共培养的神经干细胞克隆的分化细胞总数、分化为神经元的百分率及神经元初级突起长度明显高于对照组。 结论：羊膜上皮细胞与神经干细胞具有一定的同源性;羊膜上皮细胞能促进体外培养的神经干细胞的分化,且主要向神经元分化,并促进神经元初级突起的生长。提示羊膜上皮细胞为神经干细胞提供促进其分化及存活适宜的微环境。     

角膜缘干细胞移植后供体干细胞的检测与分析

目的观察新西兰兔角膜缘干细胞移植后供体干细胞数量的变化与角膜上皮化的关系,为角膜缘干细胞移植手术效果提供理论依据.方法新西兰兔30只,分为自体移植和异体移植两组,建立角膜缘干细胞缺损动物模型,分别进行自体和异体角膜缘干细胞移植.术后1周、1月、3月空气栓塞各处死5只,取包括角膜缘的角膜标本,免疫组织化学p63蛋白抗体检测供体干细胞的存活数量和增殖分化状况,比较两组的移植效果.结果自体移植术后1周,供体干细胞仍然局限于受体角膜缘;1个月后,上皮细胞覆盖角膜全层,但是层次非常少;3个月后,干细胞的储备数量基本上恢复到正常水平,角膜完全上皮化.异体移植1周,干细胞的数量有一定的减少;1个月后,角膜缘干细胞储备数量明显减少;3个月后,角膜缘已经检测不到干细胞.结论干细胞的储备数量和增殖分化状况直接影响到角膜上皮化的结局;有效的干细胞检测结果可以为临床角膜缘干细胞移植效果提供依据,p63蛋白抗体可以作为一个检测角膜缘干细胞的特异指标.     

三步切除法联合羊膜移植与角膜缘干细胞移行遮盖治疗复发性翼状胬肉

目的探讨显微镜下三步法切除复发性翼状胬肉联合角膜缘干细胞移植术与切除＋羊膜移植术＋角膜缘干细胞移行遮盖法治疗复发性翼状胬肉手术效果及影响因素。方法将2006年1月至2009年6月就诊的112例（136眼）复发性翼状胬肉患者分为A、B两组。A组为三步法切除加角膜缘干细胞移植组58例70眼;B组为切除加羊膜移植加角膜缘干细胞移行遮盖组54例66眼。结果 A组：平均随访（14.6±2.4）月,痊愈54眼,复发16眼,复发率为22.86%;16只眼（66.7%）睑球粘连获得解除,眼球运动障碍消失;8只眼（33.3%）改善。B组：平均随访（15.4±1.4）月,痊愈64眼,复发2眼,复发率为3.03%;随访期间术前有睑球粘连、眼球运动障碍的22只眼中16眼（73.68%）睑球粘连获得解除,眼球运动障碍消失;6只眼（26.32%）改善。两组复发率比较差异有统计学意义﹙χ2=11.73,P〈0.05﹚。结论三步法切除联合羊膜移植术与角膜缘干细胞移行遮盖法治疗复发性翼状胬肉可降低复发率,减少并发症。     

角膜内皮层培养及后板层移植的实验研究

目的探讨体外构建角膜内皮层并进行移植的可能性。方法体外培养的兔角膜内皮细胞种植于羊膜基底膜上,形成单层角膜内皮层,并进行形态学、组织学及超微结构的观察。将构建的角膜内皮层对切除后板层的兔角膜进行移植,同时以无培养内皮细胞的羊膜移植作为对照,术后观察角膜透明度及厚度,对内皮层进行形态学和组织学观察。结果角膜内皮细胞在羊膜上生长呈单层,细胞为多角形,排列紧密,其形态及结构与正常兔角膜内皮组织相似。培养内皮层移植后,角膜维持相对透明及薄度;而对照眼角膜严重水肿、混浊,厚度明显大于实验眼角膜(P<0.01)。培养内皮移植后具正常内皮层的结构和功能。结论羊膜是培养角膜内皮细胞移植的良好载体,培养角膜内皮移植有望治疗角膜内皮失偿疾病。     

角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉疗效的初步观察

目的观察胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉的疗效,探讨降低翼状胬肉术后复发率的方法.方法选择翼状胬肉患者共24例28眼,按原发性胬肉和复发性胬肉分为两组,行胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植术.观察术后效果.结果角膜上皮修复时间为(3.1±0.3)d,原发性胬肉组与复发性胬肉组分别为(3.1±0.2) d和(3.3±0.5) d,P＞0.05,总复发率为3.57%,原发性胬肉组0眼复发,复发性胬肉组1眼复发,P＞0.05.22眼(78.6%)术后视力较术前有不同程度的提高,原发性胬肉组与复发性胬肉组视力提高分别为20眼和2眼,P＜0.01.结论胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术是一种治疗翼状胬肉较好的方法.     

自体角膜缘移植治疗兔单眼碱烧伤的实验研究

目的探讨角膜碱烧伤后行自体角膜缘移植术的疗效,并评估其对健康眼的影响。方法在32只兔右眼上制作碱烧伤模型,烧伤1周后行自体角膜缘移植,作1/4、1/2、3/4周和全周范围移植者各8只,术后4周观察疗效。结果作全周自体角膜缘移植的8只兔患眼全部恢复正常眼表,作3/4、1/2、1/4周移植的患眼分别有87.5%(7/8)、37.5%(3/8)和0.00%恢复正常眼表;而作全周切取角膜缘的8只供眼均未恢复正常眼表(100%),角膜糜烂,有新生血管和假性胬肉长入,而切取3/4、1/2周角膜缘的供眼分别有75%(6/8)和12.5%(1/8)未恢复正常,切取1/4周角膜缘的供眼均恢复正常。结论行自体角膜缘移植可有效地治疗眼碱性烧伤,可作临床推广,但要注意供体眼取材范围不宜超过1/2范围,以免损伤健康眼。