基于EpCAM核酸适配体分子信标的构建及其对胃癌细胞的靶向成像研究

目的 设计并构建靶向上皮细胞黏附分子(EpCAM)的核酸适配体分子信标MAB-SYL3L用于胃癌细胞的靶向识别/成像。方法 根据分子信标探针的设计原则,将靶向EpCAM的核酸适配体SYL3进行适当的截短,构建核酸适配体分子信标MAB-SYL3L。采用流式细胞术对MAB-SYL3L的特异性和亲和性进行分析,并观察不同温度下MAB-SYL3L的结合能力;采用流式细胞术和荧光显微镜对MAB-SYL3L与SGC-7901细胞一步法靶向识别/成像进行分析。结果 构建的MAB-SYL3L与SGC-7901细胞的结合具有高亲和性和高特异性,解离常数为(47.0±3.8)nmol/L。MAB-SYL3L与SGC-7901细胞的结合不受温度的影响,不需洗涤过程便能一步法实现SGC-7901细胞的靶向识别/成像。结论 成功构建出基于EpCAM的核酸适配体分子信标MAB-SYL3L,建立了一种快速、便捷的胃癌细胞靶向识别/成像方法。     

适配体靶向肿瘤的纳米递送系统的研究进展

核酸适配体是一类能特异性地靶向特定抗原的单链寡聚核苷酸。较之常用的抗体等靶头向性配体,适配体体积相对较小、免疫原性较低且易于体外筛选。目前,以适配体靶向肿瘤的纳米递送系统通常有3类：第1类将适配体修饰于脂质体、纳米粒、胶束等纳米载体上,形成适配体靶向的纳米载体;第2类直接将适配体与药物/荧光物质相连,形成适配体-药物/荧光物质共轭物;第3类将适配体自身作为药物的靶向载体。本文就近期以适配体靶向肿瘤的纳米递送系统的研究进展进行概述。     

基于核酸适配体技术对清开灵注射液中胆酸的研究

目的利用免疫磁珠分离技术和核酸适配体相结合的方法剔除清开灵注射液中胆酸小分子,借此研究胆酸在清开灵注射液对细胞脱颗粒中的作用。方法将标记有生物素的胆酸的核酸适配体与表面有链霉亲和素包被的磁珠偶联,然后将偶联物与清开灵注射液进行孵育,使胆酸与核酸适配体特异结合,最后利用磁性分离将清开灵注射液中的胆酸剔除。对胆酸剔除前后的清开灵注射液进行细胞脱颗粒实验,以研究其类过敏反应的性质。结果磁珠与适配体的偶联反应具有浓度依懒性。适配体剔除清开灵注射液中的胆酸也具有浓度依懒性。剔除部分胆酸后的清开灵注射液对细胞的脱颗粒作用,与清开灵注射液相比,有显著下降。结论利用胆酸的核酸适配体与免疫磁珠分离技术能够剔除清开灵注射液中的胆酸,为研究小分子物质在中药注射液中的作用提供了新的研究方法。     

TLS9a核酸适配体对小鼠肝癌细胞的靶向作用研究

目的 探讨TLS9a核酸适配体对小鼠肝癌细胞的靶向作用.方法 制备马来酰亚胺修饰的装载阿霉素的脂质体(liposome),合成FITC荧光及巯基修饰的TLS9a核酸适配体,并将其耦联到脂质体表面.紫外分光光度法检测阿霉素包封率.动态光散射法(DLS)测纳米粒子粒径大小及电位分布,倒置荧光显微镜观察小鼠肝癌细胞对阿霉素摄入及用流式细胞技术检测平均荧光强度,评估小鼠肝癌细胞对药物摄入量.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性.结果 流式细胞术检测TLS9a核酸适配体与BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌细胞结合率为54.1％,TLS9a耦联的脂质体平均粒径分布在(116.0±5.0)nm.TLS9a-liposome/DOX在pH 5.0的环境中可以快速释放化疗药物DOX,72 h药物释放量超过70％.TLS9a-liposome/DOX在体外能够有效抑制小鼠肝癌细胞BN L.1ME.A.7R.1生长.结论 TLS9a核酸适配体可以特异性与小鼠肝癌细胞BNL.1ME.A.7R.1结合,可用于检测小鼠肝癌细胞.     

非标记型适配体传感器对石房蛤毒素的高灵敏度检测

目的 建立了一种基于荧光染料噻唑橙(thiazole orange,TO)和核酸适配体的非标记型适配体传感器,可快速、灵敏地检测石房蛤毒素(saxitoxin,STX)。方法 本研究中使用经过变形处理的直链适配体 45e-1能够特异性识别并结合STX,形成了稳定的G-四链体复合物。TO自身以游离态存在于水溶液中时几乎没有荧光发射,但通过与G-四链体的小凹槽结合产生荧光。因此,TO可作为荧光探针,用于指示45e-1与STX结合后产生的构象变化从而达到定量检测STX的目的。 结果 在最佳实验条件下,荧光信号强度变化与STX浓度呈正相关关系,拟合线性方程为Y = 3639.8lgCon_STX + 2341.5(R₂ = 0.9725),检测限为0.67 nmol/L,对其他常见海洋毒素的交叉反应可以忽略。在海水中,该方法的加标回收率为90.7%–108.7%,RSD为7.1%–10.9%。结论 本研究建立的非标记型适配体传感器可以实现对STX的定量检测,并且具有良好的特异性和重现性,为准确、快速检测其他海洋毒素提供思路。     

核酸类药物的修饰和递送研究进展

核酸类药物是在基因水平上发挥作用的RNA或DNA。目前应用较多的有核酸适配体、反义寡核苷酸、信使RNA、微RNA、小干扰RNA、小激活RNA等。核酸类药物临床应用面临稳定性差、靶向性弱、难以跨越体内屏障等难题。通过核酸化学结构修饰可以提高部分核酸药物在体内的稳定性、靶向性，提高递送效率，同时降低药物的免疫原性；应用核酸类药物载体可以帮助药物到达病灶，有助于核酸类药物实现更高效的内体逃逸，促进药物在体内发挥作用。目前应用较多的递送载体有病毒载体、脂质纳米粒、聚合物纳米载体、无机纳米载体、蛋白载体、外泌体等。目前，单独的修饰或递送载体尚不足以克服众多障碍，将核酸化学结构修饰与药物递送系统相结合有望实现更好的治疗效果，但后者技术难度和临床转化成本也随之增加。针对更加简单实用、低毒高效、精准递送核酸药物载体和核酸化学结构修饰的研发将成为核酸药物研发的热点方向。本文综述了核酸类药物的修饰和递送研究进展，讨论了提高核酸类药物递送效率的对策，以期为核酸类药物的转化应用提供参考。     

适配子介导转运在肿瘤靶向治疗中的研究进展

适配子是生物分子的单链寡核苷酸配体,通过指数富集的配体系统进化技术从人工合成的单链随机寡核苷酸文库中筛选获得。本文从连接方式、治疗靶点、疗效、优缺点多个方面对适配子介导转运在靶向肿瘤化疗、核酸治疗、光动力疗法和光热疗法中的研究进展进行概述。指出以适配体靶向肿瘤的递送系统在肿瘤相关靶向治疗中发展迅速,但仍面临许多挑战。筛选更多靶点的高亲和力适配子,改进适配子与其他治疗药物的结合模式,改善药物的药代动力学是目前工作的重点。     

核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用

核酸适配体是利用指数富集的配基系统进化技术体外筛选得到的单链DNA或RNA片段,能高亲和、高特异性地结合氨基酸、糖类、蛋白质、细胞、细菌和病毒等多种目标物质,具有操作简单、灵敏度高和检测成本低等优点.在海洋生物毒素的检测和预防中,核酸适配体技术已显示出巨大的潜力.本文概述了核酸适配体技术的基本原理、目前的应用现状及优势,分析了海洋生物毒素分子的特点及现有检测手段的局限,并对核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用前景进行了展望.     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的 利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法.方法 利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测.考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光...     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法。方法利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测。考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光强度的影响,并对该方法的特异性进行了验证。结果反应体系在12℃,pH 7.5条件下具有最佳实验效果,在最优条件下,最低能检测10-6mol/L的ATP,并具有较高的特异性。结论本研究为ATP的快速检测提供了一种易于操作、低成本的新方法。     

实时荧光核酸恒温扩增技术在淋球菌检测中的应用分析

目的采用统计学方法评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)在临床淋球菌检测中的应用。方法以淋球菌培养法为标准对照,采用实时荧光核酸恒温扩增技术同时对150例疑似患者的生殖道拭子标本和尿液标本进行检测,对结果进行统计学分析比较,并用PCR法进行验证。结果使用SAT检测的生殖道拭子和尿液阳性检出均为110例,培养法阳性检出为108例,其中培养法检出阴性的2例通过PCR验证为阳性。两种取样方式的SAT检测法和培养法三者阳性率差异均无统计学意义(P0.05);以培养法为金标准,SAT检测拭子的敏感度为100.0%,特异度为95.2%;SAT检测尿液标本的敏感度为100.0%,特异度为95.2%。结论采用实时荧光核酸恒温扩增技术对生殖道拭子和尿道标本的检测效果与培养法相比,阳性率高,敏感度较高,且尿道标本收集方法比较简便,患者依从性好,可代替拭子道取样方法,此方法可在临床推广应用。     

新生儿轮状病毒无症状感染的聚合酶链反应研究

选用与 A 组人类轮状病毒(Human Romvirus,HRV)编码 VP7蛋白的第9基因(或8)两个保守序列互补的引物,建立检测 A 组 HRV dsRNA 的聚合酶链反应技术,扩增产物片段约342bp。经逆转录—聚合酶链反应(RT—PCT)检测18例无腹泻症状新生儿89份粪便标本,并与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法进行比较,结果前者检出 HRV 核酸54份(60.7%),而后者则检出35份(39.3%),PCR 结果可能比较接近新生儿排泌轮状病毒的实际情况。     

医院污水中EV71病毒核酸的检验

目的研究医院污水EV71病毒核酸的检测方法,为手足口病控制提供依据。方法用载阳电荷的硅胶滤材吸附浓集污水中的EV71病毒,然后用RT-PCR和实时荧光PCR技术检测EV71病毒。结果建立的载阳电荷硅胶浓集方法能有效浓集医院污水中的EV71病毒,通过对6家医院的医院污水检测有2家检出EV71病毒核酸,所有检出EV71核酸的医院污水余氯都不符合国家卫生标准。结论医院污水中含有EV71病毒核酸,提示其为环境中EV71病毒的重要污染源,因此需要加强医院污水消毒的监督检查。     

一种基于NASBA技术的新型快速肠道病毒检测方法的应用研究

目的: 基于核酸等温扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)荧光分子信标探针检测技术,进行肠道病毒的快速检测与辅助诊断?方法:根据Genebank上肠道病毒5′端非编码区序列,设计特异性引物与捕获探针,应用纳米技术对商品化磁珠进行偶联,NASBA方法进行扩增,NucliSens读数仪检测,荧光定量RT-PCR方法进行验证,同时验证NASBA方法的特异性?灵敏度和重复性?结果:该方法对肠道病毒具有高度特异性,与RSV等呼吸道相关病毒均无交叉反应,反应体系具有很高的稳定性?结论:本研究应用的肠道病毒NASBA检测方法特异?灵敏?快速简便,适用于肠道病毒的日常监测和爆发疫情的应急诊断?     

东莞市1例星状病毒核酸检测及分析

目的对星状病毒进行核酸快速诊断并对其部分核酸序列进行测序分析。方法采用RT-PCR、基因测序技术对标本中的核酸进行检测分析。结果 RT-PCR结果表明标本为星状病毒阳性,对PCR扩增产物测序得到了409bp长度的ORF2部分基因序列,经Blast比对发现其为Ⅰ型血清型,与北京分离的一株星状病毒序列（GenBank号FJ755403.1）最为相似,仅有一个C→T的核苷酸变异。但编码的氨基酸并无改变,均为甘氨酸（Gly）。结论应用PCR技术扩增星状病毒特定片段可用于病毒的快速检测,同时对扩增产物测序还可对病毒进行分型,并了解其基因变异情况。     

新型冠状病毒快速与普通核酸检测系统的临床组合应用研究

将新型冠状病毒（COVID-19）的快速与普通核酸检测系统不同组合单元混搭应用,分析新冠核酸检测的最优化组合应用。方法 将新冠核酸液体质控品稀释到浓度为200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。将普通检测系统（核酸提取法、普通扩增试剂和普通荧光定量PCR仪）和快速检测系统（直接裂解法、快速扩增试剂和快速荧光定量PCR仪）中的不同单元,进行混搭组合。通过扩增以上不同浓度的稀释质控品,验证不同混搭组合应用的检测效果。结果 全部使用普通检测系统组合单元,其敏感性较好但检测时间较慢（134 min）。全部使用快速检测系统组合单元,其敏感性较差但检测时间较快（56 min）,其中直接裂解法是造成敏感性较差的主要原因。 进一步的研究发现,使用普通检测系统中的普通核酸提取法,搭配快速检测系统中的快速扩增试剂和快速荧光定量PCR仪,该混搭组合系统敏感性较好,且时间较快（59 min）。结论 在临床实践中,不建议使用直接裂解法提取核酸,但可使用快速扩增试剂和快速荧光定量PCR仪提高检测效率,缩短检测时间     

核酸检测法对血液标本内乙肝病毒的检测价值分析

目的：：研究分析核酸检测法对血液标本内乙肝病毒( HBV)的检测价值。方法：采集中心血站无偿献血的血液标本16214份,同时进行酶联免疫吸附法( ELISA)和核酸检测法,以筛查HBV感染情况,并分析两组检测方法的诊断价值。结果：ELISA、核酸检测HBV 的一致性较好,差异无统计学意义( P>0.05)。核酸检测法的特异性、敏感度明显高于 ELISA 检测法,而漏诊率及窗口期明显低于ELISA检测;A组的HBV－DNA阳性率、含量均高于B 组、C 组。上述差异均有统计学意义( P<0.05)。结论：核酸检测法具有高度的特异性和灵敏度,与 ELISA 检测具有一定的互补性,可有效地减少漏诊率,缩短窗口期,且HBV－DNA的含量能反映HBV的传染性,对输血安全具有重要作用。     

核酸试纸条快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因方法的建立

目的 基于核酸试纸条技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因的方法。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物并通过克隆转化鉴定PCR产物,建立并组装核酸试纸条,评价核酸试纸条的特异性、灵敏度和稳定性。 结果 蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg?L^－1,纯度约为1.60。PCR产物阳性条带经切胶回收、克隆转化和测序比对,与GenBank数据库中已登记的entFM相似性为100%。在pH值7.0条件下,每100 μL 胶体金溶液加入3.3 μg链霉亲和素浓度标记,质控线浓度为1.8 g?L^－1,检测线浓度为1 g?L^－1时,硝酸纤维素膜上质控线与检测线均可与PCR产物反应出现清晰的红色条带。按照最适条件组装成核酸试纸条,PCR产物6 μL,样品展开液100 μL,检测10 min后可观察结果。核酸试纸条特异性与电泳结果一致,仅蜡样芽胞杆菌为阳性结果,与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、大肠埃希菌和沙门氏菌皆无交叉反应,为阴性结果;灵敏度检测,核酸试纸条DNA质量浓度同时降至10^－3 mg?L^－1仍可准确检测,普通PCR电泳结果显示DNA质量浓度同时降至10^－1 mg?L^－1出现目的条带,核酸试纸条比普通PCR灵敏度提高100倍;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测稳定性一致。 结论 建立的核酸试纸条检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因灵敏度高、特异性强且具有良好稳定性,适用于快速鉴别蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因。     

RT—LAMP检测甲型HIN1病毒核酸几种结果判定方法

目的比较RT—LAMP检测甲型H1N1流感病毒核酸几种不同的结果判定方法的差异,优化检测方法。方法利用已知的阳性病毒样本,对比电泳、直接观察、加入SYBRGREENI核酸染料和优化后的预染核酸染料和的检测灵敏度。结果电泳检测的灵敏度最高,加入SYBR GREEN I染料的灵敏度略低,而直接的肉眼观察灵敏度低约2个数量级。加入优化后的预染染料其检测灵敏度与加入SYBR GREEN I核酸染料相当。结论电泳法检测的灵敏度最高,可通过加入优化后的预染染料提高目测判定反应结果的灵敏度,增强反应的特异性,并可降低气溶胶污染。