宿主蛋白LSm1-7复合体在登革病毒RNA复制中的作用研究

目的 探讨LSm1-7复合体在登革病毒(DENV)RNA复制中的作用.方法 DENV感染HepG2细胞后,在不同时间点(2、24、36、48 h)收集细胞和提取总mRNA,实时定量PCR (RT-qPCR)分析LSm1表达水平;将LSm1的siRNA和非特异对照siRNA两次转染HepG2细胞后感染DENV-2,24h后收集细胞,提取总mRNA,RT-qPCR分析LSm1表达水平与病毒RNA表达水平;利用LSm1抗体与dsRNA抗体对DENV感染细胞进行免疫荧光染色,激光共聚焦分析LSm1与dsRNA共定位情况.结果 与2h比较,随着时间的推移,DENV-2 RNA和LSm1 RNA水平逐渐升高;与对照组siNC比较,siLSm1组LSm1 RNA水平明显降低,沉默效率达78.2％;与对照组siNC比较,siLSm1组DENV RNA含量降低35.6％;LSm1-7复合体在DENV感染HepG2细胞后募集到核周围,与DENV dsRNA共定位.结论 LSm1-7复合体可能作为DENV复制复合物的组成部分,正调控DENV RNA的复制.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药

目的 筛选高效dsRNA/mdr1,以备研究RNA干扰逆转肝细胞癌多药耐药之用.方法 首先根据siRNA设计原则,以多药耐药基因(mdr1)为靶基因,设计并选择4～5条siRNA/mdr1,经BLAST后体外转录法合成dsRNA/mdr1,用Oligofectamine试剂分别转染HepG2/mdr1,然后从mRNA、蛋白(P-gp)表达水平和细胞功能变化评价HepG2/mdr1耐药性被逆转的程度,比较各个dsRNA/mdr1的逆转效率,筛选出有效的siRNA/mdr1.结果 成功合成5条dsRNA/mdr1(其中1条为阴性对照),dsRNA/mdr1-4 mRNA表达(18.73±1.33)%、蛋白表达变化(79.1±1.6)%～(16.8±0.4)%与其他各组细胞比较,有显著性差异;细胞内柔红霉素(DNR)累积量也较其他组明显增加(平均荧光强度79.58,阳性率84.25%,P＜0.05).结论 体外转录法结合脂质体转染适用于筛选高效siRNA,肯定了siRNA干扰序列能够有效阻抑mdr1基因编码蛋白p170的功能.     

siRNA对HepG2细胞mcl-1表达的影响

目的:探讨特异性siRNA对肝癌细胞系HepG2中mcl-1表达的影响.方法:将特异性siRNA经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2;半定量RT-PCR观察干扰前后mcl-1 mRNA水平变化,比较对应不同位点的两对siRNA片段对mcl-1的干扰效果,分析RNA干扰的特异性、时效性;Western Blot检测转染前后Mcl-1蛋白表达情况.结果:特异性siRNA片段能有效降低mcl-1 mRNA水平,最大干扰效率达67.25%,高于作为对照的非相关片段;对应不同位点的两对siRNA片段对mcl-1均可产生干扰作用,彼此间差别不大;干扰作用于转染后24 h即可出现,48 h达高峰,72 h稍有降低;Western Blot证明转染siRNA-F1后Mcl-1蛋白表达下调.结论:RNA干扰技术可有效下调肝癌细胞系HepG2中mcl-1 mRNA水平,明显下调Mcl-1蛋白表达.     

下调miR-4443/TIMP2信号通路增强HepG2细胞对索拉非尼的敏感性

目的 探讨下调miR-4443/TIMP2信号通路后肝癌HepG2细胞对索拉非尼敏感性的影响.方法 将HepG2细胞分为对照组(DMSO)与索拉非尼处理组(10 μmol/L),索拉非尼处理HepG2细胞24 h后,RT-qPCR检测miR-4443的变化;脂质体法将miR-4443模拟物与miR-4443抑制剂转染HepG2细胞,通过CCK-8检测转染miR-4443模拟物或抑制剂后联用索拉非尼对HepG2细胞活性的影响;生物信息学预测miR-4443的下游靶基因,索拉非尼处理24 h后通过RT-qPCR和Western blot分别检测下游靶基因TIMP2 mRNA及其蛋白水平的变化;转染miR-4443模拟物、抑制剂后,RT-qPCR和Western blot分别检测TIMP2 mRNA以及蛋白含量的变化;在HepG2细胞中通过脂质体法转染TIMP2 siRNA,Western blot检测TIMP2蛋白含量;CCK-8检测敲低TIMP2后联用索拉非尼对HepG2细胞活性的影响.结果 与对照组相比,索拉非尼处理组HepG2细胞中miR-4443的含量显著降低(P＜0.05);转染miR-4443模拟物可显著降低索拉非尼对细胞活性的抑制(P＜0.05),而转染其抑制剂则可显著增强索拉非尼的这一作用(P＜0.05);生物信息学预测结果显示miR-4443结合的下游靶基因为TIMP2;索拉非尼处理后HepG2细胞中TIMP2的mRNA及蛋白水平显著升高(P＜0.05);而在HepG2细胞中转染miR-4443的模拟物或抑制剂则可使TIMP2的mRNA表达量相应下降或上升,转染模拟物后TIMP2蛋白表达显著降低(P＜0.05),表明miR-4443 与TIMP2间存在调控关系;用TIMP2 siRNA降低TIMP2表达后,可显著增强索拉非尼对HepG2细胞活性的抑制效果(P＜0.05).结论 下调miR-4443/TIMP2信号通路可以增强HepG2细胞对索拉非尼的敏感性.     

ZHX2在调控背根神经节m阿片受体表达致神经病理性痛中的作用

目的探讨背根神经节（DRG）转录因子锌指和同源框蛋白2（ZHX2）在调控外周神经损伤m阿片受体（MOR）表达致痛觉 过敏的作用,为临床治疗神经病理性疼痛（NP）提供实验理论依据。方法取48只8周龄雄性C57BL6J小鼠,按随机数字表法分 为4 组：DRG内分别注射无义阴性对照序列（siNC）、ZHX2 siRNA 的坐骨神经慢性缩窄性损伤模型（CCI 组）和siNC、ZHX2 siRNA的假手术组,每组12只。注射药物后7 d收集DRG组织,RT-qPCR和Western blot分别检测小鼠DRG ZHX2和MOR转 录和翻译的表达及机械痛阈（PWF）改变。取6只21 d龄SPF级健康成年雄性C57BL6J小鼠,提取上述小鼠DRG组织行原代细 胞培养,分为2组（每组3个重复）：转染siNC和ZHX2 siRNA组。转染后48 h,收集细胞分别检测ZHX2和MOR转录和翻译的 表达。结果与注射siNC 和siRNA 的假手术组比较,注射对照的siNC CCI 组DRG ZHX2 mRNA和蛋白质表达均增加,而 MOR mRNA和蛋白质表达均下调,差异均有统计学意义（P<0.05）。而与注射siNC的CCI组比较,注射siRNA的CCI组小鼠 DRG ZHX2 mRNA和蛋白质表达下调,同时增加MOR mRNA和蛋白质表达,差异均有统计学意义（P<0.05）。在痛行为上,与 注射siNC 的CCI组比较,注射siRNA的CCI组小鼠患侧PWF降低,差异有统计学意义（P<0.05）。与转染siNC 组比较,转染 ZHX2 siRNA组ZHX2的mRNA和蛋白质表达降低同时促进MOR转录和翻译表达增加,差异均有统计学意义（P< 0.05）。结 论敲减外周神经损伤引起的DRG ZHX2高表达,逆转MOR表达下调,从而缓解神经损伤引起的痛觉过敏行为。     

靶向沉默DEK对肝癌HepG2细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨靶向沉默DEK对肝癌细胞株增殖及细胞周期的影响。方法常规培养人肝癌细胞株HepG2,待细胞生长至90%融合度时分为空白对照组、小分子干扰RNA(siRNA)对照组和DEK siRNA组。空白对照组细胞正常培养,不做任何处理;siRNA对照组和DEK siRNA组细胞分别在LipofectamineTM2000脂质体介导下进行siRNA表达载体和DEK siRNA表达载体转染。应用实时定量聚合酶链反应检测HepG2细胞中DEK mRNA的表达,免疫蛋白印迹法检测HepG2细胞中DEK、Cyclin D1蛋白的表达,四甲基偶氮唑盐法检测HepG2细胞增殖情况,流式细胞术观察细胞周期变化。结果空白对照组、siRNA对照组和DEK siRNA组HepG2细胞中DEK mRNA表达分别为0.826±0.052、0.776±0.051、0.420±0.050,DEK蛋白表达分别为0.691±0.073、0.726±0.061、0.311±0.038,Cyclin D1蛋白表达分别为0.712±0.069、0.780±0.074、0.434±0.039;DEK siRNA组HepG2细胞中DEK mRNA及DEK、Cyclin D1蛋白表达均低于空白对照组和siRNA对照组(P<0.05);空白对照组和siRNA对照组HepG2细胞中DEK mRNA及DEK、Cyclin D1蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。DEK siRNA组转染后24、48、72、96、120 h时细胞增殖能力均低于空白对照组和siRNA对照组(P<0.05);空白对照组和siRNA对照组各时间点细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。DEK siRNA组G_0+G_1期细胞所占比例高于空白对照组和siRNA对照组(P<0.05);DEK siRNA组S期、G_2+M期细胞所占比例均低于空白对照组和siRNA对照组(P<0.05);空白对照组和siRNA对照组G_0+G_1期、S期、G_2+M期细胞所占比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关分析显示,Cyclin D1蛋白表达与DEK mRNA和DEK蛋白表达均呈正相关(r=0.909、0.899,P<0.05)。结论 DEK siRNA可下调HepG2细胞中DEK基因表达,抑制HepG2细胞增殖,改变细胞周期分布,这一过程可能与下调Cyclin D1表达有关。     

TLR7激活对HepG2.2.15细胞株炎症因子TNF-α和IL-6表达的上调作用

目的比较乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因组稳定转染细胞株HepG2.2.15和肝癌细胞株HepG2中TLR7表达,分析HepG2.2.15细胞中TLR7激活后诱导炎症因子表达。方法通过实时荧光定量(Real-time)PCR分析HepG2和HepG2.2.15中TLR7受体、IL-6和TNF-αmRNA水平表达。TLR7配体Gardiquimod刺激20min后,Western blot分析激活的信号通路;刺激6h,Real-timePCR分析TLR7激活后IL-6和TNF-αmRNA水平表达变化;刺激48h,ELISA法分析IL-6和TNF-α蛋白质水平表达变化。结果HepG2.2.15细胞株中TLR7mRNA水平表达比HepG2中的表达高约30倍(P0.01)。在没有任何刺激的条件下,HepG2.2.15细胞株中IL-6和TNF-αmRNA水平表达比HepG2中的表达分别高约7.5和9.3倍;Gardiquimod刺激6h后,HepG2.2.15细胞株中IL-6和TNF-αmRNA表达水平明显升高,并具有剂量依赖关系(P0.01),而HepG2细胞在相同的刺激下IL-6和TNF-αmRNA表达水平升高并不明显(P0.05);刺激48h后,IL-6和TNF-α蛋白质表达水平变化与其mRNA水平变化一致(P0.01)。HepG2.2.15细胞株经Gardiquimod刺激后NF-κBp65亚单位进入细胞核中量显著增加。结论TLR7激活后能够上调HepG2.2.15细胞中IL-6和TNF-α的表达,提示TLR7可能在乙型病毒性肝炎的病理生理过程中发挥作用。     

靶向核定位序列siRNA对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA复制的抑制作用

目的 针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区设计并化学合成2条小干扰RNA(siRNA),观察其对共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)水平的影响.方法 将siRNA转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72 h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,采用Real-time PCR定量检测细胞内cccDNA及细胞培养上清HBV DNA拷贝数.RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果 靶向NLS区的2条siRNA均能不同程度地降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平,抑制HBV DNA的复制及HBeAg的分泌,对cccDNA的抑制率分别为93.30％和85.00％(P＜0.01),对HBV mRNA抑制率分别为62.80％和48.90％,对HBV DNA抑制率分别为76.56％和66.41％(P＜0.01),对HBeAg抑制率分别为57.25％、43.48％(P＜0.01).而无关序列对HBV DNA与cccDNA的复制和HBeAg表达几乎无干扰作用.结论 靶向HBV核心蛋白C末端核定位序列的siRNA可特异、高效、稳定地显著降低HBV cccDNA水平,抑制HBV DNA复制及HBeAg分泌,为应用RNA干扰治疗HBV感染奠定了一定基础.     

丁型肝炎病毒复制包装载体的构建

目的  构建一种可以实现丁型肝炎病毒（HDV）复制包装的HDV转座子载体。方法  采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表达框的转座子（PB）载体PB126I3,将构建好的载体转染HuH-7细胞,转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg的表达,质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测HDV核糖核酸（RNA）的含量;同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/NTCP）稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达。结果  HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒,并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原。结论  HDV复制包装转座子载体构建成功,为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础。

     

RNAi靶向人端粒酶逆转录酶对人肝癌细胞的生长抑制作用

目的 利用RNAi技术降低人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达,抑制其活性,研究其对人肝癌细胞的增殖和凋亡影响.方法 构建针对hTERT基因的siRNA真核表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT,制备靶向hTERT的重组逆转录病毒;用重组逆转录病毒感染HepG2人肝癌细胞,以TRAP法检测端粒酶活性变化;流式细胞仅检测细胞凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞生长抑制情况.结果 成功制备出hTERT siRNA逆转录病毒表达载体;重组病毒感染HepG2细胞24、48、72 h后端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%(P＜0.05);感染后24 h细胞凋亡率29.05%;MTT实验结果显示肿瘤生长受到抑制,并存在一定量效和时效关系.结论 hTERT siRNA能特异性使hTERT基因表达抑制,端粒酶活性下降,肝癌细胞增殖受到抑制.     

糖核酸内切酶Ⅲ制备的小干扰RNA(esiRNA)文库对乙肝病毒感染的基因治疗

目的 建立HBV esiRNA文库并研究该文库对HepG2.215细胞内HBV表面抗原(HBsAg)表达的抑制效应。方法 制备并纯化大肠杆菌核糖核酸内切酶Ⅲ GST 融合蛋白（GST RNaseⅢ）;设计并制备HBV基因组序列1~540核苷酸（HBV-1)的双向转录模板(T7-HBV-1);体外转录该模板获得双链RNA(dsRNA),即T7-HBV-1 dsRNA;用GST-RNaseⅢ酶切T7-HBV-1 dsRNA制备HBV小干扰RNA文库(esiRNA library）;应用50、100和150nmol/L纯化的esiRNA文库转染携带HBV病毒的HepG2.215细胞并应用实时定量PCR及ELISA检测HBsAg的转录和蛋白翻译表达水平。结果 成功制备并纯化有活性的GST-RNaseⅢ;用该酶将体外制备的dsRNA酶切并纯化得到esiRNA文库;应用该文库成功抑制了HepG2.215细胞内的HBV HBsAg的表达,并且其抑制作用随esiRNA浓度升高而增强。结论 用生物学方法制备的HBV esiRNA文库可以成功抑制HBV HBsAg在细胞内的表达,为预防治疗HBV感染开辟了新的思路。     

Suramin Inhibits the In Vitro Expression of Encephalitis B Virus Proteins NS3 and E

ThemortalityofepidemicencephalitisBvirusinfectionisveryhigh ,accountingforonethirdofalltheinfectedpatients[1] .Therefore ,itisofurgencytofindaneffectivewaytopreventandtreatthedisease .AlthoughtheinactivatedvaccineagainstencephalitisBvirusiswidelyused ,sofarnoefficaciousdrughasbeenfoundforthedisease .Suramin ,asananti trypanosomedrug ,camein tousein 192 0 ,the pharmacologicalmechanismofwhichremainsunclear .Apartfrombeingrichinan ions ,Suraminisuniqueintermsofitschemicalstruc ture .Itisassumed…     

喜炎平注射液抗Ⅱ型登革病毒作用的体内及体外实验研究

目的 分别通过体外和体内实验研究喜炎平注射液对Ⅱ型登革病毒（Dengue virus serotype 2, DENV2）的抗病毒作用。方法 体外实验以利巴韦林注射液作为阳性对照药物,分别以灭活、抑制进入、治疗性给药以及预防联合维持治疗的方式处理人肝癌细胞株HepG2细胞,在不同时相点收获上清和细胞,分别利用间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay, IFA）和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）检测DENV2的病毒载量,从而评价喜炎平注射液的体外抗DENV2作用。体内实验以SCID小鼠为实验鼠,腹腔注射HepG2细胞,建立模型小鼠,腹腔注射感染DENV2,次日给予不同剂量（1、2、4 mg/只）的喜炎平注射液,连续给药4 d,部分小鼠于感染第6日取材,利用IFA检测实验鼠脾、肝及血清中病毒载量,并观察实验鼠的生存率。结果 体外实验显示,喜炎平注射液能够灭活DENV2,并抑制DENV2进入细胞,同时无论是治疗还是治疗联合预防给药,均可对DENV2的复制具有良好的抑制作用,即在病毒感染早期及晚期,喜炎平均可发挥抗病毒作用,且优于利巴韦林。进一步在体内实验中同样显示喜炎平具有较好的抗病毒作用,可以降低实验鼠脾、肝及血清中病毒载量,并可提高实验鼠的生存率。结论 喜炎平注射液具有明显的抗DENV2病毒的作用,可为DENV感染的治疗提供新的候选药物。     

Suramin inhibits the<Emphasis Type="Italic">In Vitro</Emphasis> expression of encephalitis B virus proteins NS3 and E

Summary In this study, the mechanism by which Suramin inhibits the replication of epidemic encephalitis B virus was explored to provide a theoretical basis for its further application in clinical practice. After viral infection of HepG2 and IMR-32 cells, different concentrations of Suramin were added to the culture media, and then the cultural supernatants and infected cells were collected 48 h later. For the evaluation of the curative effect, cytopathic effect (CPE), virus titers, the expression of viral protein and viral RNA were determined by Western blot RT-PCR andin vitro RNA synthesis, respectively. At the concentration of 50 μg/ml of Suramin, HepG2 and IMR-32 infected with epidemic encephalitis B virus decreased by 51.8% and 0.03% respectively, as compared with controls. It was suggested that expression of encephalitis B virus proteins NS3 and E was notably reduced by Suramin. This is especially true of E protein. At RNA level, however, no difference in RNA virus was found between Suramin-treated virus and non-treated cells. Our results suggest that Suramin can inhibit viral replication by blocking the production of viral proteins. XU keshu, male, born in 1961, Associate Professor This project was supported by the fund of Chinese Service Center for Scholarly Exchange (No. 1999-363).     

PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响. 方法:设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡. 结果:成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体. 它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率最高,可达93.99%. HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P＜0.05),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率最高,为66.91%. 结论:靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.     

以S区为靶位的小干扰RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的以乙型肝炎病毒（HBV）S基因区为靶位,构建表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro,体外观察siRNA抗HBV的效果。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞,利用脂质体Metafectene转染表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro于细胞中,用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA法）检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,用定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测细胞上清DNA,用逆转录（RT）-PCR检测HBV mRNA。结果成功构建了表达siRNA的转录质粒载体,siRNA可抑制HBV的抗原表达和病毒复制,1、2、4μgsiRNA对HBsAg的抑制率分别为75％、82％、89％;对HBeAg的抑制率分别为32％、38％、43％;对HBVDNA的抑制率分别为30％、43％、49％;对HBVRNA的抑制率分别为30％、70％、90％。结论靶向HBVS区的siRNA能抑制HBV的抗原表达和复制;siRNA抑制作用呈剂量依赖性和序列特异性。