医源性表皮葡萄球菌胞间黏附素基因操纵子在聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成中的作用研究

目的表皮葡萄球菌胞间黏附素基因(intercellar adhesion,ica)是细菌聚集的关键因子,通过分析医源性表皮葡萄球菌生物膜基因型,探讨ica操纵子在聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面细菌生物膜形成中的作用。方法取56株医源性表皮葡萄球菌临床分离株,应用PCR法、基因测序技术检测细菌生物膜形成相关基因,包括16S rRNA、自溶素(autolysin,atlE)、纤维蛋白原结合蛋白(fi brinogen binding protein,fbe)以及ica。取医源性表皮葡萄球菌制备浓度为1×105cfu/mL的细菌悬液,并根据目的基因检测结果,分别以icaADB、atlE、fbe阳性基因型(ica操纵子阳性组)以及icaADB阴性而atlE、fbe阳性基因型(ica操纵子阴性组)与PVC材料培养。于6、12、18、24、30h各取2个PVC材料,进行激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察,测量单位视野细菌群落数量及形成的细菌生物膜厚度。结果目的基因检测示,医源性表皮葡萄球菌16S rRNA阳性率为100%(56/56);icaADB、atlE、fbe阳性基因型菌株占57.1%(32/56);icaADB阴性而atlE、fbe阳性基因型菌株占37.5%(21/56)。测序结果示,目的基因16S rRNA、atlE、fbe、icaADB扩增产物序列分别与GenBank中基因序列相符。随时间延长,ica操纵子阴性组的PVC材料表面无明显细菌生物膜形成;ica操纵子阳性组的PVC材料表面细菌群落数量逐渐增多,细菌生物膜体积逐渐增大,24h时可见成熟的细菌生物膜结构,30h时细菌生物膜体积趋于稳定。培养各时间点ica操纵子阳性组PVC材料表面单位视野细菌群落数量(F=435.987,P=0.000)及细菌生物膜厚度(F=6714.395,P=0.000)明显高于ica操纵子阴性组,差异均有统计学意义。结论医源性表皮葡萄球菌可以分为ica操纵子阴性和ica操纵子阳性两类细菌;ica操纵子可以增加PVC材料表面细菌生物膜的形成能力、细菌群落数量及细菌生物膜厚度,在PVC材料表面细菌生物膜形成中具有重要作用。     

雌二醇对乳腺癌假体植入术后表皮葡萄球菌生物膜形成的影响研究

目的探讨雌二醇对乳腺癌术后假体表面表皮葡萄球菌生长以及生物膜形成能力及其结构的影响。方法取表皮葡萄球菌标准株ATCC35984,调整浓度至1×107 CFU/m L或1×108 CFU/m L,与硅胶片和终浓度为125 pmol/L的雌二醇混合培养,制备硅胶材料表面细菌生物膜体外模型。于培养后4、6、12、24、48、72 h,采用结晶紫染色半定量检测硅胶材料表面细菌生物膜形成能力,XTT法检测硅胶材料表面细菌生长动力;根据以上检测结果,选择细菌悬液实验浓度。取实验浓度表皮葡萄球菌ATCC35984悬液以及终浓度为50、125、250、500 pmol/L的雌二醇悬液,分别与硅胶片混合培养制备生物膜体外模型,以未添加雌二醇悬液(0 pmol/L)作为对照;另取实验浓度表皮葡萄球菌ATCC12228悬液,同法制备模型,作为阴性对照。于培养后4、6、12、24、48、72 h同上法检测硅胶材料表面细菌生长动力及生物膜形成能力,扫描电镜观察硅胶材料表面细菌生物膜超微结构;培养6、12、24 h激光共聚焦显微镜观察硅胶材料表面细菌生物膜厚度。结果根据XTT法及结晶紫染色半定量检测结果,选择浓度为1×107 CFU/m L细菌悬液进行实验。XTT法检测示,ATCC12228和ATCC35984菌株分别在4、6、12、24、72 h和4、6、24、72 h时,其125、250、500 pmol/L组细菌生长速度快于0、50 pmol/L组(P0.05),4、6、72 h时500 pmol/L组快于125、250 pmol/L组(P0.05),72 h时250 pmol/L组快于125 pmol/L组(P0.05),其余组间比较差异无统计学意义(P0.05);同一时间点两种菌株相同雌二醇浓度组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结晶紫染色半定量检测:各时间点ATCC12228菌株各雌二醇浓度组生物膜形成均为阴性。而ATCC35984菌株培养4 h即有生物膜形成,随时间延长逐渐增厚,24 h时达峰值;培养4、6 h,0 pmol/L组生物膜厚度大于125、250、500 pmol/L组(P0.05);12 h开始125 pmol/L组生物膜最厚,与其他组比较差异均有统计学意义(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察示,ATCC35984菌株在培养6 h时125、250、500 pmol/L组的生物膜厚度小于0、50 pmol/L组(P0.05),其余组间比较差异无统计学意义(P0.05);之后各组生物膜厚度逐渐增加,12、24 h时125 pmol/L组生物膜厚度明显大于其他浓度组(P0.05)。扫描电镜观察示,各时间点与其他浓度组相比,125 pmol/L组形成的生物膜结构范围最广,结构最致密、最丰富、层次最多。结论高浓度雌二醇可促进表皮葡萄球菌生长、生物膜形成和生物膜的成熟。     

聚氯乙烯材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜结构观察

目的建立聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜体外模型,观察混合生物膜的形成与微观结构。方法取表皮葡萄球菌(ATCC35984)与白色念珠菌(ATCC10231),分别制备浓度为1×106 CFU/m L的悬液并混合后,与直径0.5 cm PVC膜在胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基中共培养形成混合生物膜(实验组)。培养2、6、12、24、48、72 h时取PVC膜,激光共聚焦显微镜检测生物膜厚度、单位视野菌落数,并于48 h时测量生物膜内活菌百分比、三维重建PVC膜表面生物膜图像;扫描电镜观察各时间点混合生物膜结构。以单纯PVC膜置于TSB培养基中培养作为对照组。结果对照组各时间点PVC材料表面无病原菌黏附。实验组激光共聚焦显微镜观察示,培养6 h时可见菌落及生物膜形成,随时间延长均逐渐增加,24 h时菌落达高峰,48 h时生物膜厚度达峰值。实验组PVC膜表面菌落数比较,2、6、24 h间以及2、6 h与48、72 h间比较差异有统计学意义(P0.05),24、48、72 h间比较差异无统计学意义(P0.05);生物膜厚度除48、72 h间比较差异无统计学意义外(P0.05),其余各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.05)。培养48 h时,混合生物膜外层活菌百分比明显高于内层及中间层(P0.05)。三维重建显示混合生物膜表面凹凸不平,突起部分活菌数量较多。扫描电镜观察示,实验组随培养时间增加,PVC膜表面白色念珠菌由孢子状逐渐伸长出现假丝状及菌丝状,表皮葡萄球菌黏附于白色念珠菌周围,逐渐形成复杂的多层次网状混合生物膜。结论白色念珠菌-葡萄球菌混合培养可在PVC材料表面形成结构复杂的混合生物膜,激光共聚焦显微镜、扫描电镜与三维图像重建技术的结合是研究混合生物膜的理想方法。     

溴代呋喃酮对胸心外科聚氯乙烯材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

目的探讨溴代呋喃酮对胸心外科聚氯乙烯(PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响,为生物材料表面改性研究及临床生物材料植入感染的防治提供新思路。方法选用化学结构具有代表性的三种溴代呋喃酮分为3组,呋喃酮1组:3,4-二溴基-5-羟基-呋喃酮;呋喃酮2组:4-溴-5-(4-甲氧基苯基)-3-(甲氨基)-呋喃酮;呋喃酮3组:3,4-二溴基-5,5-二甲苯基-2(5H)-呋喃酮;对照组:PVC材料用酒精浸泡5min;分别对4组PVC材料进行表面涂层改性,将改性过的PVC材料与表皮葡萄球菌共同培育;分别于培养6h、12h、18h和24h时用激光共聚焦显微镜动态观察PVC材料表面细菌群落及细菌生物膜厚度的形成,扫描电子显微镜观察PVC材料表面细菌生物膜表面结构。结果激光共聚焦显微镜观测结果显示:呋喃酮2组各时间点PVC材料表面表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度明显小于对照组(P0.05),呋喃酮1组、呋喃酮3组表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。扫描电子显微镜观察显示:与对照组比较,呋喃酮2组6h时PVC材料表面细菌群落附着数量较少;18h时对照组PVC材料表面细菌生物膜结构初步形成,而呋喃酮2组无明显细菌生物膜结构形成。结论不同溴代呋喃酮对PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响不同,呋喃酮2可以抑制PVC材料表面表皮葡萄球菌群落数量和细菌生物膜厚度的形成。     

表皮葡萄球菌附属基因调节子C特异结合多肽对聚氯乙烯材料表面细菌生物膜形成作用的体外研究

目的探讨表皮葡萄球菌附属基因调节子C(accessory gene regulator C,agr C)特异结合多肽(简称为N1)对聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成作用的体外研究。方法以表皮葡萄球菌ATCC35984(生物膜表型阳性)和ATCC12228(生物膜表型阴性)作为研究对象。首先将两菌株分别加入浓度为100、200、400、800、1 600μg/mL的N1培养,以相同浓度agrC特异结合无关肽(简称为N0)培养作为对照;24 h后测定吸光度(A)值,确定N1最佳抑菌浓度。两菌株与最佳抑菌浓度的N1及N0分别培养,6、12、18、24、30、48 h测定A值,观察N1对表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响;在此基础上与PVC材料片培养6、12、18、24、30 h,扫描电镜观察PVC材料表面生物膜的表面结构;另取与ATCC35984菌株培养6、12、18、24 h的PVC材料片,激光共聚焦显微镜观察生物膜厚度。结果 A值测定显示,N1对ATCC35984菌株最佳抑菌浓度为800μg/mL。ATCC12228菌株与N1及N0培养后均未形成明显生物膜;ATCC35984菌株与N1及N0培养12 h时,生物膜形成能力差异有统计学意义(P0.05),6、18、24、30、48 h时差异无统计学意义(P0.05)。扫描电镜观察,ATCC35984菌株与N1及N0培养后,随时间延长均见成熟生物膜结构;而ATCC12228菌株培养后均未见生物膜形成。激光共聚焦显微镜观察,ATCC35984菌株与N1培养12 h时细菌量明显少于与N0培养,且以死细菌居多;6、18、24 h时两种培养条件下细菌数量未见明显差别,均以活细菌居多;同时,N1培养12、18 h时生物膜厚度明显小于N0培养(P0.05)。结论 N1抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的强度有量效关系;其在聚集期阻碍细菌的增殖和聚集,抑制生物膜形成,对成熟生物膜抑制作用不明显。     

宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

目的:检测宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌体外培养生物膜的抑制作用,探讨其抗菌机制。方法:体外培养表皮葡萄球菌产膜菌株,使用半定量粘附实验结晶紫染色法及刚果红实验检测,评估宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用。宁泌泰胶囊处理后,检测表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受及抗生素敏感性(最小抑菌浓度)的变化,并通过实时荧光定量PCR检测氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2转录水平变化。结果:结晶紫染色法显示,宁泌泰胶囊能够显著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成(P0.001),刚果红实验结果与此一致。在宁泌泰胶囊20 mg/m L浓度条件下,表皮葡萄球菌对氧化胁迫耐受性减弱了8倍,对氯霉素及红霉素敏感性均增强了4倍;实时荧光定量PCR显示,与阴性对照组相比氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2转录水平分别降低至22.9%和24.5%。结论:宁泌泰胶囊对表皮葡萄球菌生物膜具有显著抑制作用,减弱细菌对氧化胁迫耐受性,其机制可能通过下调表皮葡萄球菌氧化应激响应基因serp2195和gpx A-2表达水平实现;同时宁泌泰胶囊可以减弱表皮葡萄球菌对抗生素耐药性。     

金属蛋白酶对涤纶材料表面金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响

目的观察不同浓度下金属蛋白酶(A ur)对金黄色葡萄球菌在涤纶材料表面细菌生物膜形成的影响。方法90片涤纶片按随机数字表法分成3组,每组30片。3组均将涤纶片放入有金黄色葡萄球菌液(105CFU/m l)的无菌瓶中,A组再加入含400ng/m l浓度的A ur,B组再加入含80ng/m l浓度的A ur。3组均置入电热恒温水浴箱(98.6°F)中培育,分别于培育后6h、16h、24h、30h和48h用扫描电子显微镜(SEM),激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察细菌生物膜的厚度和单位面积内细菌生物膜群落数量。结果对照组涤纶片细菌生物膜的厚度和群落数呈时间依赖性明显增加,A组涤纶片金黄色葡萄球菌生物膜的厚度和群落数在各时间点均明显低于B组和对照组(P<0.05),B组生物膜的厚度和群落数在各时间点亦明显低于对照组(P<0.05)。结论A ur对金黄色葡萄球菌在涤纶片上细菌生物膜的形成有抑制作用,其抑制作用的强度与A ur剂量呈正相关。     

宁泌泰胶囊对葡萄球菌和大肠杆菌及其生物膜体外形成抑制作用的研究

目的:评估宁泌泰胶囊对葡萄球菌和大肠杆菌增殖以及体外培养生物膜的抑制作用。方法:使用梯度稀释法检测表皮葡萄球菌(1457),金黄色葡萄球菌(NCTC8325-4、Newman、MU50),大肠埃希菌(ATCC25922、CFT073)对宁泌泰的最低抑菌浓度(MIC);使用扫描电镜,观察不同浓度的宁泌泰对表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4,以及大肠埃希菌CFT073和ATCC25922生物膜形成的影响。结果:MIC检测结果显示,宁泌泰对表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4、Newman、MU50以及大肠埃希菌ATCC25922和CFT073均具有抑制效果,MIC为20 mg/ml;扫描电镜结果显示,宁泌泰能够抑制表皮葡萄球菌1457、金黄色葡萄球菌NCTC8325-4,以及大肠埃希菌CFT073和ATCC25922体外生物膜的形成。结论:宁泌泰胶囊既能够抑制葡萄球菌和大肠杆菌的增殖,也能够抑制其生物膜的形成,具有较为全面的抗细菌效果。     

外科病人中的表皮葡萄球菌脓毒症

表皮葡萄球菌(以下简称表葡)在过去称为白色葡萄球菌,曾被人们普遍看作是一种无毒力的菌种,对诸如先天性或风湿性心脏病、人工心脏瓣膜、TPN用的中心静脉导管等具有独特的易感性。历来不受重视,其实不然,近今已认识列表葡可能是一种有毒、侵袭性细     

假体周围高糖环境对葡萄球菌感染影响的实验研究

目的 探讨假体周围高糖环境对葡萄球菌生长和细菌生物膜形成的影响.方法 利用新西兰大白兔建立假体感染的动物模型,分为金黄色葡萄球菌组(金葡菌组,n=40)和表皮葡萄球菌组(表葡菌组,n=60),每组再随机分为实验组和对照组,实验组注入细菌的同时加入0.1ml质量浓度为1%的葡萄糖溶液,对照组加入0.1 ml生理盐水.金葡菌组分别于第2、4、6和8天观察;表葡菌组分别于2、4、6、8、12和16天观察.对不同时间点的膝关节假体感染动物行细菌计数、扫描电镜和组织学观察.结果 金葡菌组第2天实验组和对照组关节液细菌计数差异无统计学意义(P=0.426),注入细菌后第4、6和8天实验组较对照组细菌生长明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05).扫描电镜观察第2、4、6天实验组较对照组假体表面黏附细菌明显增多(P<0.05),细菌生物膜生成明显.组织学观察第2天实验组假体周围组织发现细菌,而对照组未发现细菌.表葡菌组第2、4、6、8、12和16天实验组与对照组细菌计数差异均无统计学意义(P>0.05),假体表面黏附细菌没有明显区别(P>0.05).组织学观察第2天实验组和对照组假体周围组织均未发现细菌.结论 假体周围高糖环境对金葡菌感染影响明显,而对表葡菌感染影响不明显.     

大蒜素对表皮葡萄球菌在人工关节材料表面粘附的影响

目的探讨大蒜素对表皮葡萄球菌在人工关节材料超高分子聚乙烯和钛合金表面粘附的影响。方法实验分为4组(其中按大蒜素干预的浓度不同具体细分):生理盐水干预组;1 mg/L大蒜素浓度干预组;2 mg/L大蒜素浓度干预组;4 mg/L大蒜素浓度干预组。利用细菌计数和生物膜定量实验观察不同浓度大蒜素干预后对表皮葡萄球菌在超高分子聚乙烯(UHMWPE)和钛合金表面粘附及生物膜形成的影响。细菌粘附数和生物膜量等计量资料使用单因素方差分析评估,组间两两比较使用LSD法。结果在大蒜素浓度分别为0 mg/L、1mg/L、2 mg/L、4 mg/L干预下,单位面积的超高分子聚乙烯材料表面粘附的细菌数分别为(36 312±6 522)CFU/mm2、(30 624±8 728)CFU/mm2、(13 425±6 026)CFU/mm2、(681±249)CFU/mm2,组间差异有统计学意义(F=61.52,P0.05)。钛合金螺钉表面细菌数分别为(76 113±6 504)CFU、(71 155±7 241)CFU、(18 611±6 549)CFU、(7 066±1 249)CFU,组间差异有统计学意义(F=325.42,P0.05)。超高分子聚乙烯表面生物膜吸光度值分别为(4.38±0.55)、(4.17±0.67)、(2.20±0.69)、(0.62±0.38),组间差异有统计学意义(F=81.84,P0.05)。钛合金螺钉表面的生物膜量分别为(3.43±0.51)、(3.29±0.53)、(2.74±0.58)、(0.59±0.25),组间差异有统计学意义(F=66.31,P0.05)。结论亚抑菌浓度的大蒜素能够抑制表皮葡萄球菌在UHMWPE和钛合金材料表面粘附,抑制生物膜在上述材料的形成。     

烧伤患者深静脉导管细菌生物膜的形成及意义

目的 了解烧伤感染后金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌在深静脉导管中形成生物膜的过程.方法 选择2008年11月-2009年8月在笔者单位住院的20例烧伤患者深静脉导管分离的细菌,分别与各自的标准菌株对照.深静脉导管尖端行扫描电子显微镜(SEM)观察.将菌株体外培养12、24、48、72 h和5 d后,进行细菌生物膜半定量黏附试验测定,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)双荧光染色观察并测定生物膜厚度.对数据进行团体t检验.结果 深静脉导管分离的菌株为金黄色葡萄球菌6株、鲍氏不动杆菌8株、铜绿假单胞菌6株,均为耐药菌株.SEM下可见深静脉导管内层表面形态多样、程度不一的生物膜.细菌被大量胞外多糖复合物包埋、彼此粘连融合成片状,生物膜呈团状聚集,形成立体多样结构,结构内可见少量红细胞,少数细菌被不完全包埋,尚可见黏着的菌体.深静脉导管内分离的金黄色葡萄球菌体外培养24、48及72 h的吸光度值大于界定值;鲍氏不动杆菌培养12、24、48和72 h,吸光度值均大于界定值;铜绿假单胞菌培养48 h后,吸光度值开始大于界定值.CLSM观察可见,培养24 h时,除铜绿假单胞菌标准株外,其余菌株均有散在的绿色荧光,不密集,多数靠近培养皿基底部,红色荧光充满视野.48 h时绿色荧光明显增多,从基底部向上扩延,部分与红色荧光重叠,形成视野中黄色荧光,鲍氏不动杆菌最明显,其次是金黄色葡萄球菌.在绿色荧光的强度和分布上,临床菌株明显多于标准株.培养72 h时铜绿假单胞菌和其标准株的绿色荧光增多,其他菌株图像中黄色荧光布满视野.培养5 d时绿色荧光较分散,以靠近基底部较明显.金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌在培养后48 h形成成熟的生物膜,铜绿假单胞菌则在72h.培养后72 h鲍氏不动杆菌的生物膜厚度为(18.2±3.6)μm,大于标准菌的(9.4±2.6)μm(t=5.42,P<0.05),是3种菌中生物膜最厚者.结论 烧伤临床常见的金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌和铜绿假单胞菌均能在深静脉导管内形成生物膜,其耐药菌株牛物膜形成能力和程度均大于普通菌株,以鲍氏不动杆菌尤为明显,成为烧伤后导管相关性感染的重要原因.     

联合用药对金黄色葡萄球菌生物膜作用的体外研究

目的观察连花清瘟胶囊水溶解物与头孢替唑钠联合用药对金黄色葡萄球菌生物膜的体外破坏作用。方法药物分为头孢替唑钠组、连花清瘟组、联合用药组和空白对照组;微量肉汤稀释法分别测定连花清瘟胶囊水溶解物和头孢替唑钠对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度;用酶标仪检测金黄色葡萄球菌生物膜内活菌数变化;用扫描电镜观察金黄色葡萄球菌生物膜内细菌受药物作用后的形态和大小。结果连花清瘟组活菌数较空白对照组低(P0.05);头孢替唑钠组与空白对照组相比差异无统计学意义(P0.05);联合用药组活菌数低于单独用药组(P0.05)。扫描电镜显示头孢替唑钠组生物膜中,大量细菌密集在一起,但密度较空白对照组稀疏,细菌形态基本正常,大小基本一致;连花清瘟组生物膜中形态不规则,大小不一致;而联合用药组形态更加不规则,大小更加不一致。结论连花清瘟胶囊水溶解物对金黄色葡萄球菌生物膜具有显著破坏作用,与头孢替唑钠联合应用可起到协同增效的作用。     

男性不育患者精液中金黄色葡萄球菌及其毒力基因对精子制动活性研究

目的:研究男性不育患者精液中金黄色葡萄球菌对精子活动力的影响,并探讨金黄色葡萄球菌毒力基因与其精子制动活性之间的关系。方法:收集589例男性不育患者精液中分离的非重复金黄色葡萄球菌60株,通过计算机辅助精子分析系统检测金黄色葡萄球菌对健康男性精液中精子活力的影响,筛选出可以使精子活力明显下降的菌株,采用普通PCR方法对金黄色葡萄球菌菌株进行相关毒力基因检测。结果:60株金黄色葡萄球菌菌株中有17株可以引起精子活力明显下降(P0.05);菌株携带的毒力基因主要包括hlg、scn、cna、hlb及clf A,阳性率分别为33.3%、23.3%、20%、20%及18.3%。其他还包括ica A、fnb A、tst、seb、hld、eta、sea。其中,精子制动阳性组的scn基因携带率(47.1%)高于精子制动阴性组(14%),差异具有统计学意义(P0.05);其余毒力基因在两组间携带率均无明显差异(P0.05)。结论:男性生殖系统金黄色葡萄球菌感染能导致精子活力下降,可能与葡萄球菌补体抑制剂编码基因scn相关。     

医用钛板表面涂层2-MPC对细菌生物膜形成的影响

目的探讨医用钛板表面涂层2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine,2-MPC)对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。方法利用化学接枝法制备钛板表面2-MPC涂层并用扫描电镜观察其表面形貌,以金黄色葡萄球菌(ATCC25923)标准菌株作为实验用菌,将已消毒的2-MPC涂层钛板(实验组)及普通钛板(对照组)置入5 mL细菌浓度为1.5×10~6cfu/mL的菌液中共同培养。分别于体外培养后24 h、48 h行膜内活菌计数和扫描电镜观察。结果扫描电镜观察显示通过化学接枝法制备的2-MPC涂层钛板表面形貌光滑,钛板原先的纹理消失。体外培养24 h、48 h实验组钛板表面活菌计数数量均显著少于对照组(P0.05);扫描电镜观察发现24 h、48 h实验组钛板表面细菌黏附量均明显少于对照组(P0.05),且在48 h时实验组钛板表面菌膜形成量明显少于对照组。结论化学接枝法能有效将2-MPC涂层于钛板表面,且2-MPC涂层可以有效抑制钛板表面细菌黏附,预防钛板表面细菌生物膜的形成。     

雌激素对人表皮干细胞增殖与迁移影响的体外实验

目的表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)在体内的微环境十分复杂,雌激素可能是主要的参与者。探讨雌激素对体外培养的hESCs增殖与迁移的影响。方法取自愿捐赠的正常人包皮标本,采用密度梯度离心法分离培养hESCs,并传至第2代。流式细胞仪检测第2代hESCs整合素β1、细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)、CK14和CK10抗原表达以鉴定hESCs。取第2代hESCs 2×106个分别用含0.1 nmol/L雌激素的ESCs专用培养基(A组)、含10 nmol/L雌激素受体阻断剂的ESCs专用培养基(B组)以及普通ESCs专用培养基(C组)进行培养;于培养后24 h刮擦生长融合成片的hESCs,制备宽度为100μm的体外单层hESCs损伤模型。于模型制备后24、48、72 h,倒置相差显微镜下观察各组表皮创面愈合情况(即hESCs迁移情况),并计算模型制备后72 h各组创面愈合率;于模型制备后24、48、72、96、120 h,采用MTT法检测hESCs分裂增殖活性。结果原代培养的hESCs贴壁呈单层卵圆形、集落样生长。流式细胞仪检测第2代hESCs的整合素β1、CK19、CK14呈阳性标记,阳性率分别为96.63%、95.47%、94.27%;CK10呈阴性标记,阳性率为1.32%。模型制备后24、48、72 h,各组均可见hESCs迁移越过创缘,其中A组越过创缘的细胞数多于B、C组,C组多于B组;模型制备后72 h,A、B、C组创面愈合率分别为69.00%±0.05%、35.00%±0.05%、48.00%±0.06%,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。模型制备后24、48、72、96和120 h,A组hESCs分裂增殖活性高于B、C组,C组高于B组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论雌激素具有促进hESCs分裂增殖和迁移的作用,并藉此可能参与皮肤诸多的生物学作用。     

急性期骨科钛合金板表面金黄色葡萄球菌细菌生物膜的结构演变

目的 采用激光共聚焦显微镜及扫描电子显微镜技术动态观察急性期(4周)内不同时相点钛合金板表面金黄色葡萄球菌的生物膜结构。方法 使用骨科钛合金板培养体外金黄色葡萄球菌形成不同时相点的生物膜，在培养1周、2周、3周、4周后取出钛合金板，用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白和碘化丙啶染料将不同时相点的生物膜染色，染色后使用激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察细菌生物膜的形态结构。结果 得到不同时相点的生物膜的激光共聚焦图像及显微电镜图像，1周时细菌胞外少量多糖聚合物形成，内部空间结构杂乱无序，表明形成了早期生物膜。随着培养时间的延长细菌胞外多糖聚合物逐渐增多，内部间隙及孔道相互交通，空间结构逐渐复杂。到4周时大量胞外多糖聚合物形成，膜内结构进一步完善，表明形成成熟的生物膜。各时相点内活菌数目，差异无统计学意义(P>0.05);各时相点间生物膜厚度，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 金黄色葡萄球菌细菌生物膜有早期和晚期区别，从早期生物膜到晚期成熟生物膜是一个动态演变过程，表现为细菌生物膜胞外多糖聚合物及内部空间结构的成熟稳定。     

小干扰RNA沉默Y盒结合蛋白-1基因对肺腺癌A549细胞株表皮生长因子受体表达的影响

目的 观察Y盒结合蛋白-1(YB-1)小干扰RNA (siRNA)对肺腺癌A549细胞株表皮生长因子受体(EGFR)的影响.方法 针对YB-1 mRNA设计特异性siRNA及Control siRNA序列转染至A549细胞株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测空白组、单纯Lipofectamine 2000处理组、Control siRNA组及YB-1 siRNA组细胞中YB-1和EGFR在mRNA和蛋白水平的表达;通过噻唑蓝(MTT)、侵袭实验观察各组细胞的生物学行为变化.结果 RT-PCR和Western blot结果显示实验组YB-1与EGFR的mRNA和蛋白表达降低(分别为0.3820±0.0094、0.4690±0.0032和0.1820±0.0073、0.4210±0.0049),与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).MTT检测转染72 h后YB-1 siRNA组吸光度值为1.34 ±0.11,同时转染48 h后YB-1 siRNA组侵袭能力较对照组明显降低(P＜0.05).结论 YB-1 siRNA能抑制肺腺癌A549细胞株中EGFR的表达,影响肿瘤增殖和侵袭能力.     

庆大霉素脂质体同种异体骨体外抑制金黄色葡萄球菌生物膜的研究

目的 探讨一种新的抗生素缓释系统的制备,为金黄色葡萄球菌生物膜感染的治疗提供新思路. 方法制备庆大霉素阳离子脂质体及兔同种异体骨,并采用低温真空负压吸引法将二者复合,制备成庆大霉素脂质体同种异体骨,并行阳离子脂质体抗生素释放试验.构建金黄色匍萄球菌生物膜模型,于体外探讨由庆大霉素脂质体同种异体骨中释放出的阳离子脂质体庆大霉素对细菌生物膜的抑制作用. 结果成功制备庆大霉素脂质体同种异体骨,可持续释放庆大霉素脂质体达12d,前3 d释放具有爆发效应,所释放的庆大霉素脂质体对金黄色葡萄球菌生物膜生长的抑制作用与新制备的庆大霉素脂质体相似,在低浓度(3.2 mg/L)时二者对金黄色葡萄球菌ATCC 29213生物膜生长的抑制作用均明显强于单独使用庆大霉素(P<0.05). 结论低温真空负压吸引法制备庆大霉素脂质体同种异体骨并不影响所释放的庆大霉素脂质体的抗芮作用,在体外具有高效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的作用,且在低浓度时抑制作用更为明显.     

脂肪干细胞促进人表皮角质形成细胞创面模型愈合的研究

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)促进人表皮角质形成细胞(HEKa)创面模型愈合的可能性.方法 体外培养大鼠ADSCs(rADSCs)(n=10).实验组为rADSCs与HEKa直接共培养组(n=10),对照组为在transwell培养板建立的rADSCs与HEKa间接共培养(间接组,n=8)和单纯HEKa培养组(单纯组,n=8).刮擦生长融合成片的HEKa细胞制备创面.培养24、48、72 h后,计数迁移到创面的HEKa细胞数量并计算创面愈合率,检测HEKa细胞吸收脱氧胸腺嘧啶核苷的放射活性以判定HEKa细胞的增殖活性.结果 实验组、间接组、单纯组在伤后24 h分别有(9.2±0.2)、(5.0±0.3)、(4.2±0.3)个细胞/高倍视野;48 h分别有(58.5±0.4)、(26.5±0.3)、(20.7±0.5)个细胞/高倍视野;72 h分别有(125.8±0.4)、(43.0±0.5)、(35.6±0.5)个细胞/高倍视野越过创缘进入创面,实验组均明显优于两对照组(P<0.05).三组创面愈合率在伤后72 h分别为61.0% ±3.0% 、35.0% ±2.5% 、32.0% ±2.1% ,实验组均明显优于两对照组(P<0.05).脱氧胸腺嘧啶核苷掺入培养基法表明三组HEKa细胞的放射性强度为(1440±210)、(1050±280)、(1130±390)cpm/105细胞,实验组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0.05).结论 rADSCs通过直接接触促进HEKa细胞的分裂增殖和迁移.