TNFα诱导血管内皮细胞HO-1基因表达的受体及细胞内信号机制

目的探讨肿瘤坏死因子(TNFα)对脑微血管内皮细胞(BMVEC)HO-1基因表达的信号转导机制。方法采用TNF受体1敲除的脑血管内皮细胞[BVEC/TNF-RI(-/-)]为研究对象,用RT-PCR法测定TNFα刺激细胞24h后HO-1基因mRNA的表达,用westernblot法检测TNFα对JNK、ERK激酶和转录因子AP-1活性的影响,并用JNK或ERK抑制剂干预上述诱导实验。结果TNFα刺激BVEC/TNF-RI(-/-)HO-1表达增高(P<0.05),此外,TNFα刺激BVEC/TNF-RI(-/-)可引起JNK和ERK激酶表达和转录因子AP-1的活性增强(P<0.05),可是JNK的抑制剂SP600125能减弱TNF诱导的HO-1的表达(P<0.05),而ERK的抑制剂不能。结论TNFR2和JNK激酶对于TNFα诱导的HO-1的表达有重要作用。     

肿瘤坏死因子Ⅱ型受体介导的细胞内信号机制

目的 探讨肿瘤坏死因子(TNFα)通过其Ⅱ型受体介导的细胞内信号机制.方法 采用TNFαⅠ型受体敲除的脑血管内皮细胞[BVEC/TNF-RI(-/-)]为研究对象,用氧化-还原敏感的荧光探针2,7-Dichlo-rofluorescein(DCF)检测细胞内氧化-还原水平,用western blot法检测TNFα对JNK、ERK激酶和转录因子AP-1活性的影响,并用小分子抗氧化剂NAC或JNK、ERK抑制剂干预上述诱导实验.结果 TNFα(5ng/mL)处理24 h.BVEC/TNF-RI(-/-)内活性氧产生增多(P<0.05).此外,TNFα刺激BVEC/TNF-RI(-/-)可引起TNK和ERK激酶表达和转录因子AP-1的活性增强(P<0.05),JNk的抑制剂SP600125能减弱TNFα诱导的AP-1的表达(P<0.05),而NAC、ERK的抑制剂不能.结论 TNFα可通过其Ⅱ型受体介导细胞内活性氧的产生,JNK、ERK激酶的磷酸化和转录因子AP-1的激活.     

氧应激在TNFα诱导血管内皮细胞HO-1基因表达中的作用

目的探讨氧应激在肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导血管内皮细胞血红素氧化酶-1(HO-1)基因表达中的作用。方法RT-PCR法检测小鼠脑血管内皮细胞(BVEC)中HO-1mRNA表达,用氧化-还原敏感的荧光探针2,7-Dichlorofluorescein(DCF)检测细胞内氧化-还原水平。结果TNFα(5ng/ml)作用24h后,BVEC中HO-1的mRNA表达增加136%,但小分子抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC,20mmol/L)能明显阻断TNFα对HO-1mRNA表达的诱导作用;TNFα处理24hBVEC的氧应激水平明显升高,但可被NAC明显抑制(P<0.05)。结论ROS部分介导了TNFα对HO-1基因表达的诱导作用。     

α-玉米赤霉醇对肿瘤坏死因子α诱导的人内皮细胞活性氧产生及其激活信号通路的影响

目的 探讨α-玉米赤霉醇对肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激的人脐静脉内皮细胞中活性氧(ROS)产生及其对激活信号通路的影响.方法 用小分子RNA干扰(siRNA)技术消除人脐静脉内皮细胞的NADPH氧化酶p47phox亚基;用分子探针2,7-DCF测定细胞内ROS的产生量;用RT-PCR测定p47phoxmRNA的表达以及用细胞免疫组化方法测定p47phox蛋白的表达;用Western印迹测定ERK<,2>及核因子(NF)-кB、应激蛋白(SP-1)和活化因子蛋白的表达.结果 TNF-α刺激使细胞内ROS的产生量较对照组高155.4%;α-玉米赤霉醇预处理能够剂量依赖地抑制TNF-α对ROS的诱导效应.TNF-α作用细胞24 h后,p47phox的mRNA表达水平较对照组高212.8%,蛋白的表达也明显高;α-玉米赤霉醇预处理使TNF-α诱导的p47phox mRNA表达水平低63.0%,蛋白表达水平也明显下降.p47phox的siRNA完全阻断TNF-α诱导ROS的产生.α-玉米赤霉醇预处理和p47phox的siRNA均阻断TNF-α对细胞外信号调控激酶的激活和转录因子SP-1的核转位,明显地抑制了NF-кB的核转位.结论 α-玉米赤霉醇能够抑制内皮细胞中TNF-α诱导的ROS的产生及由ROS激活的信号转导通路,主要机制是通过抑制NADPH氧化酶p47phox亚基的表达.     

银杏内酯B对TNFα诱导的人内皮细胞活性氧产生的影响及其机制

目的 探讨银杏内酯B(GB)对TNFα刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中活性氧(ROS)产生的影响及其机制.方法 将预先培养好的HUVECs分组:正常对照组;TNFα刺激组;GB预处理组:分别用GB(25 mg/L),GB(50 mg/L),GB(100 mg/L)预处理细胞1h后再用TNFα刺激24 h;质粒转染组:用转染p47phox的siRNA作用24h后再用TNFα刺激24 h.用小分子RNA干扰(siRNA)技术消除人脐静脉内皮细胞的NADPH氧化酶p47phox亚基;用分子探针2,7-DCF测定各组细胞内ROS的产生量;用RT-PCR、细胞免疫组化及Western blotting等方法检测处理后各组细胞的p47phoxmRNA和蛋白的表达.结果 TNFα刺激使细胞内ROS的产生量较对照组增加了155.4％ (P =0.003);GB(25 mg/L),GB(50 mg/L),GB(100 mg/L)分别使TNFα诱导的HUVECs内ROS的水平降低了9.2％ (P=0.157),35.4％ (P =0.014),48.0％ (P =0.005).TNFα作用细胞24 h后,p47phox的mRNA表达水平较对照组增加了212.8％ (P =0.009),蛋白表达增加了156.2％ (P =0.001);GB预处理使TNFα诱导的p47phoxmRNA表达水平降低了43.6％ (P =0.021),蛋白表达水平降低了53.0％ (P =0.002).p47phox的siRNA完全阻断TNFα诱导ROS的产生.结论 GB能够抑制内皮细胞中TNFα诱导的ROS的产生,主要机制是通过抑制NADPH氧化酶p47phox亚基的表达.     

SP-1在TNFα诱导内皮细胞HO-1基因表达中的作用

目的探讨转录因子SP-1在肿瘤坏死因子TNFα诱导血管内皮细胞血红素氧化酶HO-1基因表达中的作用。方法用ELISA法检测HO-1的蛋白表达,用Westernblot法检测SP-1的蛋白水平。结果TNFα（200U/ml）处理24h后,HUVEC胞内HO-1和AP-1蛋白水平均明显升高;NAC（20mmol/L）预处理可明显抑制胞浆内AP-1及HO-1的蛋白含量（P〈0.05）。结论SP-1部分介导了TNFα对HO-1基因表达的诱导作用。     

α-玉米赤霉醇对肿瘤坏死因子α诱导的人内皮细胞血红素氧化酶1基因表达及胞质游离钙水平的影响

目的 探讨α-玉米赤霉醇对肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血红素氧化酶I(HO-1)表达及胞质游离钙水平的影响及其作用机制.方法 用小分子RNA干扰(siRNA)技术消除HUVEC的NADPH氧化酶p47~(phox)亚基;用分子探针2,7-DCF测定细胞内活性氧(ROS)的产生量;用RT-PCR测定HO-1 mRNA的表达以及用细胞免疫组化方法测定HO-1蛋白的表达;以Fluo-3/AM为探针,用激光共聚焦显微镜测定胞质游离钙整体水平的变化.结果 TNF-α刺激使细胞内ROS的产生量较对照组增加了,155%(228.3±50.6比89.4±23.7,P<0.05);α-玉米赤霉醇预处理旱剂最依赖地抑制TNF-α对ROS的诱导效应;p47~(phox)的siRNA完全阻断TNF-α诱导ROS的产生.TNF-α刺激使细胞内HO-1的mRNA表达水平较对照组增加了145%(0.88±0.10比0.36±0.11,P<0.01),蛋白的表达也明显增加;α-玉米赤霉醇预处理呈剂量依赖地抑制TNF-α对HO-1 mRNA表达的诱导效应;α-玉米赤霉醇预处理及转染p47~(phox)的siRNA均明显降低TNF-α诱导的HO-1蛋白的表达.TNF-α刺激使内皮细胞胞质游离钙整体水平比对照组增加179%(107.3±4.9比38.5±0.6,P<0.01);α-玉米赤霉醇预处理及转染p47~(phox)的siRNA分别使TNF-α诱导的胞质游离钙水平降低46%(58.5±0.3比107.3±4.9,P<0.01)及57%(46.3±2.1比107.3±4.9.P<0.01).结论 ROS仅部分介导TNF-α对HUVEC中HO-1表达的诱导作用,α-玉米赤霉醇主要通过抑制NADPH氧化酶途径产生的ROS而降低TNF-α诱导的HO-1表达及胞质游离钙水平增加.     

重组人生长激素对THP1单核细胞中活化蛋白1转录因子的影响

目的研究重组人生长激素(rhGH)对THP1单核细胞中活化蛋白1(AP-1)转录因子的影响。方法应用荧光素酶报告基因和凝胶电泳迁移率实验检测AP-1在rhGH诱导的单核细胞中的活化程度,用蛋白免疫印迹实验检测细胞外信号调控激酶(ERK)和磷酸化的ERK(p-ERK)的表达。结果与空白对照组比较,LPS组和rhGH组AP-1的转录活性升高(P<0.01);rhGH+脂多糖(LPS)组AP-1的转录活性较LPS组有明显下降(P<0.01)。同时,rhGH和LPS的预处理对ERK无显著影响,但均能促进p-ERK蛋白的表达,rhGH的预处理则能减弱LPS刺激p-ERK蛋白表达。结论 rhGH可通过双向调节ERK的磷酸化而影响THP-1单核细胞中AP-1的转录活性。     

细胞外信号调节激酶在应激性溃疡发病中的作用

目的:探讨细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)在实验性应激性溃疡发病中的作用.方法:采用浸水束缚(water-immersion restraint,WIR)应激实验复制大鼠应激性溃疡模型.检测WIR应激5 min、15 min、30 min、1 h、2 h和3.5 h各时间点的胃黏膜ERK1/2活化情况,并观察特异性ERK1/2抑制剂PD98059预处理(1 mg/kg,iv.)对胃黏膜损伤的影响.采用Western印迹检测ERK1/2和caspase-3表达,激酶活性分析方法检测ERK1/2活性,电泳迁移率变动分析(EMSA)检测转录因子活化蛋白1(AP-1)和核因子κB(NF-κB)DNA结合活性,Northern印迹检测TNF-α和IL-1β mRNA表达,采用溃疡指数(UI)计分和病理学检查评价胃黏膜病变程度, TUNEL技术检测和定量细胞凋亡.结果:正常大鼠胃黏膜仅检测到极微弱的磷酸化ERK1/2表达,WIR应激15 min后胃黏膜ERK1/2即发生活化并于3.5 h后达到峰值.PD98059抑制ERK活化后,胃黏膜AP-1和NF-κB活性及TNF-α和IL-1β mRNA表达显著下调,胃黏膜损伤程度也明显减轻,同时伴有胃黏膜caspase-3活化和凋亡轻度增加.结论:ERK1/2活化在浸水束缚应激诱导的胃黏膜损伤中发挥了重要作用.     

丝裂原活化蛋白激酶通路对脂多糖诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α基因表达的协同调节作用

目的 探讨脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因表达过程中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的协同调节作用及其分子机制。方法 用蛋白激酶活性测定分析LPS刺激RAW264．7细胞引起的激酶活性变化;用报告基因技术和反转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法研究LPS诱导的TNF－α基因转录的分子机制。结果 LPS刺激RAW264．7细胞可引起细胞外信号调节激酶1（ERK1）、c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）和p38MAPK的一过性激活,用MAPK上游激酶的活性突变体分别转染RAW264．7均可不同程度地诱导TNF－α启动子转录活性;而且,这些MAPK通路激活诱导的TNF－α启动子转录活性表现出明显的协同效应;三种MPAPK的无活性突变体均显示出对LPS刺激引起的TNF－α启动子转录激活的抑制效应;RT－PCR的结果证实,ERK、JNK和p38MAPK的特异性抑制剂对TNF－αmRNA表达具有不同程度的抑制作用。结论 LPS刺激引起的TNF－α启动子转录活性增加,可能涉及了ERK、p38和JNK三条通路的激活;这些通路通过协同效应共同发挥对TNF－α基因表达的调控。