荧光定量PCR检测病毒性心肌炎患者血浆循环DNA及其临床意义

目的:利用实时荧光定量PCR技术来检测病毒性心肌炎患者血浆循环DNA水平。方法:分别收集健康人和病毒性心肌炎患者的血浆样本,用实时荧光定量PCR方法检测样本中的血浆循环DNA。结果:病毒性心肌炎患者的血浆循环DNA的CT值为25.22±1.26,明显低于健康人30.66±1.52,有显著性差异(P<0.01)。结论:实时荧光定量PCR技术检测血浆循环DNA可以成为诊断病毒性心肌炎的一种方法。     

多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析

目的建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法。方法收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析。结果新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本。多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11%、0.096%。在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7%(k=0.952)、98.8%(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染。结论新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好。因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义。     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

荧光定量PCR检测手足口病患者血浆循环DNA及其临床意义

目的：利用实时荧光定量PCR技术检测手足口病患者血浆循环DNA水平。方法分别收集健康人和手足口病患者的血浆样本,用实时荧光定量PCR方法检测样本中的血浆循环DNA。结果手足口病患者的血浆循环DNA的CT值为（23.58±1.18）,显著低于健康对照组的（35.66±1.32）（P<0.001）。结论实时荧光定量PCR技术检测血浆循环DNA可以作为诊断手足口病的一种方法。     

结肠癌患者血清miRNA表达谱分析

目的：探讨结肠癌患者血清中miRNA分子的表达差异,寻找潜在的结肠癌诊断分子标记物。方法以12例正常人血清样本为对照组,采用miRNA芯片技术对12例结肠癌患者血清样本的miRNA表达谱进行分析;随后,扩大患者样本量至40例,扩大对照组样本量至45例,采用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)技术对差异表达的miRNA分子进行验证分析。结果芯片结果显示,与对照组比较,结肠癌患者血清miRNA表达谱发生了显著的变化,其中3条miRNA表达水平上调,21条miRNA表达水平下调;Real-time PCR验证实验结果表明,与对照组比较,结肠癌患者血清中miR-508和miR-502-5p的表达水平明显下调。结论 miR-508和miR-502-5p可作为结肠癌诊断的潜在分子标记物进行开发。     

实时荧光定量PCR方法检测石蜡包埋组织microRNA表达的方法探讨

目的:探讨从石蜡包埋组织中运用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法检测microRNA表达的可靠性和敏感性。方法:选取2005年至2010年从石河子大学医学院第一附属医院、新疆伊犁哈萨克族自治州友谊医院收集的97例福尔马林固定、石蜡包埋食管癌组织样本,提取组织总RNA,RT-PCR逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法检测microRNA表达。结果:97例食管癌组织样本中,RNA提取成功90例,7例失败,运用实时荧光定量PCR成功检测了83例microRNA表达,7例检测不准确。RNA提取成功率明显高于失败率,实时荧光定量PCR检出的定量准确例数高于定量不准确例数,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:实时荧光定量PCR(RQ-PCR)方法是检测石蜡包埋组织中microRNA表达的一种有效方法。     

血浆miR-1181在2型糖尿病患者表达水平变化和意义

  目的  miRNA可作为预测糖尿病发生和发展的生物标志物，探索miR-1181在2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)患者的表达情况。  方法  运用Agilent miRNA芯片对T2DM患者（n = 5）和正常对照组（n = 5）血浆样本进行差异筛选，荧光定量PCR技术（quantitative Real Time PCR，qRT-PCR）验证出差异表达的miRNA；通过生物信息学方法预测其靶基因并绘制miRNA-靶基因-代谢通路关系网络图，扩大样本检测血浆中差异表达的miRNA:miR-1181和靶基因MAP2K2、MAPK12表达水平。  结果  miRNA芯片筛选和qRT-PCR验证出与T2DM相关的差异表达miRNA:miR-1181，生物信息学分析得出miR-1181靶基因有CCND1、PI3KR2、MAP2K2和MAPK12；T2DM患者血浆中 miR-1181的表达水平明显下降（P < 0.001），而靶基因MAPK12 mRNA的表达水平明显升高（P < 0.01）。  结论  2型糖尿病患者血浆miR-1181水平降低，可能与其抑制靶基因MAPK12对MAPK通路影响有关。     

微小核糖核酸荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立及其在急性肺损伤中的表达分析

目的探讨微小核糖核酸(miRNA)荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法的建立条件,并运用这一方法对急性肺损伤中miRNAs的表达进行分析。方法设计miRNA特异的颈环结构反转录引物,对miRNA进行反转录,得到miRNA的环状脱氧核糖核酸(cDNA)。分析miRNA cDNA定量PCR过程中的标准曲线和熔解曲线,确定该检测方法的检测灵敏性和特异性。应用miRNA的荧光定量PCR检测方法分析脂多糖(LPS)诱发的急性肺损伤小鼠中miRNA的表达。结果 miRNA特异的颈环结构反转录引物实现了miRNA长度的延长。通过对心肌特异表达的miRNA-1进行实时荧光定量PCR检测,表明miRNA-1是心肌组织特异表达的miRNA。通过该方法对LPS诱发的急性肺损伤小鼠(急性肺损伤组)进行分析,发现与对照组比较,急性肺损伤组的miRNA-23a的相对表达量显著降低(P<0.05),miRNA-155、miRNA-451的相对表达量显著升高(P值均<0.01),miRNA-21的相对表达量未发生改变(P>0.05)。结论本实验建立的miRNA实时荧光定量PCR具有较高的精确性和特异性,通过该方法发现多种miRNA在LPS...     

急性单核细胞白血病特异性miRNA分子标志物的鉴定

目的：鉴定急性单核细胞白血病中特异高表达的microRNA（miRNA）。方法：通过分析急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）与慢性粒细胞白血病细胞系（K562）的miRNA-seq数据,筛选一批在THP-1细胞系中显著高表达的miRNA,通过实时荧光定量PCR技术对这些miRNA在THP-1和K562细胞系中进行验证,获得在THP-1细胞系中特异高表达的miRNA,再通过实时荧光定量PCR技术在急性单核细胞白血病患者骨髓样品中进行验证,鉴定有望应用于该类疾病临床诊断的分子标志物。结果：最终筛选得到了3个在急性单核细胞白血病中特异高表达的miRNA分子标志物：let-7d-5p、miR-222-3p、miR-221-3p。结论：通过结合组学数据,利用实时荧光定量PCR技术在细胞系及临床样本中的验证,最终鉴定了3个在急性单核细胞白血病中特异高表达的miRNA分子标志物。     

应用MGB探针检测人丙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人丙型肝炎病毒（HCV）的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HCV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PCR引物及探针,为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物先进行基因克隆,而后制备病毒样颗粒做为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达100IU/mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HCV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可定性检测血浆或血清样本及血液制品中的人丙型肝炎病毒HCV的基因型及含量,对于该疾病的研究及临床治疗都具有重要的意义。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD_(58)基因的表达

目的:应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法:提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMCCD58基因的表达水平,同时检测血清ALT、AST水平。结果:乙型肝炎各组患者PBMCCD58mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMCCD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达;乙型肝炎患者PBMCCD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

骨髓间充质干细胞对软骨诱导分化过程中microRNA调控机制

目的:探讨microRNA(miRNA)在骨髓间充质干细胞对软骨诱导分化过程中的调控机制。方法:以大鼠骨髓中分离出的骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为研究对象,用转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导MSCs软骨分化,利用基因芯片技术检测软骨诱导分化过程中miRNA表达情况,并用实时荧光定量PCR验证;采用SAM软件筛选出软骨诱导过程中差异表达的miRNA。结果:基因芯片技术共筛选出BMSCs向软骨分化过程中9个表达差异miRNA,其中表达上调的共有7个,分别为miR-34a、miR-130b、miR-193b、miR-30a、miR-152、miR-90a、miR-99a;表达下调的共有2个,分别为miR-424、miR-135。选择软骨诱导分化过程中表达明显升高的miR-130b、miR-193b,及表达明显降低的miR-424、miR-135;在原样本中进行实时荧光定量PCR,结果显示实时荧光定量PCR验证结果与基因芯片结果一致,证实了芯片结果真实可信。结论:高表达的miR-34a、miR-130b、miR-193b、miR-30a、miR-152、miR-90a、miR-99a和低表达的miR-424、miR-135共同参与了骨髓间充质干细胞软骨分化的调节过程。     

母体体重与妊娠中期母体循环中游离胎儿DNA水平负相关

目的:分析母体血浆及血清中游离胎儿D NA的技术在临床上应用得非常广泛,但是应用胎儿D NA行产前筛查,需要掌握那些能够影响母体循环中胎儿DN A水平的参数情况。本研究评估了所选择的人口统计学因素对妊娠早、中期胎儿D N A水平的影响。方法:建立一个包括胎儿D NA水平及孕妇年龄、种族、体重和吸烟史临床信息的数据库。通过采用实时定量PCR法扩增Y染色体上特殊序列来测量母体血浆或血清中胎儿DN A水平,分析妊娠早期新鲜的血浆样本和预先冷冻的妊娠中期的血清样本中胎儿DNA水平,根据妊期及样本储存时间对胎儿DNA水平进行校正,接着…     

肺炎衣原体实时定量PCR检测方法的建立

目的:探讨实时定量PCR检测肺炎衣原体(chlamydia pneumonia,Cpn)的方法.方法:根据GenBank提供的肺炎衣原体基因序列,选取高特异性和保守型的区域进行引物设计,并建立实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)的检测方法.同时用肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒对Cpn引物的特异性进行分析.对呼吸道感染患者200个咽拭子样本和68个肺泡冲洗液样本进行检测,以荧光抗体检测法作对照,评价实时定量PCR检测Cpn的准确性.结果:Cpn PCR引物对肺炎支原体、肺炎双球菌、流感病毒、副流感病毒以及腺病毒均显示阴性,对Cpn显示为阳性,特异性良好;荧光实时定量PCR技术检测的准确性优于荧光抗体检测法.结论:荧光实时定量PCR技术检测Cpn体灵敏度高、周期短,可作为临床诊断Cpn的手段.     

新鲜与陈旧外周抗凝血中miRNA表达变化的研究

目的 比较新鲜与陈旧外周抗凝血中miRNA(microRNA)表达的变化.方法 取5份新鲜及6份陈旧外周抗凝血液样本,提取全血总RNA并测定其纯度与浓度,应用实时定量RT-PCR技术分析外周血中miRNA的表达变化.结果 经过核酸蛋白定量仪检测,新鲜与陈旧外周抗凝血液中总RNA A260/280值为1.8～2.0范围内.实时荧光定量RT-PCR的结果显示:新鲜与陈旧的外周抗凝血液中miRNA RNAU6-2的相对拷贝数差异无统计学意义.结论新鲜与陈旧外周抗凝血液中miRNA RNAU6-2均有表达且无差异.     

急性单核细胞白血病全基因组微小RNA的表达谱分析

目的研究急性单核细胞白血病（AMoL）全基因组的微小RNA（miRNA）表达谱。方法应用Illumina高通量测序技术对10 例AMoL 患者和10 例非恶性血液病患者骨髓样本的miRNA 表达水平进行检测,分析两者的表达差异,并通过茎环引物实时荧光定量PCR（Stem-loop qPCR）技术对部分Illumina 测序结果进行验证。结果两组样本共发现差异表达的miRNA 285个,其中,199 个miRNA 在AMoL组呈表达上调,86 个miRNA呈表达下调。6 个miRNA 的Stem-loop qPCR 验证结果与其测序结果具有相同的变化趋势。结论miR-126-3p 和miR-29b-3p 可作为潜在的分子靶点用于AMoL发病机制的进一步研究。     

两种游离DNA检测方法的比较研究

目的：对比评价人血清游离DNA的分支DNA（bDNA）检测和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测方法。方法：收集44例人血清标本,分别运用bDNA技术和荧光定量PCR检测其游离DNA浓度,对2种方法检测结果做分析比较。同时采用bDNA技术分别检测其中10例血清和血浆游离DNA含量。结果：bDNA技术的检测结果和荧光定量PCR具有较高的相关性（r=0.7077,P〈0.0001）;血清较血浆具有较高的游离DNA的水平。结论：bDNA操作简便且结果可信,适用于人群大规模筛查游离DNA水平。     

荧光定量PCR与半定量PCR检测猕猴不同器官组织中黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的mRNA表达差异的比对

目的 分析荧光定量PCR 与半定量PCR 检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶（XDH/XO）的mRNA的相对表达量的差异,其结果具有一定的参考价值。方法 提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总RNA,使用相同的引物序列及内参基因,分别用荧光定量PCR 与半定量PCR 进行相对定量检测,结果做比对分析。结果 两种检测方法的特异性没有差异,荧光定量PCR较半定量PCR灵敏性高,均显示猕猴不同组织XDH/XO的mRNA表达在肝脏组织中表达水平最高,对于表达量较低的其他组织,荧光定量PCR 与半定量PCR检测结果有一定差异。结论: 荧光实时定量PCR优于半定量PCR 法。     

血清miRNA表达水平检测与原发性肝癌早期诊断的研究

目的 对血清样品miRNA表达水平变化的实时定量PCR检测进行观察,同组织样品的miRNA的变化趋势进行比较,以评价血清miRNA在原发性肝癌早期诊断中的价值.方法 通过荧光定量PCR检测miRNA-125a、-200a、-199a等3个有代表性的miRNA指标在正常和癌变样品中的变化,验证组织及血清两类样品中miRNA的变化趋势,分别取癌旁组织和癌组织以及正常人与癌症患者血清为材料.结果 肝癌患者血清是正常对照血清中miRNA的含量的10%～15%,肝癌组织中的miRNA含量是癌旁组织的10%～20%,而且血清miRNA的变化趋势与组织miRNA较一致.结论 血清miRNA可以反映原发性肝癌的发生,说明血清miRNA非常有可能成为一种新的生物标记物用于原发性肝癌的早期诊断.     

应用实时荧光定量PCR检测血清miR-122和miR-22及其在慢性乙型肝炎患者中的表达

目的 建立血清中microRNA(miRNA)的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的检测方法,对慢性乙型肝炎患者血清中miR-122和miR-22的表达水平进行检测和分析,探讨其在慢性乙型肝炎患者血清中表达的意义。 方法 茎环引物用于成熟型miRNA反转录,以建立SYBR Green Ⅰ PCR筛选和定量检测miRNA的方法。同时,采用10倍梯度稀释的miR-122标准品cDNA(1~10⁹拷贝/微升)评价其敏感度;采用熔解曲线评价其检测miRNA的特异性;通过对2×10⁵、2×10⁶、2×10⁷拷贝/微升的miR-122标准品cDNA分别进行批内20次重复实验,以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度。采用建立的qRT-PCR技术检测慢性乙型肝炎患者及正常人血清中miR-122和miR-22的表达水平。 结果 建立了茎环引物的RT-PCR法检测血清中的miRNA,该方法的线性范围宽,敏感度高,重复性好,方法简便。在慢性乙型肝炎患者组中血清miR-122和miR-22的相对表达量分别为17.88和5.35;与正常对照组中血清miR-122和miR-22的相对表达量(分别为1.80和1.67)比较,差异有统计学意义(P均=0.000)。 结论 建立了茎环引物RT-PCR实时荧光定量PCR方法检测血清中的miR-122和miR-22,血清miR-122和miR-22在慢性乙型肝炎患者的血清中表达显著升高。