人脑源性神经营养因子及神经营养素—3重组腺病毒的构建及鉴定

目的：构建人脑源性神经营养因子和神经营养素－３重组腺病毒，使其携带神经营养因子感染神经系统细胞，在局部释放有生物活性的营养因子。方法：Ｕ针人全长ＢＤＮＦ与ＮＴ３基因分别插入ｐＣＤＮＡ３载体，然后将表达序列ＣＭＶ－ＢＤＮＦ－ＢＧＨｐＡ和ＣＭＶ－ＮＴ３－ＢＧＨｐＡ切下，插入Ｅ１区缺失的腺病毒载体ｐＨΔＥｌｓｐ１Ａ中，与ｐＪＭ１７共转染２９３细胞，通过同源重组产生重组腺病毒。结果和结论：经过二次ＣｓＣｌ     

人白细胞介素15基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：分离编码人ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ并大肠杆菌中克隆与表达，方法：采用ＰＨＡ刺激人外周血白细胞提取ｍＲＮＡ，并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法获得ｈＩＬ－１５的ｃＤＮＡ将其定向插入ＰＵＣ１９载体中，ＤＮＡ序列分析表明分离的ｈＩＬ－１５的序列与文献报道一致，以ｐＢＶ２２０为表达载体构建并筛选出重组于ｐＢＶｈＩＬ－１５；重组子转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株，经４２℃诱导表达。结果：相对分子质量为１４０００的ｈＩＬ     

可溶性E—选择素cDNA基因克隆及其真核表达

从ｐＵＣ１８／Ｅ－选择素重组质粒经ＰＣＲ扩增得到可溶性Ｅ－选择素ｃＤＮＡ基因，将此基础插入到痘苗病毒表达载体ｐＪＳＡ１１７５的Ｓｍａ Ｉ位点，构建了正向表达质粒ｐＪＳＡ１１７５．可溶性Ｅ－选择素，采用脂质供共转染的方法，将上述质粒转染ＴＫ＾－１４３细胞。     

人β—干扰素在杆状病毒载体与Sf细胞体系中的表达

采用苜蓿尺蠖核多角体病毒ＤＮＡ中多角体蛋白基因启动子及其前后序列作为转移载体，将人β－干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）基因插入转移载体ｐＵＡｃ－５，构建成ｐＡｃ－ＩＦＮ－β载体。该质粒ＤＮＡ与野生型ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ经ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ共转染秋粘虫传代细胞（Ｓｆ９细胞），利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征，进行病毒空斑筛选。用核酸杂交方法鉴定出携带ＨｕＩＦＮ－β基因的重组病毒。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞，     

人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒pcDNA3—hEGF的构建

目的：构建人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因真核表达质粒，为深入研究ｈＥＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈＥＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增；提纯及纯化ｐＵＣ１８－ｈＥＧＦ质粒；经ＤＮＡ序列分析其所含ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ；限制性酶切ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ片段，连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内，克隆出真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈ     

人CD40分子基因的克隆及其在COS—7细胞中的表达

目的：克隆编码人ＣＤ４０分子基因的全长ｃＤＮＡ,在ＣＯＳ－７细胞中获得高表达。方法：提取人Ｂ淋巴细胞看Ｄａｕｄｉ总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆了编码人ＣＤ４０基因全长ｃＤＮＡ,序列测定证实其正确性。将测序正确的ＣＤ４０基因克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１构建重组表达载体。采用脂质体转染试剂脂染胺（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）杂ＣＯＳ－７细胞,用流式细胞仪,免疫细胞化学和免疫荧光法检测ＣＤ４０基     

人β－干扰素在杆状病毒载体与Sf细胞体系中的表达

采用苜蓿尺蠖核多角休病毒（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ中多角体蛋白基因启动子及其前后序列作为转移载体，将人β－干扰素（ＨｕＩＦＮ－β基因插入转移载体ｐＵＡｃ－５，构建成ｐＡｃ－ＩＦＮ－β载体。该质粒ＤＮＡ与野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ经ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ共转染秋粘虫（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）传代细胞（Ｓｆ９细胞），利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征，进行病毒空斑筛选。用核酸杂交方法鉴定出携带ＨｕＩＦＮ－β基因的主组病毒。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞，可表达ｒＨｕＩＦＮ－β。在１．０×１０￣６细胞／ｍｌ感染上清中测定ｒＨｕＩＦＮ－β最高活性为３．０×１０￣６ＩＵ／ｍｌ，抗天然ＨｕＩＦＮ－β抗体能完全中和ｒＨｕＩＦＮ－β的抗病毒活性。     

反义bcr／ab1重组逆转录病毒表达载体的构建及其转染对K562细胞系的影响

用逆转录聚合酶链反应技术从Ｋ５６２细胞系中扩增出ｂｃｒ／ａｂ１融合区２５３ｂｐＤＮＡ片段，经反复连接与克隆，得到含同方向串联的２、３和４个拷贝的该融合基因片段的克隆载体ｐＵＣｓ。这些片段分别反向连接到逆转录病毒表达载体ｐＤＯＲｎｅｏ。ＤＮＡ序列分析、限制性内切酶分析和菌落原位杂交证实：不同拷贝数的ｂｃｒ／ａｂ１融合区基因片段已反向插入ｐＤＯＲｎｅｏ。利用脂质体介导，将重组质粒导入Ｋ５６２细胞系后，观察到转染细胞的增殖明显被抑制     

抗结肠癌抗体重链可变区和k轻链基因的克隆

目的：从一株抗结肠癌细胞系ＬＳ１７４Ｔ的单抗细胞株ＣＬ－４中克隆出抗结肠癌抗体重链可变区和ｋ轻链基因，方法：用一步法提取总ＲＮＡ，逆转录形成ｃＤＮＡ，设计并合成一套扩增小鼠抗体重链可变区和完整ｋ轻链的通用引物，通过ＰＣＲ扩增基因，分别克隆入ｐＵＣ１９，作核苷酸序列分析，结果：用重链引物扩增获得长的３６０ｂｐ的片段，用轻链引物扩增获约６４０ｂｐ的片段，序列测定获得它们的ＤＮＡ序列，结论：克隆的重链可     

人转化生长因子β1基因非翻译区的改造及其全长序列测定

通过ＰＣＲ和体外重组技术对ＴＧＦβ１基因５＇和３＇非翻译区进行了改造，在此基础上，通过构建缺失突变体，采用双脱氧终止法，利用ｐＵＣ／Ｍ１３系统测定了人ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ的全长序列。这为今后研究不同长度非翻译区对ＴＧＦβｃＤＮＡ表达水平的影响并实施其高效表达奠定了基础。     

HP培养滤液诱导下抑制bcl-2基因表达对SGC7901细胞端粒酶活性的影响

目的:探讨bcl-2表达与hTERT、端粒酶活性之间的调控关系,了解HP的致癌机制。方法:在HP培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测bcl-2AODN抑制bcl-2基因之后人SGC7901细胞hTERT蛋白的表达。结果:对照组人SGC7901细胞24h、36h和48h表达hTERT蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于经HP培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P<0.05)。在HP滤液诱导下,抑制bcl-2基因的SGC7901胃癌细胞24h、36h和48h表达hTERT蛋白的阳性细胞数和荧光指数显著低于与SGC7901胃癌细胞(P<0.05),同时显著高于对照组(P<0.05)。结论:bcl-2基因正向调控hTERT蛋白表达,bcl-2表达上调可能是端粒酶活化的主要途径之一。端粒酶的激活不完全依赖于bcl-2途径,还存在其他的调控因素。HP感染不仅通过上调bcl-2的表达,还可以通过其他途径激活端粒酶,这可能是HP感染致癌的一条重要途径。     

人源汉坦病毒H8205株S基因NP编码区的序列测定及其NP强抗原性的分子生物学分析

目的：确定人源汉坦病毒Ｈ８２０５株在汉坦病毒属中的分类地位及找出其核衣壳蛋白（ｎｕ－ｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ,ＮＰ）强抗原性的分子生物学基础。方法：采用半套式ＲＴ－ＰＣＲ扩增Ｈ８２０５Ｓ基因核衣壳蛋白（ＮＰ）编码区,克隆于载体ｐＢＶ２２０中并进行序列测定,测序结果用ＰＣＧＥＮＥ分析。结果：Ｈ８２０５株Ｓ基因ＮＰ编码区为１２９０ｂｐ（含两端引物序列）,与７６－１１８株核苷酸的同源性为８３．０％,氨基酸的同源性为９６％;ＮＰ的亲水性结构图与７６－１１８株的相似,但３个最高峰不同,Ｈ８２０５株的ＮＰ在Ｎ端有一个高度亲水性结构中心,计算机分析预测此区为一个非常强的抗原决定簇。结论：本研究从分子生物学角度证实Ｈ８２０５为ＨＴＮ型,Ｈ８２０５株ＮＰ强抗原性和免疫原性可能与Ｎ端的高度亲水性结构中心有关     

幽门螺杆菌长期感染蒙古沙土鼠导致胃炎、胃溃疡的实验研究

目的：用幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)长期感染蒙古沙土鼠建立胃炎、胃溃疡的动物模型。方法：蒙古沙土鼠经过禁食、禁水预处理之后，采用国际标准菌株H.pylori ATCC 43504灌胃，在末次灌胃动物后4，8，12，24，48，52周分别对H.pylori感染组和正常对照组蒙古沙土鼠的胃黏膜进行H.pylori形态学(涂片和细菌培养)、H.pylori快速尿素酶检测、H.pylori特异性PCR检测和病理组织学观察，并对血清中抗H.pylori IgG抗体进行了检测。结果：H.pylori感染组动物以上各项指标均为阳性，表明已经感染H.pylori；而正常对照组则以上各项均为阴性。病理组织学观察表明感染组8周即可见到慢性炎症性病变，12周时黏膜层和黏膜下层可见到淋巴滤泡，24周胃窦部可见到胃溃疡。结论：H.pylori ATCC 43504可以长期定植于蒙古沙土鼠腺胃，能够产生与H.pylori感染人胃黏膜相似的病理改变。     

小鼠AMCase基因突变体的cDNA克隆及序列分析

目的 克隆小鼠酸性哺乳动物几丁质酶（AMCase）,并进行序列分析。方法 从BALB/c小鼠胃组织中提取总RNA,逆转录成cDNA,运用PCR技术体外扩增获得AMCase基因，构建pMD18T／AMCase重组载体，测序后应用DNAMAN4.0软件与标准序列进行比较，并通过SignalP 3.0和TMHMM Serverv．2.0等服务器对等电点、氨基酸组成、信号肽和跨膜结构等特征进行分析。结果 所克隆基因共编码473个氨基酸,分子量为51．93kD。等电点为4．73。与AMCase同源性达99．57％，同属18家族的几丁质酶成员，由信号肽（氨基酸1～21）、催化区（氨基酸22～391）、铰链区（氨基酸392～425）和结合区（氨基酸426～473）组成。编码的蛋白质在催化区和铰链区分别发生了突变。292位氨基酸由Ala（丙氨酸）突变为Pro（脯氨酸），404位氨基酸由Thr（苏氨酸）突变为Ser（丝氨酸）。结论 所克隆的基因为AMCase的一个突变体。其相关生物学信息的明确,为今后运用分子生物学技术进一步深入研究其作用奠定了基础。     

PCR法检测牙髓中的幽门螺杆菌

目的：检测人牙髓标本中幽门螺杆茵(Helicobacter pylori，H．pylori，Hp)的存在情况，探讨Hp与牙髓病变的相关性以及Hp的传播途径及传播方式。方法：实验分为五组，共计79例标本，前四组取根髓，第五组取龈下牙石。采用聚合酶链反应(PCR）检测不同病情下人牙髓及龈下牙石标本中的Hp。结果：经x^2检验各牙髓组问Hp检出率无显著性差异；而牙髓组与龈下牙石组间Hp检出率均有显著性差异。结论：人牙髓是Hp的一个孽生地；推测牙髓中Hp的驻留可能是Hp不易清除及相关疾病易于复发的原因。     

Hp培养滤液诱导下抑制hTERT基因对SGC7901细胞bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨bcl-2表达与端粒酶活性二者之间的调控关系,了解Hp的致癌机制。方法:在Hp培养滤液诱导前后,采用流式细胞仪检测抑制hTERT基因之后SGC7901胃癌细胞bcl-2蛋白的表达。结果:对照组SGC7901胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数显著低于经Hp培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组(P<0.05)。在Hp滤液诱导下,抑制hTERT基因的SGC791胃癌细胞24 h、36 h和48 h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数与SGC7901胃癌细胞无显著差异(P>0.05)。结论:Hp感染可以促进bcl-2蛋白表达,这可能是Hp感染致胃癌的重要机制之一。端粒酶活化不参与调控bcl-2蛋白表达。     

Hp培养滤液诱导下抑制hTERT基因对SGC27901细胞bcl-2蛋白表达的影响

目的：探讨bcl-2表达与端粒酶活性二者之间的调控关系，了解Hp的致癌机制。方法：在Hp培养滤液诱导前后，采用流式细胞仪检测抑制hTERT基因之后SGC7901胃癌细胞bcl-2蛋白的表达。结果：对照组SGC7901胃癌细胞24h、36h和48h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数显著低于经Hp培养滤液诱导的SGC7901胃癌细胞组（P〈0．05）。在Hp滤液诱导下，抑制hTERT基因的SGC791胃癌细胞24h、36h和48h表达bcl-2蛋白的阳性细胞率和荧光指数与SGC7901胃癌细胞无显著差异（P〉0．05）。结论：Hp感染可以促进bcl-2蛋白表达，这可能是Hp感染致胃癌的重要机制之一。端粒酶活化不参与调控bcl-2蛋白表达。     

尖吻蝮蛇去整合素基因克隆与功能分析

目的：获得尖吻蝮蛇去整合素基因，并分析重组蛋白生物学活性。方法：提取尖吻蝮蛇毒腺组织总RNA．经RT—PCR获得去整合素基因片段。将该去整合素基因片段重组入pMAL-p2x栽体中诱导表达，以直链淀粉树脂柱亲和纯化，并检测融合蛋白的抑制血小板聚集活性。结果：谊片段编码的氨基酸序列中含有去整合素保守的RGD三肽序列及12个Cys残基，与GenBank中其他蛇毒去整合素氨基酸序列最高同源性为86％，重组融合蛋白具有抑制ADP诱导的血小板聚集活性。结论：发现了一个新的去整合素基因，谊基因编码蛋白具有抑制血小板聚集的功能。     

人源汉坦病毒H8205株M基因序列分析及其分类地位的研究

目的 :测定汉坦病毒H82 0 5株M基因全序列并对其分类地位进行探讨。方法 :从感染H82 0 5株病毒的鼠脑中提取RNA ,经RT PCR扩增M基因全序列 ,克隆到 pGEM TEasy载体中测序 ,与汉坦病毒属的各型标准株进行同源比较 ,构建系统进化树 ,并与汉滩型中已知的 7株病毒进一步比较 ,确定H82 0 5株的分类地位。结果 :H82 0 5株M基因由 36 15个核苷酸组成 ,编码1135个氨基酸 ;同源性分析显示该株病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属中的汉滩型 (HTN) ,但与同型中其他毒株的亲缘关系较远。结论 :H82 0 5株是不同于已知汉滩型毒株的一个新亚型 ,表明我国的汉滩型病毒存在不同亚型     

幽门螺杆菌致胃黏膜癌变的分子机制

幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H .pylori)是导致胃癌发生的重要病因学因素 ,已被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌原。H .pylori导致胃癌发生的分子机制尚不清楚。日益增多的资料显示 ,H .pylori导致胃癌发生的分子机制涉及到细胞的增殖与凋亡 ,端粒酶活性的改变 ,基因不稳定性和甲基化状态的异常改变等。本文介绍了H .pylori相关胃癌发生分子机制的研究进展。