免疫聚合酶链反应检测方法初探

为了提高抗原抗体检测的灵敏度，利用生物素亲和素系统对免疫聚合酶链反应（免疫－ＰＣＲ）检测方法的建立做了初步探索。结果表明，免疫－ＰＣＲ可检测到少至１００ｆｇ的抗原，比酶联免疫吸附试验平行对照高１０００倍。该法仅限于实验模型的建立，其实际应用价值还有侍于深入研究。     

土拉弗氏菌的PCR检测

土拉弗氏菌的ＰＣＲ检测翟俊辉，杨瑞馥，郭兆彪，鹿建春，张松乐，陈梅玲，车凤翔土拉弗氏菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）是引起土拉弗氏菌病（土拉热、野兔热）的病原体，它是一种革兰氏阴性的球杆菌，生长缓慢，分离困难［１～４］。我们根据公开发...     

中国鼠疫自然疫源地分型研究Ⅳ.鼠疫耶尔森菌生物型生物学特征的探讨

鼠疫菌生物型是鼠疫菌起源进化遗传性状最稳定的生物学标准, 是鼠疫起源进化普系的“活化石”, 也是该菌起源进化最具代表性的模式.依据其对甘油和阿拉伯糖的酵解和还原硝酸盐的能力, 鼠疫菌可分为4种生物型, 即古典型(甘油酵解阳性, 阿拉伯糖酵解阳性, 硝酸盐还原阳性)、中世纪型(甘油酵解阳性, 阿拉伯糖酵解阳性, 硝酸盐还原阴性)、东方型(甘油酵解阴性, 阿拉伯糖酵解阳性, 硝酸盐还原阳性)和田鼠型(甘油酵解阳性, 阿拉伯糖酵解阴性, 硝酸盐还原阴性).前三种生物型与人类历史3次鼠疫大流行相对应, 最后一种生物型对人不致病, 但能造成田鼠鼠疫并在其自然疫源地内流行.目前中国鼠疫自然疫源地有4种鼠疫菌生物型.     

从外环境分离军团杆菌的研究

我们通过腹腔注射嗜肺军团杆菌(Lp)感染豚鼠证明,感染后第4～5天剖杀取脾和肺脏新鲜切面压印于BCYE_α培养基是再分离Lp的最佳条件,又比较了离心和钾明矾絮凝两种集菌法对再分离Lp的影响,结果发现后者分离效果好。从而摸索出从外环境分离军团杆菌的合适程序:钾明矾絮凝—豚鼠—BCYE_α培养基。为了验证此法的实际应用价值,我们从北京某两宾馆空调系统采集水样29份,分离出6株Lp,说明这一方法是可行的。     

杜克雷嗜血杆菌血红蛋白受体和其部分蛋白片段的表达纯化及其多克隆抗体建立ELISA检测杜克雷嗜血杆菌的初步研究

目的:制备纯化杜克雷嗜血杆菌血红蛋白受体(HgbA)及其部分蛋白片段(HgbAF),免疫家兔获得rHgbA和rHgbAF特异性多克隆抗体,用于临床软下疳病原学诊断.方法:采用分子生物学技术克隆HgbA和HgbAF基因,诱导表达并纯化rHgbA和rHgbAF;用rHgbA和rHgbAF免疫家兔制备多克隆抗体,采用Western blot和ELISA方法测定抗体免疫活性;建立杜克雷嗜血杆菌HgbA双抗体夹心ELISA检测系统,对其敏感性、特异性进行初步评价.结果:成功克隆了目的基因,经诱导表达获得纯化杜克雷嗜血杆菌rHgbA及其部分重组蛋白片段;免疫家兔获得rHgbA和rHgbAF特异性抗血清,经饱和硫酸氨盐析后,Western blot实验结果显示其能与rHgbA和rHgbAF特异性结合;建立的杜克雷嗜血杆菌HgbA双抗体夹心ELISA,对杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌及其他7种生殖器溃疡相关的细菌进行检测,发现除杜克雷嗜血杆菌呈现强阳性反应外,其余8种菌均为阴性结果,无交叉反应发生;上述ELISA检测纯化rHgbA灵敏度为1.56 ng/ml,杜克雷嗜血杆菌检测灵敏度为2×105 cfu/ml,脓汁模拟样本中杜克雷嗜血杆菌检测的灵敏度为1×106 cfu/ml.结论:成功制备了杜克雷嗜血杆菌血红蛋白受体及其部分蛋白片段,免疫家兔所获得的多克隆抗体能与杜克雷嗜血杆菌特异性结合,而与流感嗜血杆菌及其他7种生殖器溃疡相关的细菌无交叉反应,表明建立的ELISA具有较好的特异性.上述ELISA检测方法的敏感性水平不能满足临床所有标本中杜克雷嗜血杆菌的检测,有待于进一步提高,但该方法的建立具有潜在临床应用价值.     

鼠疫耶尔森氏菌荧光标记扩增片段长度多态性分型方法

目的 建立荧光标记扩增片段长度多态性(FAFLP)技术平台，探讨鼠疫菌基因分型。方法 用5种核酸限制性内切酶消化鼠疫菌基因组DNA，选择最佳内切酶组合，酶切片段经接头连接后，用荧光素标记的5条EcoRⅠ引物和9条MseⅠ引物组成的引物配对扩增，选择最佳引物组合，进行系列PCR条件的优化。扩增产物经ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(遗传分析仪)检测，GeneScan等软件进行分析。结果 成功建立FAFLP技术平台。结论 FAFLP具有快速、简便、廉价、分辨率高、重复性好和污染少的优点，可用于鼠疫菌的基因分型分析。     

防污染PCR-微孔板杂交检测布鲁氏菌方法研究

目的 建立防污染PCR—微孔板杂交—EIA检测技术，并用于布鲁氏菌及其模拟感染组织中细菌的检测。方法 根据布鲁氏菌31kD热休克蛋白和外膜蛋白2B(OMP2B)基因设计引物，筛选合适引物，并建立用服嘧啶糖基化酶防污染的PCR扩增—微孔板杂交与酶联显色检测布鲁氏菌的方法，并用于模拟污染布鲁氏菌动物脏器标本的检测。结果 根据布鲁氏菌31kD热休克蛋白和外膜蛋白2B基因设计的引物，建立了复合PCR，同时检测2个基因的存在，并发现不同引物序列对PCR扩增敏感性影响较大，可以相差1000倍。用0．5U的UDG可以防止10^8产物的污染，微孔板杂交—酶联显色检测比单纯PCR—电泳敏感10倍。将该体系用于污染动物脏器的检测，可以检测出反应体系中2—200个细菌的存在。结论 研究的防污染PCR—微孔板杂交—EIA试剂克服了目前PCR试剂运输不便、产物污染所致假阳性和判定结果欠客观的缺点，为布鲁氏菌的快速检测提供了一个有力手段。     

传染病防控研究：机遇与挑战

进入21世纪,我们仍然面临着“老传染病持续存在、曾一度被控制的传染病又死灰复燃、新传染病不断出现、已知病原的耐药性急剧增加”等严峻挑战。社会的发展和技术的进步,对传染病的预防和控制提出了更高的要求[1]。2001年美国“911”恐怖袭击后的“炭疽芽孢邮件”事件促进了以精确溯源为目标的新学科——微生物法医学的诞生[2]。由中华医学会中华预防医学杂志编委会和中国微生物学会分析微生物专业委员会联合发起的“传染病防控基础研究与应用技术论坛”于2010年在舟山召开了第1届研讨会,2011年在厦门召开了第2届研讨会[3],旨在围绕传染病的监测与预警、检测与鉴定、分型与溯源、预防与控制等不同领域开展学术交流,促进国内传染病防控能力的提高。本期推出的传染病重点号稿件是从第2届会议投稿中遴选的具有代表性的论文,涵盖了监测、分子分型、病原毒力基因鉴定、疫苗相关研究等内容,希望这些论文对读者有所帮助。     

应用O-抗原基因簇特异PCR对假结核耶尔森菌分型

目的：依据假结核耶尔森菌O-抗原基因簇多态性，应用PCR基因分型方法替代传统的血清分型方法，时本室保存的31株假结核耶尔森菌进行分型研究。方法：通过比较假结核耶尔森菌与已知血清型假结核耶尔森菌标准参考株O-抗原基因簇的差异，确定实验株的血清型。结果：应用PCR基因分型方法替代传统的血清分型方法，对本室保存的31株假结核耶尔森菌进行了成功的血清分型，血清组Ⅰ-Ⅴ与血清型0：1～0：5存在着对应关系。结论：应用PCR方法对假结核耶尔森菌进行血清分型，方法简单、迅速，同时不需要制备特异抗血清，是一种理想的血清分型替代方法。     

鼠疫耶尔森菌pgm位点及其侧翼序列遗传变异的比较分析

目的研究鼠疫耶尔森菌中国自然分离株pgm位点及其侧翼序列的变异，了解不同疫源地菌株间的毒力差异，为鼠疫防治提供帮助。方法比较分析现有4株菌的pgm位点及其侧翼序列的变异，采用PCR、等位基因特异性PCR扩增260株中国自然分离株和7株假结核耶尔森菌。结果除锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株外，其他菌株均缺失了YPl666的70～87bp之间的18bp碱基。1406bp处T的缺失仅存在于东方型菌株中。北天山东段型及西段A、B型，锡林郭勒高原型，青海田鼠型菌株的pgm位点下游都没有IS100插入；锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株的色素沉着区有1个IS285插入，在其下游3kb区域还有1个IS100插入。冈底斯山型和昆仑山A、B型菌株的pgm位点上游侧翼区与其他菌株不同。36株菌的pgm位点缺失，缺失的菌株主要集中在鄂尔多斯高原型，松辽平原B型，昆仑山A、B型4种生态型菌株中。结论北天山东段型及西段A、B型，锡林郭勒高原型，青海田鼠型菌株是中国鼠疫耶尔森菌中比较古老的菌株。锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株是一个独特的分支，建议归为第4个生物型——田鼠型。北天山东段型及西段A、B型，锡林郭勒高原型，青海田鼠型菌株的pgm位点，由于在其下游没有IS100插入，所以稳定、不易缺失。pgm位点及其侧翼序列的变异与菌株的生物型、自然疫源地和生态型都具有一定的相关性。