兔血管平滑肌细胞体外培养及生长特性研究

目的 体外分离培养兔血管平滑肌细胞(VSMC)并观察其生长特征.方法 采用酶消化结合贴壁法原代培养兔胸主动脉来源的VSMC并传代,倒置显微镜观察和免疫荧光染色法鉴定培养细胞;锥蓝法、绘制生长曲线、MTT法和划痕法分别测定VSMC传代细胞的成活率及其生长、增殖和迁移能力.结果 原代培养5 d后,VSMC从组织块边缘长出,传代细胞呈典型"峰-谷"状生长,胞质内α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性;细胞成活率为96%;生长曲线近似"S"形;细胞生长第3～5 d内光密度值变化较明显;无血清培养的VSMC在24 h内划痕宽度变化最显著.结论 体外培养的兔动脉平滑肌细胞为收缩表型且活性高,生长3～5 d细胞增殖活力较强,无血清培养的细胞在24 h内迁移能力最强,为心血管疾病研究提供了良好的实验材料.     

小鼠主动脉血管平滑肌细胞分离培养及鉴定

目的建立体外分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的技术方法并观察其生长特征。方法比较组织贴块法及酶联合消化法原代分离小鼠主动脉来源的VSMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态及免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法分别测定主动脉VSMC传代细胞的成活率、生长、增殖特征;观察不同血清含量对主动脉VSMC生长的影响。结果组织贴块法培养的细胞6 d后,细胞从组织块边缘长出,14 d后生长迅速可传代;酶联合消化法分离培养的细胞3 d后,细胞呈梭形生长,7～8 d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察可见呈典型"峰-谷"状生长;2种方法获得的细胞行免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率均为96%;细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示细胞生长第3～5天光密度值变化较明显;用含体积分数20%血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基高糖培养液培养的细胞出现明显对数期。结论本研究建立了高效分离和培养主动脉VSMC的2种方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型。     

人主动脉夹层血管平滑肌细胞的培养和鉴定

目的 建立人主动脉夹层(AD)血管平滑肌细胞(VSMC)体外培养的方法。 方法 以AD患者手术时切除的血管为原料,用组织块贴壁法进行VSMC的体外原代和传代培养,倒置显微镜观察细胞的生长情况,考马斯亮蓝染色、α-SMA及Ⅷ因子免疫荧光染色和透射电镜检测鉴定细胞。 结果 7～10 d原代细胞从组织块边缘迁移出来,3～4周细胞生长至融合,可进行传代。原代和传代的细胞生长良好,倒置显微镜下见细胞呈长梭形,有多个突起。细胞呈“峰谷状”生长,具有典型的VSMC特征。考马斯亮蓝染色和透射电镜下均可见细胞内有大量沿长轴生长的肌丝,α-SMA免疫荧光染色强阳性,Ⅷ因子免疫荧光染色阴性,证明所培养的细胞为VSMC。细胞传代至第6代以后开始出现老化现象。 结论 应用组织块贴壁培养的方法可成功地在体外培养人AD的VSMC,为今后研究AD的发病机制提供良好的实验基础。     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法.方法 运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养.倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定.结果 原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征.经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞.结论 植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础.     

丹参酮ⅡA对体外兔血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的观察丹参酮A对体外兔血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和迁移的影响,并初步探讨丹参酮A的作用机制。方法采用兔胸主动脉,用组织贴块法培养,设立空白对照组,加入不同浓度的丹参酮A共同孵育24 h、48 h和72 h,采用MTT法观察该药对细胞增殖的影响;划痕法观测细胞迁移情况;采用流式细胞仪分析细胞周期和DNA含量;TRITC-鬼笔环肽标记F-actin,观察该药物对细胞骨架微丝结构的影响。结果1同一时间点,丹参酮A各浓度组显著抑制体外培养兔VSMC增殖和迁移。细胞的A570值(24 h、48 h、72 h分别为r=-0.762,P=0.000;r=-0.837,P=0.000;r=-0.944,P=0.000)、迁移距离(24 h、48 h、72 h分别为r=-0.966,P=0.000;r=-0.980,P=0.000;r=-0.966,P=0.000)与浓度呈负相关;2作用24 h后,处于G0/G1期的VSMC百分比增加,细胞DNA含量减少,凋亡率增加。兔VSMC在G0/G1期所占比例(r=0.962,P=0.000)、凋亡率(r=0.982,P=0.000)和浓度呈正相关;3药物干预组和对照组相比,兔VSMC的细胞骨架结构有所改变,对照组中细胞骨架呈极性分布,定向伸展,可见伪足;药物干预组细胞骨架呈非极性分布,未见伪足。结论丹参酮A对体外兔VSMC的增殖和迁移有抑制作用,上述作用可能是通过阻滞兔VSMC通过细胞周期的限制点,使其停滞于G0/G1期,诱导细胞凋亡以及影响细胞骨架微丝结构来实现。     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养

目的建立人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法。方法运用植块贴壁法进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外原代和传代培养。倒置相差显微镜和免疫荧光染色方法对培养细胞进行鉴定。结果原代和传代培养的细胞生长良好,光镜下细胞呈长梭形"峰-谷"样生长,具有典型的平滑肌细胞特征。经传代培养至第5代,细胞生长特性未见异常改变;经考马斯亮兰R250及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色检测,证实为平滑肌细胞。结论植块贴壁法可成功进行人脐动脉血管平滑肌细胞的体外培养,传代后细胞生物学特征稳定,为慢性肾病并发心血管疾病的机制研究奠定了实验基础。     

自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞的培养及鉴定

目的：培养、鉴定自发性高血压大鼠主动脉平滑肌细胞,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法;采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测,绘制生长曲线、MTT法测定VSMC细胞的成活率、生长、增殖特征。结果：细胞生长曲线近似“S”形,VSMC传代周期为7-10d,呈典型“峰一谷”状生长,MTT法显示细胞生长第7～9天光密度值变化较明显,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达,第2代阳性结果强于4代。结论：正确的利用组织块可以简单、经济、高效地培养出VSCM,为VscM的治疗提供了理想的细胞模型。随传代过程细胞生物学特性发生改变。     

IL-1β对血管平滑肌细胞Cathepsin S的表达影响

目的探讨体外情况下IL-1β对血管平滑肌细胞组织蛋白酶S（CathepsinS,Cat—S）的表达影响。方法原代培养小鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）传代后用IL-1β（10ng／m1）诱导细胞12、24、36h,免疫荧光（Immunofluorescence,IMF）法检测VSMCCat—S的表达变化,ELISA试剂盒检测细胞培养基Cat—S浓度。结果原代培养的细胞VSMC-α-actin呈阳性,细胞纯度达96％以上。Cat—S免疫荧光染色,对照组呈阴性,IL-1β组均为阳性,并随着诱导时间的延长荧光强度不断增强。对照组培养基Cat—S浓度微量,经IL-1β诱导12h后明显增加,与对照组相比差异显著（P〈0．01）,24h后达到高峰并趋于稳定。结论炎性细胞因子IL-1β在体外可促进VSMC表达、分泌组织蛋白酶Cat—S。     

人皮肤角质形成细胞无血清原代培养方法的建立

目的 建立人皮肤角质形成细胞体外无血清、无牛垂体提取物及无饲养细胞的原代培养方法.方法 应用胰蛋白酶.EDTA冷温两步消化法消化健康青年包皮皮肤,获取角质形成细胞并置于无血清、无牛垂体提取物、成分确定的角质形成细胞培养基中进行原代培养并传代.通过观察细胞形态和采用免疫组织化学方法鉴定及绘制生长曲线,分析、评价细胞质量.结果 该方法可稳定获得高纯度、活性好的角质形成细胞.原代角质形成细胞可稳定增殖2周左右,至少可稳定传代增殖5代.经免疫组织化学方法鉴定,99%以上为角质形成细胞.结论 冷温两步消化法及体外无血清原代培养技术可为科研工作提供足量高质量的角质形成细胞,是高效经济的获得人角质形成细胞的方法.     

改良组织块贴壁法培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞及生物学鉴定?

目的：探讨小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的原代培养方法及生物学特性,为血管性疾病细胞及分子水平的科学研究提供实验材料。方法分离小鼠胸、腹主动脉,采用改良组织块贴壁法获得主动脉 VSMC,胰蛋白酶消化传代,差速贴壁法进行细胞纯化,倒置相差显微镜观察细胞形态及生长情况,并用苏木素-伊红(HE)染色法和免疫荧光法进行鉴定。结果该方法成功分离出小鼠主动脉 VSMC,细胞生长旺盛,活性良好,呈放射状、典型“峰-谷”样生长,HE 染色细胞呈梭形,细胞质丰富,核大而圆形或椭圆形,细胞免疫荧光显示特异性的细胞质内α-平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论本方法简单、经济、可靠,可在体外条件下分离,培养出纯度高、活性良好的主动脉 VSMC。     

酶消化法分离培养家兔血管平滑肌细胞

目的探讨胶原酶分离并培养家兔血管平滑肌细胞的方法。方法取家兔腹主动脉，0．2％胶原酶Ⅰ消化分离血管平滑肌细胞并进行培养，相差显微镜观察培养细胞的形态，免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白（α-actin）的表达。透射电镜观察血管平滑肌超微结构。结果相差显微镜下细胞呈长梭形，未见明显异型细胞，α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的99％以上。电镜显示VSMC内肌丝丰富，线粒体、高尔基复合体等细胞器较少，VSMC呈现分化的收缩表型。结论胶原酶可消化分离培养血管平滑肌细胞，且有成活细胞数多、传代周期短的特点，可用于血管平滑肌表型研究。     

免膀胱平滑肌细胞的分离培养与鉴定

目的 建立分离、培养高纯度兔膀胱平滑肌细胞的方法,并进行细胞学鉴定与分析。方法 正常成年新西兰白兔共6只,运用显微手术器械在肉眼下仔细剔除膀胱黏膜层及浆膜层后,完整分离膀胱平滑肌层。然后以酶分离法获取兔膀胱平滑肌细胞,体外原代和传代培养分离细胞。在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,同时进行细胞爬片H-E染色和透射电镜等形态学观察分析,并应用免疫荧光染色平滑肌特有的α-肌动蛋白进行细胞学鉴定分析。最后根据细胞计数绘制细胞生长曲线和增殖曲线。结果 24 h可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长,7 d可进行传代,传至第10代时细胞仍迅速生长,倒置显微镜下观察细胞相互交叉、重叠生长形成多层,高低起伏呈“谷和峰”样结构,至第12代时,细胞开始变形,至第15代时细胞已失去平滑肌细胞的典型形态特点,细胞生长杂乱且不规则,至第20代时细胞已死亡。以第4代细胞进行形态学细胞爬片H-E染色和透射电镜观察分析,以及平滑肌特有的α-肌动蛋白免疫荧光染色分析均证实,该分离培养的细胞为膀胱平滑肌细胞,且纯度高达100%。结论 酶分离法在短时间内成功培养大量高纯度的膀胱平滑肌细胞,为深入研究膀胱平滑肌细胞的病理生理及分子生物学奠定了基础。     

组织块重复贴壁使用在原代细胞培养中的实验意义

目的旨在提高采用人脐静脉组织块贴壁法进行平滑肌细胞原代培养组织块的重复利用率,进而缩短采用细胞培养进行实验的培养周期。方法以改良人脐静脉平滑肌细胞贴壁培养法为基础,当原代培养细胞(对照组)进行第1次细胞传代后,将培养组织块再次接种于新培养瓶中继续培养(实验组),分别记录两组细胞爬出时间、第1次传代时间、以及第1次传代后24、48、72、96h的细胞计数,通过倒置显微镜对两组细胞进行形态学观察,采用抗α-actin免疫细胞化学方法,对两组传代细胞的类型和性质进行鉴定。结果与对照组比较,实验组细胞爬出时间及第1次传代时间均明显缩短(P<0.05);两组第1次传代后24、48、72、96h细胞计数差异均无统计学意义(P>0.05);两组细胞形态经α-actin鉴定差异无统计学意义。结论人脐静脉组织块重复贴壁培养后,经传代其细胞数量、细胞形态与原代组织块贴壁培养的细胞差别均无统计学意义。     

大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨

目的：培养大鼠血管平滑肌细胞。方法：手术显微镜下分离主动脉和肺动脉，再用翻转干涸法进行操作。结果：显微镜下分离组织，岢基本除净动脉纤维脂肪层和外膜，再用刀片轻刮内膜，可保证所贴组织块为地动脉中膜。传至第三代时，用台盼蓝检查细胞传代成活率９５％，光镜、电镜和免疫组化鉴定培养细胞，培养细胞纯度９６％。结论：贴块片简便易行、经济、又可以防止膜损伤，可为血管病理变化研究提供适宜的细胞。     

桃红四物汤对血管平滑肌细胞FAK/P38MAPK信号表达的影响

目的:研究桃红四物汤药物成分对血管平滑肌细胞(VSMC)FAK/P38MAPK信号表达的影响,并探讨其在抑制VSMC的迁移及增殖中的相关机理。方法:制备桃红四物汤含药血清,体外分离培养大鼠颈总动脉VSMC,将VSMC分为正常对照组(A组,正常大鼠血清培养)与干预组(B组,桃红四物汤含药血清干预)分别进行处理,采用免疫细胞化学方法检测各组FAK的表达情况,采用Western blot法检测各组不同时间及不同浓度含药血清干预下P38MAPK表达的变化。结果:大鼠VSMC在含药血清干预后,FAK及P38MAPK的表达均降低(P<0.01),P38MAPK的表达随含药血清干预时间的延长及作用浓度的增加而降低(P<0.01)。结论:桃红四物汤药物成分对FAK/P38MAPK信号的表达产生负性影响,此影响可能参与了对VSMC的迁移及增殖的抑制作用。     

机械性血管损伤对血管平滑肌细胞增殖的影响

进行了粥样硬化血管段、球囊拉伤血管段以及球囊扩张后再狭窄血管段的组织细胞培养，以３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞（ＤＮＡ）合成速率。观察损伤血管段培养液对培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖过程的影响，结果显示：球囊成形术组的血管组织培养液对ＶＳＭＣ增殖有明显的刺激作用。单纯血管损伤组次之。本研究中的粥样硬化血管段培养液对培养的ＶＳＭＣ增殖无明显影响。