Cofilin-1慢病毒载体的构建及其在Huh-7中的过表达

目的 构建Cofilin-1过表达的Huh-7细胞株. 方法 应用RT-PCR克隆出Cofilin-1的完整编码序列,将其亚克隆到慢病毒载体pWPT中,构建慢病毒载体表达质粒pWPT-Cofilin-1;将慢病毒表达质粒pWPT-Cofilin-1或pWPT-GFP与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞,获得携带Cofilin-1完整编码序列的慢病毒和携带GFP基因的慢病毒,将两种慢病毒分别感染Huh-7细胞;通过Real-Time PCR和Western blot检测Huh-7细胞中的Cofilin-1的过表达情况. 结果 测序结果显示成功构建重组慢病毒表达质粒pWPT-Cofilin-1;慢病毒有效感染Huh-7细胞,依据GFP绿色荧光可测定感染有效率超过95％;Cofilin-1在Huh-7细胞中的mRNA量和蛋白水平都成功的过表达. 结论 本实验的完成,为进一步研究Cofilin-1基因在肝癌中的生物功能和作用机制奠定了基础.     

大鼠线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建线粒体膜蛋白Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体.方法 PCR扩增获得Nix基因序列,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-CMVIE-IRES-Puro载体连接获得Nix过表达重组慢病毒载体;以Nix为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切的pHBLV-U6-Scramble-Puro载体连接获得Nix shRNA重组慢病毒载体;将病毒包装辅助质粒与上述重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集上清液并浓缩获得慢病毒浓缩液,3倍梯度稀释法测定病毒滴度;用病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤酶素筛后得到稳定感染细胞株;荧光显微镜检测Nix荧光水平,Western blot检测Nix蛋白的表达.结果 成功构建Nix基因过表达和shRNA慢病毒载体,并在293T细胞中包装获得病毒.重组病毒感染PC12细胞后,荧光显微镜检测Nix基因过表达细胞荧光水平增加,shRNA感染细胞荧光水平降低;Western blot检测显示Nix基因过表达PC12细胞中Nix蛋白表达显著升高,shRNA慢病毒感染细胞中Nix蛋白表达明显降低,而Nix shRNA1干扰效果最好.结论 成功构建Nix基因过表达与shRNA慢病毒载体,并获得Nix过表达与干扰细胞模型.     

以Has-miR-100-3 p抑制剂慢病毒表达载体建立稳定感染A549细胞株

目的 用Has-miR-100-3p抑制剂的慢病毒来建立稳定感染人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株,为进一步研究miR-100在NSCLC细胞中的机制奠定基础.方法 用has-miR-100-3p抑制剂的重组慢病毒液,以其最适浓度感染A549细胞,获得稳定感染慢病毒的A549细胞株.荧光显微镜观察细胞感染效率,实时定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)和流式细胞术(FCM)分别检测稳定感染慢病毒的A549细胞株中miR-100的表达量和细胞株中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.结果 荧光显微镜下可见绿色荧光在细胞中表达.qRT-PCR检测结果显示,感染抑制剂的A549细胞中miR-100的表达量显著减少;流式细胞术检测感染组细胞中均有GFP的表达.结论 获得了has-miR-100-3p抑制剂的慢病毒稳定感染的A549细胞株,该细胞株中内源性miR-100的表达下调.     

绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

【目的】构建绿色荧光蛋白(GFP)示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组慢病毒载体,并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体p LV-tk-GFP,并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染A375,以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,更昔洛韦(GCV)杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒p LV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,tk基因已连接到载体正确位置,序列无突变;包装病毒并感染细胞后,荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达;筛选得到稳定表达细胞株A375/tk-GFP,GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞,表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组p LV-tk-GFP慢病毒载体,该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。     

双特异性磷酸酶-1过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭的影响

目的：构建携带人双特异性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1,DUSP-1)基因的过表达慢病毒载体并包装病毒,感染人肾癌细胞株A498后观察DUSP-1的过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭能力的影响。方法从pCMV6-XL5-DUSP-1质粒上获得目的基因片段,采用DNA重组技术将DUSP-1基因插入到慢病毒表达载体质粒Plv-EGFP(2A)Puro中,获得重组plv-EGFP(2A)Puro-DUSP-1载体。重组慢病毒表达质粒及辅助包装质粒pH1、pH2共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒上清并感染肾癌细胞株A498,利用Western blot检测细胞DUSP-1蛋白的表达情况。用MTS法检测细胞增殖能力的变化,Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果成功构建携带DUSP-1过表达载体。包装病毒后成功感染A498细胞株,DUSP-1蛋白表达较对照A498细胞株显著上调。重组质粒组细胞在490 nm吸光值明显上升(P＜0.05);细胞侵袭试验中,重组质粒组的穿膜细胞数明显高于空载体组(P＜0.05)。结论成功构建了人DUSP-1基因的重组慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1,进行病毒包装后成功培养稳定高表达DUSP-1基因的肾癌细胞株;DUSP-1基因的过表达具有促进肾癌细胞株A498增殖和侵袭的作用。     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体及其在肝癌细胞系Huh-7中的表达

 目的 构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,为进一步研究MST1与肝癌之间的关系提供理想的模型。方法 克隆MST1基因到慢病毒载体pLVPT-tTRKRAB中,2种慢病毒载体（pLVPT-tTRKRAB-MST1和pLV-tTRKRAB-Red）与包装质粒通过293FT细胞系介导,分别包装成病毒颗粒,先后2次去感染肝癌细胞系Huh-7。培养7 d后,使用强力霉素（doxcycline）进行诱导,用Western blot检测MST1表达情况。结果 构建了可诱导MST1真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染目的肝癌细胞系Huh-7。在强力霉素诱导条件下,肝癌细胞系Huh-7可以表达MST1。结论 成功构建出可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,并获得在强力霉素诱导条件下可以表达MST1的肝癌细胞亚系。     

S100P基因慢病毒表达载体的构建及对结肠癌Caco-2细胞的影响

目的:通过构建S100P慢病毒表达载体,研究其对结肠癌Caco-2细胞的影响.方法:以DLD-1细胞cDNA为模版,PCR扩增S100P基因序列,然后将该序列克隆插入慢病毒载体中,构建S100P慢病毒表达载体,包装产生慢病毒颗粒.将慢病毒颗粒感染Caco-2细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)技术检测S100P的表达情况;MTT法检测细胞生长变化;细胞平板克隆培养检测其细胞克隆形成能力.结果:构建的慢病毒表达载体Lenti-S100P经酶切和测序鉴定结果正确;携带S100P基因的慢病毒颗粒感染Caco-2后,细胞中S100P基因和蛋白过表达,促进细胞克隆形成能力.结论:本研究成功构建S100P慢病毒表达载体,为深入研究S100P基因的相关功能提供了一定的实验基础.     

胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD(Bcl-2-associated death protein)重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen 1),应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低(P<0.05)。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。     

小鼠BMPRⅠb基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞

目的:构建携带小鼠BMPRⅠb基因的慢病毒载体,并转染神经干细胞,为研究BM-PRⅠb在BMPs调控神经干细胞分化中作用奠定基础。方法:利用RT-PCR从小鼠脑组织中获得BMPRⅠb基因,然后定向插入慢病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的重组慢病毒质粒和另外两种辅助质粒共转染包装细胞,收集、浓缩慢病毒并检测其滴度。利用获得的慢病毒载体转染NSCs,并观察目的基因表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实克隆成功BM-PRⅠb基因,酶切及测序鉴定成功构建重组慢病毒质粒,共转染293T细胞72h后大部分细胞表达绿色荧光,病毒滴度为5×108 TU/ml。慢病毒感染后的NSCs表达绿色荧光且BMPRⅠb mRNA表达上升。结论:成功构建BMPRⅠb基因慢病毒载体,并成功转染NSCs。     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础.方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒.慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度.将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL.重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达.BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达.     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础。方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL。重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达。BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P<0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达。     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a（mWnt3a）与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组（GFP-NSCs组）和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs 进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108 TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d, Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组（P<0.01）。结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。     

麦胚凝集素慢病毒载体的构建及其对脂肪干细胞的感染

目的探讨麦胚凝集素（WGA）慢病毒载体的构建与表达的方法,以及WGA在神经系统中跨膜示踪的能力。方法 采用基因工程方法,将WGA的基因插入到慢病毒表达载体Plvx-IRES-ZsGreen1 中。再采用慢病毒包装,将构建好的质粒 和其他3 种包装质粒（RPEV、PRRE、VSVG）在293T细胞中进行共转染,获取病毒液后感染人源的脂肪干细胞（hADSCs）, 将感染后的hADSCs 注入小鼠的脑卒中模型,修复神经损伤。结果显微镜下检测到绿色荧光报告蛋白表示感染成功。 对感染后的hADSCs 进行免疫组化显色,结果显示WGA已经成功的在hADSCs 中实现了表达,在MCAO小鼠模型脑损伤 处追踪到感染了WGA的hADSCs。结论慢病毒包装WGA蛋白的方法可靠高效,可以作为一种高效的示踪技术广泛应 用于各类细胞。     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。