丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化乙型脑炎病毒非结构蛋白NS5,并制备其多克隆抗体。方法通过PCR法扩增编码NS5蛋白的全长基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并通过Ni柱亲和层析纯化重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测抗体效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果与结论成功获得了可溶性表达的NS5蛋白,制备了多克隆抗体,效价为1∶1000,能够特异性识别乙型脑炎病毒感染细胞中表达的NS5蛋白,为进一步研究NS5蛋白的生物学功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒 X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的重组表达质粒pcDNA3.1(－）-NS3和表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(－）-X，分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，用免疫印记（Western blotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT 3-promoter共转染HepG2细胞，检测报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达水平，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子功能的影响。结果显示，两个重组表达载体pcDNA3.1(－）-NS3及pcDNA3.1（－）-X在HepG2细胞均以瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3.1(－）-X组的CAT的表达分别是对照的3．6倍和4．4倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的8．5倍；表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明，HepG2细胞中表达的HCV NS3蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中表达及纯化人ω干扰素 (interferonω ,IFN_ω)以对其功能进行深入研究。方法 :用PCR方法扩增人IFN_ω基因 ,与分泌型酵母表达载体pMEX9K重组 ,经酶切、PCR和序列测定证实重组表达载体pMEX9Kω构建正确。将重组载体pMEX9Kω用SalⅠ酶切后 ,转化毕赤酵母GS115。得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中有人IFN_ω的表达 ,表达量为 4× 10 9U L。经过ButylSepharose 4FF疏水层析柱 ,SPSepharoseFF离子交换柱和Superdex 75凝胶过滤三步层析纯化 ,利用反相HPLC分析纯化的重组蛋白。结果 :得到了纯度 >99%的重组IFN_ω。N端氨基酸序列测定表明重组人IFN_ω具有正确的N端氨基酸残基顺序 ,相对分子质量为 2 2 0 0 0 ,并具有同天然蛋白相似的比活性。结论 :在毕赤酵母中成功地表达并纯化得到了同天然蛋白具有相似的比活性的人IFN_ω。     

丙型肝炎病毒NS4A抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

为探索新型治疗方法，制备抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS4A的抗独特型人源单链可变区抗体（抗－Id scFv),采用噬菌体表面展示技术，将抗HCV NS4A单克隆抗体固相包被于Nunc板，应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，随机挑选82个克隆，利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测和鉴定，获得与HCV NS4A单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV NS4A特异性抗－Id scFv的编码基因进行序列测定分析。结果：经过筛选82个克隆中有40株克隆ELISA的吸光度（A450nm)值较高，将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白（BSA）进行交叉反应，确定其中有7株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果，最后确定1株阳性克隆。提取质粒，进行DNA序列测定，DNA为789bp。本实验结果提示，用噬菌体抗体库技术能够成功地获得抗HCV NS4A的抗－Id scFv，为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因

为克隆与丙型肝炎病毒（HCV）NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因，采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCV NS3蛋白诱饵酵母质粒，转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在4重营养缺陷培养基（SD／－Trp-Leu-Ade-His)上生长，又能在涂有X－α－半乳糖（X－α－gal）的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落，提取此酵母克隆的质粒，转化大肠杆菌后进行测序，并进行生物信息学分析。分析的结果显示，筛选出19个阳性克隆，包括已知功能基因17个，还有1个克隆的测序结果与GenBank中的1个未知功能序列有44％的同源性，初步证明了此基因与HCV NS3有结合活性。说明成功克隆了HCV NS3蛋白结合蛋白基因，为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。     

牛蛙核糖核酸酶对体外培养的人肝癌细胞的杀伤作用

目的：利用大肠杆菌系统表达牛蛙核糖核酸酶（RC—RNase），观察其对人肝癌细胞的体外杀伤作用。方法：构建PE-q32-RC—RNase重组原核表达载体，转化人大肠杆菌BL21（DE3）plyS中并利用IPTG诱导表达。工程菌经超声碎菌、离心后，表达产物在变性条件下经Ni—NTA—agzrose亲合层析法纯化及复性，细胞毒试验检测其对体外培养的人肝癌细胞的杀伤活性。结果：经IPTG诱导后，大肠杆菌中表达的RC—RNase融合蛋白相对分子量（Mr）约为31KD。与预期大小基本相一致，主要以包涵体的形式存在。经纯化及复性后，获得纯度达到95％以上且对体外培养的人肝癌细胞具有明确杀伤活性的RC—RNase融合蛋白。结论：在大肠杆菌中表达的RC—RNase融合蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的杀伤作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术,将丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型(抗-Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒,经SfiI／Not I酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体,转化大肠杆菌XL1-Blue,应用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1-Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗-Id scFv进行硫酸铵沉淀,并进行SDS-PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗-Id scFv片段基因由774bp组成。SDS-PAGE电泳表明,大肠杆菌XL1-Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗-Id scFv分子量约28kD。结论 HCV核心蛋白抗-Id scFv与HCV核心蛋白抗-Id scFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗-Id scFv的筛选和表达成功,为今后HCV核心蛋白抗-Id scFv的研究和应用奠定了基础。     

人β-防御素3基因在COS-7细胞中的表达

目的：构建人β—防御素3(hBD3)的真核表达载体，建立稳定表达hBD3的细胞株。方法：用EcoR Ⅰ酶切合有hBD3全长基因的pGEM-hBD3重组质粒，获得其编码区全长序列，将其连接入EcoR Ⅰ预处理过的pcDNA3中。转化大肠杆菌，酶切鉴定筛选出插入方向正确的转化子。采用脂质体转染法将重组pcDNA3-hBD3真核表达载体导入COS-7细胞，用G418进行抗性筛选，用RT-PCR和Western印迹检测目的基因hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论：构建的pcDNA3-hBD3真核表达载体转染COS-7细胞后可稳定表达hBD3的mRNA和蛋白，且蛋白主要以分泌形式存在于培养上清中。     

The acutely limping child

Acute limping may be the result of multiple pathologies in children. The differential diagnosis varies based on the age of the child. Irrespective of age, the initial imaging work-up includes AP and frog leg radiographs of the pelvis and ultrasound; MRI may sometimes be helpful. In children less than 3 years, infections and trauma are most frequent. MRI is the imaging modality of choice when osteomyelitis is clinically suspected. Between the ages of 3 and 10 years, transient synovitis of the hip and Legg-Calvé-Perthes disease are main considerations but infection, inflammation and focal bony lesions are also considered. In children over 10 years, slipped capital femoral epiphysis also is considered.     

The role of interventional radiology in trauma

Introduction Interventional Radiology has evolved into a specialty having enormous input into the care of the traumatized patient.In all hospitals,regardless of size,the Interventional Radiologist must consider their relationships with the trauma service in order to     

Do Balance Board Training Programs Reduce the Risk of Ankle Sprains in Athletes?

Introduction Ankle sprains are the most common musculo-skeletal injury that occurs in athletes,particularly in sports that require jumping and landing on one foot such as soccer,and basketball(1-4).These injuries often result in significant time loss from participation,long-term disability,and have a major impact on health care costs and resources(5-8).     

Carbohydrate Supplementation during Exercise: Does It Help? How Much is Too Much?

KEY POINTS· Carbohydrate intake during exercise can delay the onset of fatigue and improve performance of prolonged exercise as well as exercise of shorter duration and greater intensity (e.g., continuous exercise lasting about 1h and intermittent high-intensity exercise), but the mechanisms by which performance is improved are different.     

Diagnóstico ecográfico del neumotórax

The ultrasonographic diagnosis of pneumothorax is based on the analysis of artifacts. It is possible to confirm or rule out pneumothorax by combining the following signs: lung sliding, the A and B lines, and the lung point. One fundamental advantage of lung ultrasonography is its easy access in any critical situation, especially in patients in the intensive care unit. For this reason, chest ultrasonography can be used as an alternative to plain-film X-rays and computed tomography in critical patients and in patients with normal plain films in whom pneumothorax is strongly suspected, as well as to evaluate the extent of the pneumothorax and monitor its evolution.     

High Intensity Interval Training:New Insights

KEY POINTS ·High-intensity interval training(HIT)is characterized by repeated sessions of relatively brief，intermittent exercise.often performed with an“a11 out”effort or at an intensity close to that which elicits peak oxygen uptake(i.e.，≥90%of VO2 peak).     

磁共振DWI和动态增强鉴别颅底脊索瘤和侵袭性垂体瘤的应用

目的 探讨磁共振扩散加权成像(DWI)和动态增强在颅底脊索瘤和侵袭性垂体瘤(IPA)鉴别诊断中的应用价值.方法 搜集经手术病理证实且影像学有鞍区破坏的颅底脊索瘤患者15例、向鼻咽部侵犯的IPA患者20例.测量二者的表观扩散系数(ADC)值,绘制受试者工作特征曲线(ROC),分析动态增强曲线的类型,统计达峰时间(TTP)、增强峰值(EP)和最大对比增强率(MCER),分析各个参数在鉴别诊断中的价值.结果 颅底脊索瘤的ADC值为(1.274±0.07)×10-3mm2/s,高于IPA ADC值(0.672±0.03) ×10-3 mm2/s(P ＜0.001),ADC阈值为0.964×10-3mm2/s时,ROC曲线下面积为0.997,敏感度为93.3％,特异度为100％.颅底脊索瘤时间-信号强度曲线(TIC)Ⅰ型14例,TICⅢ型1例,此例TICⅢ型者TTP约40 s;IPA TIC Ⅰ型7例,TICⅢ型13例.颅底脊索瘤和IPA的EP、MCER差异均有统计学意义(P ＜0.001).结论 ADC值和TIC的类型及其相关参数(EP,MCER)有助于颅底脊索瘤和IPA之间的鉴别.     

Treatment of intrahepatic arteriovenous fistula in hepatocellular carcinoma with N-butyl-2-cyanoacrylate

Primary hepatocellular carcinoma (HCC) continues to be one of the most common malignancies with an incidence of approximately one million cases per year and a dismal prognosis; some authors have reported a median survival of 1 ～ 2 months after diagnosis. Although surgery remains the only hope for cure, few patients are candidates[1,2].