不同来源小鼠胚胎培养在辅助生殖实验室质量控制中的应用

目的:利用小鼠胚胎体外培养技术对新建人类辅助生殖实验室进行质量控制,以保证培养体系的可靠性,并比较两种小鼠胚胎培养方法在实验室质量控制中的作用。方法:采用小鼠配子体外授精法和2-细胞胚胎收集法对胚胎进行培养,观察胚胎发育情况。结果:小鼠配子体外授精法的受精率为80.98%,受精卵的卵裂率、优质胚胎率及囊胚形成率分别为90.60%、68.15%、85.93%与收集的体内2-细胞卵胚胎的88.98%、70.33%、83.89%比较无显著性差异,P>0.05。结论:两种不同来源鼠胚培养方法均可作为实验室培养体系检测的评价指标。对于新建的胚胎培养实验室,小鼠配子体外授精法可对IVF的全过程进行检测,更能反映培养体系对胚胎的影响,同时还可熟练IVF的操作技能。     

鼠胚实验在新建胚胎培养实验室质量控制中的作用

目的采用鼠胚实验(mouse embryo assay,MEA)检测新建的胚胎培养实验室的培养体系是否符合人类胚胎体外培养的要求。方法采用配子体外授精法和收集2细胞胚胎培养法进行实验。在胚胎体外培养的过程中定时对胚胎的发育状况进行观察并拍照记录。结果配子体外受精法的囊胚形成率为90.84%±7.09%。收集2细胞胚胎培养法的囊胚形成率为91.17%±6.97%。两种方法的囊胚形成率之间差异无显著性。结论配子体外授精法和收集2细胞胚胎培养法均可作为新建胚胎培养实验室的质量控制方法。     

鼠胚培养在体外授精(IVF)实验室质量控制中的应用

目的 :检测胚胎培养实验室的培养体系是否存在对胚胎有害的内毒素 ,以保证培养体系的可靠性 ;方法 :采用小鼠配子体外授精法和 2细胞胚胎收集法对胚胎进行培养 ,观察胚胎发育情况 ;结果 :小鼠配子体外授精法的受精率为 83 % ,采用两种方法 ,40小时和 64小时的卵裂率及优良胚胎率无显著性差异 ,P >0 .0 5,而卵裂球的数目有极显著性差异 ,P <0 .0 1 ;两种方法比较卵裂球数目、卵裂率及优良胚胎率无显著性差异 ;结论 :建立一个高水平的生殖中心 ,必须同时有一套严格的实验室控制系统 ,上述两种方法均能作为实验室培养体系检测的评价指标。但是 ,对于新建立的胚胎培养实验室 ,应用小鼠配子体外授精法作为实验室的质量控制更能全面反映培养体系对胚胎的影响 ,同时还可熟练IVF基本的操作技能     

新建体外受精实验室的鼠胚实验质控和氧气浓度对胚胎体外发育的影响

目的采用鼠胚实验（MEA）检测新建体外受精（IVF）实验室的培养环境和培养体系是否符合辅助生殖技术人类胚胎体外培养的要求,并探讨不同培养环境（O2浓度）对小鼠早期胚胎体外发育的影响。方法利用ICR小鼠进行体内受精和IVF实验,观察不同受精方式来源的早期胚胎的受精及发育情况,并比较不同O2浓度下体内受精/IVF早期胚胎的受精率、卵裂率和囊胚形成率。结果体内受精组共获卵1387个,受精率、卵裂率和囊胚形成率分别为86.37%、94.74%和91.72%;IVF组共获卵1345个,受精率、卵裂率和囊胚形成率分别为80.67%、94.75%和91.05%。体内受精组的受精率明显高于IVF组（P＜0.05）,但两组卵裂率和囊胚形成率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。体内受精组中,二气培养（三气培养）的受精率、卵裂率和囊胚形成率分别为87.04%、93.09%和88.19%（85.79%、96.21%和94.75%）,二气培养与三气培养受精率比较差异无统计学意义（P＞0.05）,但二气培养卵裂率和囊胚形成率均低于三气培养（均P＜0.05）。IVF组的二气和三气培养环境下的鼠胚发育情况与体内受精组一致。结论MEAIVF和体内受精的囊胚形成率均达到了IVF实验室的质控标准。建议IVF实验室进行早期胚胎体外培养时选用三气培养,其可有效减少活性氧对早期胚胎的氧化应激作用,并可提高其发育潜能。     

鼠胚实验在新建IVF胚胎培养室中的质控研究

目的:利用昆明系小白鼠行体、内外受精技术,对新建IVF胚胎培养室及技术员操作水平进行评估。方法:①手术获得昆明小白鼠雌雄配子,行体外受精;②手术获得昆明小白鼠体内受精胚(原核胚);培养观察两组鼠胚的受精率、卵裂率、囊胚率。结果:共进行24个周期的体外受精实验,取卵938枚,受精率89.87%、卵裂率96.32%、囊胚率95.39%;共进行24个周期的体内受精实验,取卵916枚(包括原核胚),受精率96.29%、卵裂率97.21%、囊胚率93.57%。结论:两组鼠胚实验结果表明,体内受精胚在体外发育更稳定,其对新建IVF胚胎培养室能够进行很好的质量控制;体外受精胚随小鼠批次及饲养环境等不同,在体外培养时其受精率、2-细胞率等会发生波动,但其对技术人员的操作水平能进行更好的评估;两者结果均能对新建胚胎培养室进行各项质控的监测。     

基于体外鼠胚实验评估辅助生殖实验室质量

目的 通过监测体外鼠胚胎培养实验中卵裂率和囊胚率,评估本院新建的生殖胚胎实验室是否符合人类胚胎体外培养要求。方法 采用SPF级昆明系小鼠行体内和体外受精实验,雌鼠通过腹腔注射PMSG 10 U/只,48 h后腹腔注射hCG 10 U/只进行促排卵,促排卵后,体外受精组经手术获得精子和卵子行体外受精培养;体内受精组在雌鼠促排卵后,将雌鼠和雄鼠合笼饲养过夜,第二天清晨处死可见阴栓的雌鼠,手术获取受精原核胚进行培养,观察两组胚胎培养过程中的发育情况。结果 体外受精实验进行20个周期,共获卵946枚,受精率、囊胚率分别为（79.02±4.05）%、（80.12±5.27）%。体内受精实验进行14个周期,共获卵618枚,其受精率、囊胚率分别为（80.65±4.22）%、（81.35±3.06）%,两组间受精率和囊胚率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过监测体外鼠胚培养实验中卵裂率和囊胚率评估我院生殖胚胎实验室环境,结果表明符合各项指标质控标准。     

瘦素对小鼠着床前胚胎发育影响的体外研究

目的　探讨瘦素在体外对小鼠着床前胚胎发育的影响。方法　 1收集小鼠 2 -细胞胚胎 ,在不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎发育情况 ,并进行胚胎移植 ,观察着床率 ;2收集小鼠 2 -细胞胚胎在空白 CZB培养液中体外培养至桑葚胚期 ,再分别置入不同剂量瘦素的 CZB培养液中进行体外培养 ,观察胚胎进一步发育情况。结果　瘦素能提高 2 -细胞胚胎体外发育的质量、发育率和胚胎着床率。当瘦素剂量为 10 ng/ ml时平均胚胎形态学评分 (AES)为 16 .0 8± 0 .37,剂量为 5 0 ng/ ml时 AES为 17.5 7± 0 .4 2 ,两者间差别有统计学意义(P<0 .0 5 )。但剂量进一步增加 ,促进作用不再递增。瘦素对桑葚胚体外进一步发育无显著影响。结论　瘦素参与了小鼠着床前胚胎的发育 ,能提高胚胎发育质量、发育率 ,有利于胚胎的进一步着床。     

胰岛素样生长因子-Ⅱ对小鼠早期胚胎体外发育的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)对小鼠早期胚胎的影响,为人类胚胎培养系统的优化提供依据.方法 在mKSOM培养基中加入不同浓度的IGF-Ⅱ,Xgd,鼠1-细胞胚胎进行体外培养,观察囊胚发育率、孵化率及胚胎细胞数的变化.结果 小鼠1-细胞胚胎体外培养120 h后,IGF-Ⅱ添加组囊胚发育率、孵化率显著高于对照组,但囊胚细胞计数与对照组无明显差别.结论 添加IGF-Ⅱ对小鼠胚胎发育具有一定的促进作用.     

hCG注射后到授精时间间隔大于42小时对胚胎质量影响研究

目的：探讨体外受精胚胎移植中hCG注射后授精时间间隔超过42 h对胚胎质量的影响。方法：将进行常规体外受精-胚胎移植519个周期的5493枚卵子分为两组,A组hCG注射后授精时间间隔大于42 h授精,B组hCG注射后授精时间间隔小于40 h授精,均于受精后16~18 h左右去除卵丘细胞观察授精的情况,分别统计并比较两组的受精率、卵裂率、优质胚胎率和可利用胚胎率。结果：两组的受精率、卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎率比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：IVF-ET中取卵后在超过最佳授精时间授精并不影响胚胎的质量。     

小鼠体外受精胚胎发育的研究

目的:通过对不同培养方式下促排小鼠体外受精卵发育能力的比较研究和分析,为新建生殖医学实验室培养环境质量控制提供依据。方法:在相同的培养条件和培养时间下,将获得的小鼠卵母细胞随机分为两组,体外受精后,分别以四孔培养法(群体培养)和微滴培养法(单独培养)进行培养,观察记录并计算双原核卵率、24h≥4细胞率、48h融合胚胎率以及96h囊胚率。结果:四孔培养法体外培养后24h≥4细胞数胚胎率明显高于微滴培养法,有统计学意义(P<0.01);48h融合胚发育率有统计学意义(P<0.05);囊胚形成率上差异无统计学意义。结论:结果显示,四孔培养法(群体培养)更利于体外受精小鼠胚胎的发育。     

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的　探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法　本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果　各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论　遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。     

Straw-top玻璃化与程序化冷冻小鼠8-细胞胚胎效果的比较

目的比较慢速程序化法与玻璃化法冷冻小鼠8-细胞胚胎的效果。方法将小鼠卵母细胞行体外受精后培养至8-细胞,分别采用慢速程序化法与玻璃化法进行冷冻,解冻后比较两组胚胎存活率及囊胚形成率。结果慢速程序化冷冻法解冻后的胚胎存活率为79.6%,囊胚形成率为70.7%;玻璃化冷冻法解冻后的胚胎存活率为94.9%,囊胚形成率为89.9%,胚胎存活率与囊胚形成率均显著高于前者（均P〈0.01）。结论在进行小鼠8-细胞胚胎冷冻时,玻璃化法冷冻效果较慢速程序化法效果好。     

C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎的冷冻保种技术.方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测.结果 体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的平均复苏率是67.78％,移植产仔率是21.31％,后代的阳性率是23.08％;体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,平均复苏率是63.33％,移植产仔率是15.78％,后代的阳性率是33.33％.结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法.     

精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响

目的探讨精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响,为人类辅助生殖技术完善质量控制体系创建可靠的平台。方法将精子获能时间分为3组,分别为0.5、1和2h,用HTF＋10%SSS和HTF＋10%FCS两种获能受精液,ICR雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精（IVF）。受精卵分别用IVC-ONE＋10%SSS、IVC-ONE＋10%FCS、HTF＋10%FCS和HTF＋10%SSS4种培养液对体外受精胚胎进行培养。结果结果获能时间为0.5h时,卵母细胞的受精率显著高于其他组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）;获能时间若超过1h,受精率明显下降。胚胎用IVC-ONE＋10%FCS培养液进行培养时囊胚率和囊胚孵出率（89%和40%）显著高于IVC-ONE＋10%SSS（51%和29%）、HTF＋10%FCS（11%和2%）和HTF＋10%SSS（11%和0%）,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论小鼠体外受精时,宜选用HTF受精液,并获能0．5h;小鼠体外受精卵进行培养,以含10％FCS的IVC＋ONE为胚胎培养液,可获得较高的囊胚率,葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的;在含磷酸盐的培养液中EDTA不能有效克服ICR2-cell的体外发育阻滞现象。     

PCR技术在鼠肺支原体检测中应用的初步研究

目的　研究不同培养条件对小鼠卵母细胞体外成熟及体外受精率的影响。方法　小鼠卵母细胞分别在含有FSH、BSA和胰岛素的培养液中体外成熟,在Whitten 氏液中体外受精,比较体外成熟率、体外受精率。结果　1- 裸卵(DO) 的体外成熟率、体外受精率(81-4% ,31-0 % ) 均高于卵丘卵母细胞复合体(COC)(48-6 % ,27-1% ) 。2- 在培养液中添加FSH、胰岛素和BSA,卵母细胞的体外成熟率为77-9 % ,82-3% 、60-7% ;体外受精率为77-2 % 、72-6 % 、26-7% ;2 - 细胞率为49-2 % 、34-2 % 、10-0% 。胰岛素组的卵母细胞IVM 率最高,但IVF率、2 - 细胞率低于FSH 组。3- 添加BSA的两组的体外受精率只有26-7 % 、25-8 % ,显著低于其他组,其体外成熟率也较添加FSH 和胰岛素的组成。4- 排出第一极体(PbI) 的卵母细胞的体外受精率和2 - 细胞率(85-9 % ,22-4% ) 均高于GV期卵母细胞(71-1 % ,12-9 % ) 。结论　1- 卵丘卵母细胞(COC) 较裸卵(DO) 的体外成熟率、体外受精率都低,差异显著(P成熟< 0-01;P受精< 0-05) 。2-FSH 和胰岛素均能提高小鼠卵母细胞的体外成熟率、体外受精率。3-BSA可以降低小鼠卵母细胞体外受精率,差异极显著。4-GV 期卵母细胞的体外受精率显著低于体外培养的排出第一极体的卵母细胞(P2 - cell < 0-05,P受精<0-05)     

C57BL/6J小鼠冻融IVF原核胚用于Cas9显微注射探讨

目的探讨小鼠体外受精(IVF)冻融后用于Cas9注射的可行性。方法新鲜C57BL/6J小鼠卵子IVF后采用冻存管法(EFS20/40)冷冻原核胚(单细胞胚)和2细胞胚胎,次日复苏后培养。比较冻融原核胚和2细胞胚胎的回收率及成活率。选取部分冻融原核胚与新鲜原核胚同时进行Cas9和稀释液胞质注射并培养至2细胞,分别比较注射后的存活率及2细胞发育率。结果冻融后的B6小鼠原核胚的回收率为92.5%、成活率为92.8%,2细胞胚的回收率为90.5%、成活率95.8%,两组数据差异无显著性(P0.05)。新鲜原核胚Cas9注射后的存活率为92.7%,空白组注射组为97.5%,冻融原核胚Cas9注射后的存活率为82.6%,空白组为92%,冻融组Cas9注射与各组差异有显著性(P0.05),其它各组差异无显著性(P0.05)。注射后的2细胞胚发育率差异无显著性(P0.05)。结论冻融原核胚可用于Cas9显微注射。     

不同时期和不同来源鼠胚玻璃化冷冻效果的比较

目的：比较不同时期、不同来源的鼠胚玻璃化冷冻的存活率以及发育为囊胚的成功率。方法：采用体外受精和体内受精的方式得到小鼠的2、4、8细胞期胚胎,对其进行玻璃化冷冻、解冻,观察胚胎的存活与囊胚形成,以未冷冻的胚胎作为对照组。结果：由体外受精和体内受精获得的2细胞期胚胎在冷冻复苏后的存活率分别为70.67%、72.06%,囊胚形成率分别为65.33%、67.62%;4细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为88%、89.71%,囊胚形成率分别为81.33%、83.82%;8细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为93.33%、94.12%,囊胚形成率分别为92%、94.12%。和对照组相比,2细胞和4细胞期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率差异有统计学意义（P＜0.05）,而8细胞期的胚胎差异无统计学意义（P>0.05）。不同时期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率间差异有统计学意义（P＜0.05）,受精方式对处于同一时期的胚胎在冷冻复苏后存活率和囊胚形成率均无明显影响。 结论：玻璃化冷冻可以作为小鼠胚胎保存的有效方法,相对2、4细胞期胚胎,冷冻效果最好的是8细胞期胚胎。     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。