不同甲基化检测技术对模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化的检测

目的 研究模拟肺癌患者血浆DNA中APC基因甲基化最低检测限,确定不同甲基化检测技术在早期肺癌诊断中的价值.方法 用普通甲基化特异性基因扩增（methylation specific PCR,MSP）方法检测肺癌细胞株NCI-H460细胞APC基因,以酚-氯仿经典方法提取NCI-H460细胞DNA,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入相同的健康人血浆200μl中去,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟血浆样本中提取血浆DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以Sybr-Green Ⅰ为染料进行实时荧光定量MSP检测,同时进行普通MSP检测.结果 NCI-H460细胞中的APC基因启动子1A区719位点存在甲基化,实时荧光定量MSP检测模拟肺癌患者血浆APC基因甲基化的最低检测限为在200 μl血浆中能检测出10^2个肿瘤细胞的DNA,而以普通MSP检测,200 μl血浆中需投入10^3个以上肿瘤细胞的DNA才有弱阳性条带.实时荧光定量MSP检测技术比普通MSP检测的敏感性至少高出10倍.结论 实时荧光定量MSP比普通MSP检测灵敏度高,该技术用于肺癌患者血浆DNA甲基化检测,可能有助于肺癌早期诊断.     

甲基化特异性基因扩增检测过程中的质量控制

目的构建adenomatous polyposis coli(APC)基因启动子1A的甲基化阳性质粒标准品,对甲基化特异性基因扩增(meth-ylation specific PCR,MSP)的检测灵敏度进行质量控制.方法对脐血淋巴细胞DNA转甲基并化学修饰,制备甲基化阳性和阴性模板,MSP后获得目的片段,克隆到pMD18-T质粒载体,测序筛选阳性和阴性质粒标准品,紫外分光法对标准品定量,对10倍梯度稀释的质粒进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR来获得弱阳性质控品,对36份组织样本进行MSP检测.结果将MSP后电泳能显示的质粒(105拷贝/ml)作为弱阳性质控品.在加入弱阳性质控品后,2例阴性的样本最终定为阳性;11例未定结果的样本最终7例定为阳性,4例定为阴性.36例样本无质控品前的甲基化阳性率为25%,有质控品后的阳性率为50%,两次结果差异显著(P=0.001).结论构建了携带甲基化阳性的APC基因启动子的质粒标准品并制备了低拷贝的弱阳性质控品,可以对MSP检测灵敏度进行质量控制,降低了检测的假阴性率.     

应用MSP方法检测非小细胞肺癌RASSFlA基因启动子甲基化

目的探讨应用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测非小细胞肺癌（NSCLC）RASSF1A基因启动子甲基化情况。方法留取58例非小细胞肺癌患者手术标本及正常肺组织，甲基化特异性PCR分析RASSF1A基因启动子甲基化情况。结果58例非小细胞肺癌中RASSF1A基因启动子甲基化阳性率为34．5％，甲基化与各临床参数之间无显著相关性。结论原发性非小细胞肺癌中存在着较高比例的RASSF1A启动子过度甲基化，提示RASSF1A在非小细胞肺癌的发生中起着重要作用。     

血浆中APC基因甲基化检测在早期肺癌诊断中的应用

目的 研究血浆DNA中APC基因启动子甲基化与肺部实体瘤良、恶性的关系,确定血浆中APC基因甲基化检测对早期肺癌诊断的意义.方法 以92例CT检查发现肺部实体瘤(直径≤2 cm),并在CT引导下行肺部穿刺患者和23例健康人作为研究对象,收集血浆样本,利用磁珠法提取DNA,行亚硫酸氢盐化学修饰后,采用针对APC基因启动子区的甲基化引物和探针,以荧光定量MSP法(TaqMan探针)检测APC基因的甲基化.结果 92例肺部实体瘤患者经病理诊断,有58例确诊为肺癌、31例为肺部良性疾病、3例未明确诊断.58例肺癌患者中有11例(19%)测出APC基因启动子区甲基化阳性,31例肺部良性疾病、3例未明确诊断和23例健康对照组均为阴性.结论 检测血浆DNA中APC基因启动子甲基化有助于早期肺癌的诊断.     

定量检测血浆RASSF1A甲基化在晚期肺癌患者个体化治疗中的应用

摘要:目的：定量检测晚期肺癌患者化疗过程中血浆RAS相关区域家族1A基因(RASSF1A)甲基化水平,探讨其在个体化治疗中的应用价值。 方法：采集24例晚期肺癌患者化疗前后静脉血共135份,用荧光定量甲基化特异性PCR (MSP)检测RASSF1A基因的甲基化水平,观察化疗前后的变化情况。 结果：13例部分缓解组(partial remission,PR)患者化疗后甲基化定量水平明显升高(P＜0.05),而11例未缓解组(stable disease,SD或progressive disease,PD)的患者化疗前后甲基化水平无明显变化;生存时间≥12个月的13例患者化疗后甲基化定量水平也明显升高(P＜0.01),而生存时间<12个月的11例患者化疗前后甲基化水平无明显变化。生存曲线分析显示,化疗后有甲基化水平升高改变的患者总体生存时间更长(P＜0.01）。 结论：晚期肺癌患者化疗前后血浆RASSF1A甲基化定量水平的检测,对评估化疗的疗效及预后有一定的价值,对个体化化疗的药物选择有一定的指导意义。     

肺癌患者血浆RASSF1A和BLU基因甲基化检测及临床意义

【目的】探讨肺癌患者外周血血浆中抑癌基因Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）和BLU基因启动子的甲基化状态及其临床意义。【方法】利用巢式甲基化特畀性PCR（nMSP）法检测肺癌患者外周血血浆与正常人血浆中抑癌基因RASSF1A和BLU基因启动子的甲基化状态。【结果】58例肺癌患者血浆样品中分别发现22例（37．93％）RASSF1A基因启动子的异常甲基化和17例（29．31％）BLU基因启动予的异常甲基化,20例正常对照血浆中都未检测到RASSF1A和BLU基因启动子的异常甲基化,差异有显著性（P〈0．01）;但血浆中两基因甲基化检出率与患者性别、肺癌组织学分型及临床分期无明显相关性（P〉0．05）。【结论】利用nMSP法检测外周血血浆中RASSF1A和BLU基因启动子的甲基化,可为肺癌的筛查、早期诊断提供有用的信息。     

血浆DNA甲基化检测在宫颈疾病诊断中的应用

目的对宫颈疾病患者血浆APC和RASSF1A基因启动子甲基化水平进行定量检测,探讨其在宫颈疾病诊断中的意义。方法收集34例宫颈低度病变(CINⅠ期)、43例宫颈高度病变(包含CINⅡ、CINⅢ期)、41例宫颈癌患者治疗前血浆及25例健康妇女血浆。另收集31例与血浆对应的宫颈组织标本。用双重实时荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)技术检测APC和RASSF1A基因启动子甲基化水平并进行统计学分析。结果宫颈疾病患者血浆中APC和RASSF1A甲基化水平与肿瘤组织有较好的一致性,且肿瘤组织水平高于血浆水平(Z分别为-2.236和-3.228,P均<0.05)。宫颈癌组血浆APC与RASSF1A甲基化率均高于低度病变组(P均<0.05);宫颈高度病变组血浆RASSF1A甲基化率也高于低度病变组,差异有显著性(P<0.05)。血浆APC和RASSF1A甲基化阳性结果在低度病变组、高度病变组和宫颈癌组均无显著性差异(P>0.05)。结论血浆DNA甲基化水平能反映宫颈癌的发生、发展变化,在宫颈癌的早期诊断中可能有重要价值。     

肺泡灌洗液基因甲基化联合癌胚抗原、气道径向超声对肺癌的诊断价值

目的 探讨肺泡灌洗液(BALF)中矮小同源盒基因2(SHOX2)和RAS相关区域家族1A(RASSF1A)基因甲基化联合癌胚抗原(CEA)、气道径向超声在肺癌诊断的价值。方法 选取2019年7月至2020年6月于佛山市第二人民医院就诊经胸部CT提示肺结节或占位患者114例,根据病理诊断确认肺癌62例(肺癌组),肺良性病变52例(对照组)。在气道径向超声定位后收集患者BALF样本、外周静脉血,对BALF样本进行细胞学检查及实时荧光PCR法检测SHOX2和RASSF1A基因甲基化阳性率,对外周静脉血血清CEA水平进行检测。结果 肺癌组SHOX2、RASSF1A基因任一甲基化阳性40例(64.52%),阴性22例,对照组任一甲基化阳性2例(3.85%),阴性50例,差异有统计学意义(P<0.05);肿瘤直径与肺泡灌洗液甲基化阳性率呈负相关(P<0.05);23例肺癌患者肺泡灌洗液CEA水平异常20例(86.96%),CEA联合任一甲基化阳性22例(95.65%);17例对照组CEA小于5 ng/ml的12例(70.59%),CEA联合基因甲基化双阴性的11例(64.71%);49...     

甲基化特异性PCR的评价与优化

目的 探讨甲基化特异性PCR(MSP)在DNA甲基化检测中的应用价值.方法 以SHH基因启动子区全甲基化克隆和全非甲基化克隆(质粒)为模板,评价MSP的敏感性和特异性.结果 MSP能检测出样本中低含量的甲基化DNA模板,提高MSP退火温度能克服假阳性或假阴性结果 的产生.结论 MSP检测甲基化具有高灵敏度的优点,适当提高退火温度能保证MSP结果 的特异性.     

新型高通量肺癌相关基因甲基化检测方法的建立

目的 建立一种包含甲基化标准品的新型高通量肺癌相关基因的甲基化检测系统.方法 2009年3-6月上海交通大学医学院附属胸科医院经病理学和影像学确认的非小细胞肺癌患者8例,其中男7例,女1例,平均年龄(57±11)岁,手术后留取肺癌组织及外周血.男性健康志愿者1名,年龄35岁,抽取外周血20 ml,用以分离单个核细胞提取DNA制备质粒.对7个肺癌相关基因的启动区进行克隆,用各基因的特异性引物对克隆到质粒中的各基因片段再次进行扩增,PCR产物用甲基化酶M.sss Ⅰ和亚硫酸盐处理.通过设计3'末端CpGpCpG探针来识别甲基化模板,并经最佳连接酶、最佳退火温度及连接温度的选择,建立一套多重连接PCR体系,最后运用液相芯片平台对扩增的标准品和临床标本进行检测.利用甲基化特异性PCR检测新系统的可靠性.结果 成功的构建了7个基因的甲基化和非甲基化标准品,并建立了多重PCR偶联液相芯片的快速检测系统,p16INK4A、APC、DAPK、RARβ、RASSF1 A、MGMT和GSTP1甲基化标准品的荧光信号值分别为863、909、703、701、901、1 060和885,与非甲基化标准品区分明显.抽提8例患者的肺癌组织DNA,对其中检测出阳性频率较高的基因进行甲基化特异性PCR,产物电泳结果 与新建甲基化检测系统检测结果 完全一致.结论 本研究建立的新型检测系统能同时准确地检测7个基因甲基化状态,有望应用于临床标本的检测.