实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的 建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法.方法 以肺癌细胞株NCI-H460作为RAssF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200 μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆.用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测.以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量.结果 实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆).15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%).5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml.结论 实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强.     

骨肉瘤组织与血浆中RASSF1A甲基化的检测及其临床诊断意义

【目的】寻求有助于骨肉瘤临床诊断的分子生物学标志物。【方法】甲基化特异性 PCR 法检测30例骨肉瘤患者肿瘤组织和血浆及15例健康志愿者骨组织和血浆中 RASSF1A 启动子甲基化情况。统计分析RASSF1A 甲基化与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤分化、肿瘤转移等临床病理特征的相关性。【结果】正常骨组织及血浆中均未检测到 RASSF1A 基因启动子区的甲基化。骨肉瘤组织中 RASSF1A 甲基化阳性率为40％（12／30）,血浆甲基化阳性率为26．7％（8／30）。12例肿瘤组织甲基化阳性患者其血浆甲基化阳性共8例,癌组织和血浆 RASSF1A 甲基化一致率为66．7％（8／12）,18例癌组织甲基化阴性其血浆甲基化也为阴性,Kappa 一致性检验显示骨肉瘤组织和血浆中 RASSF1A 甲基化水平具有一致性（κ＝0．133,P ＜0．05）。骨肉瘤组织及血浆中 RASSF1A 甲基化阳性率显著高于正常骨组织及血浆的甲基化阳性率（ P ＜0．05）,且骨肉瘤组织和血浆中 RASSF1A 甲基化水平与患者的性别、年龄、肿瘤位置无关（ P ＞0．05）,而与肿瘤的分化及有无远处转移有关（ P ＜0．05）。【结论】骨肉瘤患者血浆中 RASSF1A 启动子甲基化与骨肉瘤组织中变化具有一致性,可作为骨肉瘤患者临床诊断的一个辅助指标。     

肺癌患者血浆RASSF1A和BLU基因甲基化检测及临床意义

【目的】探讨肺癌患者外周血血浆中抑癌基因Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）和BLU基因启动子的甲基化状态及其临床意义。【方法】利用巢式甲基化特畀性PCR（nMSP）法检测肺癌患者外周血血浆与正常人血浆中抑癌基因RASSF1A和BLU基因启动子的甲基化状态。【结果】58例肺癌患者血浆样品中分别发现22例（37．93％）RASSF1A基因启动子的异常甲基化和17例（29．31％）BLU基因启动予的异常甲基化,20例正常对照血浆中都未检测到RASSF1A和BLU基因启动子的异常甲基化,差异有显著性（P〈0．01）;但血浆中两基因甲基化检出率与患者性别、肺癌组织学分型及临床分期无明显相关性（P〉0．05）。【结论】利用nMSP法检测外周血血浆中RASSF1A和BLU基因启动子的甲基化,可为肺癌的筛查、早期诊断提供有用的信息。     

血浆DNA甲基化检测在宫颈疾病诊断中的应用

目的对宫颈疾病患者血浆APC和RASSF1A基因启动子甲基化水平进行定量检测,探讨其在宫颈疾病诊断中的意义。方法收集34例宫颈低度病变(CINⅠ期)、43例宫颈高度病变(包含CINⅡ、CINⅢ期)、41例宫颈癌患者治疗前血浆及25例健康妇女血浆。另收集31例与血浆对应的宫颈组织标本。用双重实时荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)技术检测APC和RASSF1A基因启动子甲基化水平并进行统计学分析。结果宫颈疾病患者血浆中APC和RASSF1A甲基化水平与肿瘤组织有较好的一致性,且肿瘤组织水平高于血浆水平(Z分别为-2.236和-3.228,P均<0.05)。宫颈癌组血浆APC与RASSF1A甲基化率均高于低度病变组(P均<0.05);宫颈高度病变组血浆RASSF1A甲基化率也高于低度病变组,差异有显著性(P<0.05)。血浆APC和RASSF1A甲基化阳性结果在低度病变组、高度病变组和宫颈癌组均无显著性差异(P>0.05)。结论血浆DNA甲基化水平能反映宫颈癌的发生、发展变化,在宫颈癌的早期诊断中可能有重要价值。     

妊娠中期妇女超甲基化 RASSF1A 基因表达水平与子痫前期的关系

目的：探讨妊娠中期妇女血浆中超甲基化 RASSF1A 基因表达水平变化与子痫前期的关系。方法选择规律产前检查孕妇506例,分别于孕15～19周及孕20～24周采外周血,同时监测孕妇血压、尿蛋白值,其中诊断为妊娠期高血压疾病的孕妇中包括子痫前期组（48例）、妊娠期高血压组（48例）,从同期单胎健康孕妇中随机选取96名为对照组。收集入组孕妇外周血,提取游离DNA,经甲基化敏感的限制性内切酶消化处理,联合荧光定量 PCR 检测血浆中超甲基化 RASSF1A 基因的表达水平,分析其与子痫前期的关系。结果 孕15～19周,子痫前期组及妊娠期高血压组的超甲基化 RASSF1A 基因表达水平均高于对照组（P ＜0．05）,子痫前期组与妊娠期高血压组组间比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。孕20～24周,子痫前期组孕妇血浆中超甲基化 RASSF1A 基因表达水平高于妊娠期高血压组及正常妊娠组（P ＜0．05）,妊娠期高血压组孕妇血浆中超甲基化 RASSF1A 基因表达水平亦高于正常妊娠组（P ＜0．05）。结论妊娠中期妇女血浆中超甲基化 RASSF1A 基因水平升高可能提示子痫前期的发生。     

血浆DNA定量检测在晚期肺癌患者个体化治疗中的应用

目的通过监测晚期肺癌患者化疗过程中血浆DNA水平的变化,探讨其在疗效预测以及个体化治疗中的应用。方法采集35名晚期肺癌患者化疗前、后静脉血,用磁珠法提取血浆循环DNA和内参照质粒DNA,双重荧光定量PCR技术进行DNA定量检测,以100名体检健康者为对照。结果晚期肺癌患者化疗前血浆DNA平均含量为66.4(33.1~105.0)ng/ml,显著高于健康对照组血浆DNA平均含量22.4(16.2~30.0)ng/ml(P<0.01)。一线药物化疗后,部分缓解组肺癌患者血浆DNA值较化疗前显著下降(P<0.01),且与病情稳定组、病情进展组患者血浆DNA值有显著差异(P均<0.05),而与健康对照组已无差异。生存曲线分析显示,化疗后血浆DNA<50 ng/ml的患者生存率高于血浆DNA≥50 ng/ml的患者(P<0.01)。结论血浆DNA的变化可敏感地反映晚期肺癌患者化疗疗效,在肿瘤个体化治疗中发挥重要作用。     

化疗对晚期肺癌患者凝血、纤溶系统影响的临床研究

目的探讨晚期肺癌患者化疗前后凝血指标的变化及意义。方法对50例晚期肺癌患者（肺癌组）化疗前后血浆凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、血纤维蛋白原量（Fbg）及D-二聚体（D—D）水平进行检测,并与30例健康成人（对照组）所测结果进行对比分析。结果肺癌组APTT、TT均较对照组显著缩短（P〈0．01）,血浆Fbg、D—D水平均明显高于对照组（P〈0．01）。肺癌组化疗后较化疗前PT显著延长,APTT、TT显著缩短,Fbg及D-D水平显著升高（P〈0.05或P〈0．01）。结论化疗加剧晚期肺癌患者机体凝血因子的释放以及纤溶功能受抑状态,使凝血功能异常。     

孕妇外周血中高甲基化RASSF1A基因检测对子痫前期早期预测价值的研究

目的通过分析子痫前期孕妇外周血中胎儿高甲基化RASSF1A基因含量的变化,探讨孕妇外周血中胎儿游离DNA水平在子痫前期中的预测诊断价值。方法收集子痫前期孕妇外周血样本32例,择同期孕龄健康孕妇30例为对照组,采用荧光定量PCR法检测孕妇外周血中高甲基化RASSF1A基因的含量,应用受试者工作特征曲线(ROC)评价高甲基化RASSF1A基因检测对轻度和重度子痫前期孕妇的诊断价值。结果轻度子痫前期组和重度子痫前期组孕妇血浆高甲基化RASSF1A基因的中位数倍值分别是正常妊娠孕妇的3.28倍和10.47倍,有统计学差异(P0.01);用高甲基化的RASSF1A的1.71MoMs来预测轻度子痫前期,灵敏度为86.4%,特异度为71.2%。结论孕妇血浆中高甲基化的RASSF1A基因含量的变化可以提示子痫前期的发生及病情发展的监测,孕妇血浆胎儿游离DNA可作为一个早期预测孕妇子痫前期的发生的潜在的生物学指标。     

肺癌诊断中血浆中多基因联合甲基化检测的价值

目的:探讨肺癌诊断中血浆中多基因联合甲基化检测的价值。方法:选取80例肺癌患者的资料作为研究组,选取80例健康体检者为对照组,比较两组多基因检测及甲基化状态。结果:肺癌组织的CDH13、RASSF1A、RUN3基因甲基化率高于癌旁组织甲基化率(P<0.05)。研究组患者的CpG岛甲基化表型阳性率高于对照组(P<0.05)。结论:血浆中多基因联合甲基化检测在肺癌早期诊断中有重要意义。     

中晚期肿瘤患者围术期血浆TF和TFPI水平变化及意义

目的观察中、晚期肿瘤患者围术期血浆组织因子(TF),组织途径抑制物(TFPI)水平的变化,旨在了解患者在围术期机体的凝血活性状态.方法采集58例恶性肿瘤患者作为观察组1,16例良性肿瘤患者作为观察组Ⅱ及20例非肿瘤手术患者作为正常对照组,运用ELISA法检测血浆TF和TFPI的水平.结果恶性肿瘤患者血浆TF水平较正常对照组术前明显升高(P＜0.05),术中继续有轻微升高(P＜0.01)的现象,肺癌患者术中升高较明显(自身术前,术后比较P＜0.05〉.术后除肺癌患者仍高于对照组外,其他基本恢复正常.良性肿瘤患者在整个围术期无明显变化.而血浆TFPI水平术中有轻微升高,术前、术后及良性肿瘤患者与正常对照组比较没有明显的差异.结论恶性肿瘤患者术前血浆具有较高表达的TF水平较对照组,术中继续有轻微升高,肺癌患者升高更明显,且术后仍处于较高的水平.TFPI术中有轻微的升高.这也许能解释为什么肺癌等恶性肿瘤患者围术期尤其术后易发生深部静脉血栓栓塞及肿瘤转移和复发.     

RASSF10 is epigenetically inactivated and induces apoptosis in lung cancer cell lines

Ras-association domain family 10 (RASSF10), the latest member of the RASSF family with Ras effector function, has been frequently inactivated by aberrant promoter hypermethylation in several human cancers. However, its role in lung cancer has remained unclear. In this study, we investigated the methylation status of RASSF10 by combined bisulfate restriction analysis (COBRA) and examined its preliminary function in lung cancer cell lines. RASSF10 was methylated in four out of six lung cancer cell lines, including NCI-H157, NCI-460, SPCA-1 and NCI-H446. Treatment with a DNA methylation inhibitor, 5-aza-2′-deoxycytiding (5-aza-DC), restored RASSF10 mRNA expression and the restoration of RASSF10 increased cell apoptosis in a dose dependent manner, whereas knockdown of RASSF10 improved cell proliferation ability and inhibited cell apoptosis rate significantly. Immunofluorescence revealed that RASSF10 protein was located in the cell membrane. Taken together, our data for the first time demonstrates the frequent epigenetic inactivation of RASSF10 in lung cancer cell lines. RASSF10 induces cell apoptosis and might function as a tumor suppressor gene in lung cancer.     

非小细胞肺癌血清8个抑癌基因启动子CpG岛甲基化的联合检测及意义

目的：探讨非小细胞肺癌患者血清中8个抑癌基因启动子C pG岛甲基化的联合检测在诊断非小细胞肺癌患者中的意义,以期提高非小细胞肺癌早期无创检出率,提升治愈率。方法选取62例非小细胞肺癌患者设为肺癌组,选取30例肺部良性疾病患者作为对照组,选取16例健康者作为健康组,取3个组研究对象的血清采取癌基因测序法检测8种基因启动子区域甲基化情况,比较3个组研究对象的上述指标,分析上述指标的变化和3个组研究对象不同临床状态的相关性。结果肺组结肠腺瘤性息肉病基因（A PC ）、钙粘蛋白13（CD H 13）、死亡相关蛋白激酶基因（DAPK）、人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）、RAS相关区域家族 F2（RASSF2）、人类Runt相关转录因子3（RUNX3）、RAS相关区域家族1A （RASSF1A）和TMS1/ASC基因甲基化检出率均明显高于对照组,组间比较差异具有统计学意义（P＜0．05）,非小细胞肺癌患者血清中抑癌基因8个指标联合检测敏感性达到93．54％,特异性达到90．3％,敏感性明显高于所有单项检测和4个指标联合检测。结论 A PC、CD H 13等8个抑癌基因异常甲基化状态的联合检测可以明显提高非小细胞肺癌患者抑癌基因甲基化的检出率。该8个基因异常甲基化有望成为非小细胞肺癌辅助诊断和预后判断的分子标记,并有可能成为非小细胞肺癌治疗的新靶点,从而提高临床对非小细胞肺癌患者的诊治水平。     

白血病患者RASSF1A基因甲基化状态及其临床意义

目的研究白血病患者骨髓中Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子甲基化状态及其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测86例白血病患者和60例非白血病患者对照组骨髓中RASSF1A基因启动子的甲基化状况,分析不同白血病类型之间的差异。结果 86例白血病患者中,有12例(13.95%)RASSF1A基因启动子甲基化,而60例非白血病患者骨髓均未检测到甲基化,二者比较差异均有统计学意义(P<0.05)。淋巴系白血病患者RASSF1A基因甲基化比例(23.1%)明显高于髓系白血病患者(6.4%)(P<0.05)。结论白血病患者骨髓中存在RASSF1A基因甲基化,淋巴系白血病甲基化比例明显高于髓系白血病。RASSF1A基因甲基化检测可能成为白血病分型的生物标志物之一。     

胶质瘤患者RASSF1A基因转录表达和启动子区甲基化的研究

目的 探讨RASSF1A(RAS association domain family 1A)基因mRNA表达水平和基因启动子区CpG岛甲基化程度及其与启动子甲基化的关系。方法 用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测28份胶质瘤组织和4份正常脑组织中RASSF1A基因mRNA相对表达水平;用甲基化特异性PCR方法研究胶质瘤组织、正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果 RASSF1A mRNA在4份正常脑组织中全部表达;在脑胶质瘤中表达缺失率为21.4％(6/28),且表达量低于正常脑组织,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度间的差异无显著意义(P>0.05)。按病理学分类,胶质母细胞瘤与少突胶质肿瘤的差异有显著意义(P=0.011)。脑胶质瘤中RASSF1A基因启动子发生甲基化的频率为39.3％(11/28),正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动了未发生甲基化。11份启动子区甲基化的胶质瘤标本中,5份同时伴mRNA表达缺失(P=0.022)。结论 RASSF1A基因启动了在胶质瘤中发生异常甲基化。尽管RASSF1A mRNA在脑胶质瘤中表达缺失并不广泛,但其表达普遍下调。推测启动子区CpG岛甲基化可能是导致RASSF1A基因在胶质瘤中表达缺失或表达水平下调的一种机制。     

宫颈脱落细胞RASSF1A基因甲基化在宫颈癌中的临床意义

目的研究宫颈脱落细胞RAS相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应检测宫颈癌患者和健康女性宫颈脱落细胞RASSF1A基因启动子甲基化,分析与病理因素间的关系。结果宫颈癌患者宫颈脱落细胞RASSF1A基因启动子甲基化率为64.0%,高于健康女性的1.3%(P<0.05)。宫颈脱落细胞RASSF1A基因启动子甲基化率在宫颈癌不同组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、器官转移、Figo分期患者间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论宫颈脱落细胞RASSF1A基因启动子甲基化与宫颈癌病理因素密切相关,可作为宫颈癌病情判断和预后评估的标志物。     

Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis

BACKGROUND: We recently demonstrated that the promoter of the RASSF1A gene is hypermethylated in the placenta and hypomethylated in maternal blood cells. This methylation pattern allows the use of methylation-sensitive restriction enzyme digestion for detecting the placental-derived hypermethylated RASSF1A sequences in maternal plasma. METHODS: We performed real-time PCR after methylation-sensitive restriction enzyme digestion to detect placental-derived RASSF1A sequences in the plasma of 28 1st-trimester and 43 3rd-trimester pregnant women. We used maternal plasma to perform prenatal fetal rhesus D (RhD) blood group typing for 54 early-gestation RhD-negative women, with hypermethylated RASSF1A as the positive control for fetal DNA detection. RESULTS: Hypermethylated RASSF1A sequences were detectable in the plasma of all 71 pregnant women. The genotype of plasma RASSF1A after enzyme digestion was identical to the fetal genotype in each case, thus confirming its fetal origin. Nineteen of the 54 pregnant women undergoing prenatal fetal RhD genotyping showed undetectable RHD sequences in their plasma DNA samples. The fetal DNA control, RASSF1A, was not detectable in 4 of the 19 women. Subsequent chorionic villus sample analysis revealed that 2 of these 4 women with negative RHD and RASSF1A signals were in fact carrying RhD-positive fetuses. CONCLUSIONS: Hypermethylated RASSF1A is a universal marker for fetal DNA and is readily detectable in maternal plasma. When applied to prenatal RhD genotyping, this marker allows the detection of false-negative results caused by low fetal DNA concentrations in maternal plasma. This new marker can also be applied to many other prenatal diagnostic and monitoring scenarios.     

RASSF1A基因对膀胱癌细胞凋亡及化疗药物敏感性的影响

目的探讨RASSF1A基因表达对人膀胱癌细胞凋亡及对化疗药物敏感性的影响。方法采用脂质体介导的基因转染法建立野生型和突变型RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染膀胱癌BIU87细胞株,细胞株分为空白对照组(A组)、空载组(B组)、转染突变型RASSF1A组(C组)与转染野生型RASSF1A组(D组),B,C,D组采用化疗药物丝裂霉素作用于细胞,四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖程度,原位凋亡细胞检测技术检测膀胱癌BIU87细胞凋亡。Western blot测定Caspase-3蛋白的表达水平。结果成功建立稳定表达野生型和突变型RASSF1A基因的膀胱癌细胞株;加入丝裂霉素前、后D组细胞增殖比、凋亡指数及Caspase-3蛋白表达水平与A,B组比较差异均有统计学意义(P<0.05),C组与A,B组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论野生型RASSF1A的重表达可促进膀胱癌BIU87细胞凋亡,提高膀胱癌细胞对丝裂霉素的敏感性。