重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的 基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法 采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因，并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。结果 重组UreB在大肠杆菌中表达，相对分子质量约62000，表达率26％。N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP，肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB／c小鼠，能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示，重组UreB具有良好的免疫原性和反应性，表现出与天然Hp UrcB相似的生物学功能。结论 为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。     

幽门螺杆菌UreB核酸疫苗的构建

目的:构建含幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)基因的核酸疫苗.方法:抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用PCR技术从基因组DNA扩增UreB基因,克隆入PUCmT载体,检测UreB基因序列.经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定.通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-UreB转染COS-7细胞,Western印迹分析检测pIRES-UreB表达UreB蛋白的免疫原性.结果:扩增出长约1 700 bp的UreB基因,与基因库Hp UreB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实成功构建了含UreB基因的Hp核酸疫苗pIRES-UreB,并且Western 印迹分析检测到特异性的蛋白条带.结论:构建了具有免疫反应性UreB基因的Hp核酸疫苗,为进一步探索其免疫作用奠定了基础.     

幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及其抗原性的鉴定

目的构建含人幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)尿素酶B(UreaseB,UreB)编码基因的重组质粒,测定、分析其核苷酸序列,并在E.coliTop10中表达,研究其抗原性。方法应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增UreB编码基因片段,将其T-A克隆和测序,并与GenBank公布的其它Hp菌株基因序列比较,再将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-1中进行表达,用GST亲和层析对其进行纯化,纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体(mAb)的鉴定及与Hp感染患者血清进行Westernblot。结果扩增的UreB基因全长1704bp,并在GenBank上登录(No.DQ141576),与GenBank公布的其它Hp菌株的核酸同源性为97%～99%,表达的UreB融合蛋白的相对分子量为91000。29株小鼠抗Hp-全菌mAb中有6株是针对UreB抗原的,纯化产物可被病人血清和抗UreB的鼠单克隆抗体识别。结论重组UreB具有较好的抗原性,为Hp检测诊断和疫苗的研究奠定了基础。     

携带幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建

目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(ureB)基因重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA扩增ureB基因,克隆入pucmT载体,检测ureB基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定。重组载体pIRES-ureB转入减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,再次转入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-ureB转染COS-7细胞,SDS-PAGE Western印迹法检测pIRES-ureB表达蛋白的免疫原性。结果 扩增出长约1700bp的ureB基因,测序结果表明扩增出的ureB基因与基因库Hp ureB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实ureB基因克隆人真核表达载体pIRES,并成功构建了Hp ureB基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,并且Westem印迹法检测到特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的Hp UreB减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其体内的免疫作用奠定了基础。     

幽门螺杆菌UreB414-OMP18-LTB融合蛋白的构建及免疫原性初步研究

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp) 尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、外膜蛋白(OMP18)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其抗原性.方法 PCR扩增ureb414、omp18、ltb基因,分别克隆入pMD18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UOL,然后将其亚克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳进行表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果 PCR扩增分别获得约414、537 bp和320 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约1 200 bp目的 基因.重组融合蛋白表达量可达细菌总蛋白的15%,免疫印迹检测结果显示该重组蛋白可为UreB、OMP18、LTB兔抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论 成功构建了具有良好免疫原性的UreB-OMP18-LTB融合蛋白.     

幽门螺杆菌细胞空泡毒素基因毒性片段的克隆与表达

目的：通过基因于程技术获得具有良好抗原性的重组细胞空泡毒素毒性亚单位蛋白。方法：利用PCR从幽门螺杆菌(Hp)空泡毒素基因中扩增毒性片段Ⅴ，克隆及序列分析后在大肠杆菌中高效表达，用免疫印迹法(Western blotting)检测其抗原性。结果：序列分析所得片段完整，与标准株AF361700比较有1．5％的bp及一个氨基酸发生变异。与文献报道的中国菌株相比有高度的同源性。SDS-PAGE显示表达产物相对分子量为27000，表达量为30％以上，Western blotting显示该蛋白可被HP全菌抗血清所识别。结论：基因重组Hp细胞空泡毒素毒性蛋白具有良好的抗原性，可用于制备Hp感染的诊断试剂与疫苗。     

BalB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫应答

目的：评价重组尿酶B亚单位（rUreB）作为幽门螺杆菌（Hp)口服疫苗成份的效果、探讨Hp的免疫保护机制。方法：采用重组Hp保护性抗原UreB与粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位（CTB）共口服免疫BalB/c小鼠，ELISA分析血清、唾液和粪便、胃粘液中IgG、IgA抗体水平，体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL－4、IFN－γ的变化。结果：BalB/c小鼠口服rHreB和CTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。结论：rUreB可以作为Hp疫苗成分用于Hp感染的预防和治疗。     

人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MEL HP27 ureB-omp11融合基因的重组表达载体.方法:利用分子克隆技术,扩增Hp UreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a( )进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体.结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp ureB-omp11融合基因,由2 280 bp组成.与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%.结论:成功构建了MEL Hp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的 构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白, 用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定.结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435 bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达.结论 成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达.     

幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础.     

幽门螺杆菌UreB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:为了研制口服幽门螺杆菌疫苗,构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原成分UreB蛋白的基因工程菌株.方法:用PCR方法扩增UreB基因片段,将其克隆至pET28a质粒上,转化E.coli BL21(DE3),经IPlG诱导表达,得到rUreB蛋白.结果:经测序,UreB基因片段由1710bp组成,编码569个氨基酸残基.与GenBank报道的脲酶核苷酸序列同源性最高为97%,氨基酸同源性为99%.经SDS-PAGE检测表明,rUreB基因表达的蛋白质相对分子质量约为6.4 kDa,含量占细菌总蛋白的29.5%.经Ni2 柱亲和层析、GSH复性后,rUreB表现了脲酶活性,活性为32.5 U/mg.结论:表达产物确为幽门螺杆菌脲酶B亚基,这为研制幽门螺杆菌口服疫苗打下了基础.     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌热休克蛋白60（Hsp60)的候选菌株并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增Hsp60基因，将其定向插入pET-22b( )载体，在BL21（DE3）大肠杆菌中表达并通过动物实验研究其免疫原性。结果 克隆的Hsp60基因序列与Genbank公布的一致，Hsp60重组蛋白表达量占菌体总蛋白的27.2%，并可被幽门螺杆菌感染者血清所识别，用其免疫小鼠可产生抗该重组蛋白的抗体。结论 Hsp60有可能成为一种有效的疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化

目的 克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul).方法 采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b( )中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414.ltB(AUL).融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白.结果 PCR扩增出1 350 bp的目的 基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的 蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2 -NTA树脂提纯.纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上.Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性.结论 成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性.     

人幽门螺杆菌26 000外膜蛋白与热休克蛋白双价疫苗的构建和表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和26 000外膜蛋白(OMP)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在大肠杆菌BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA编码基因片段,将目的基因HspA与载体pET32a(+)经kpnⅠ、BamH I 双酶切后,进行连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp26分别经Hind Ⅲ、BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和26 000 OMP DNA片段,经T4连接酶将HspA和26 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达,表达产物经纯化后,以western 印迹法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和26 000外膜蛋白编码基因,由951bp组成,与GenBank报道的相比较,有1.15%的bp发生变异,1.26%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量(Mr)为59×103 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的19.96 %;重组蛋白经含Ni2+琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;western 印迹法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗26 000 OMP单克隆抗体所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和26 000 OMP,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.     

重组LTB-UreB融合基因工程菌发酵工艺研究

目的：研究大肠杆菌表达重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB－UreB)融合基因工程菌BL21的发酵工艺，方法：采用德国B.Brau公司C－10型15L发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化，结果：在优化的条件下，15L发酵罐发酵工程菌，菌体收获量可达52．2g/L，目的蛋白表达量约占总蛋白的27％，结论：此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达。