非诺贝特对LPC诱导脐静脉内皮细胞增殖、凋亡eNOS基因表达的影响

目的探讨非诺贝特对LPC诱导的脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响.方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),根据非诺贝特不同浓度分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特(10μmol/L)组、中浓度非诺贝特(50μmol/L)组、高浓度非诺贝特(100μmol/L)组,根据非诺贝特不同干预时间分为正常对照组、LPC组、非诺贝特(50μmol/L)干预6h组、12h组、24h组、48h组进行实验.分别观测不同浓度及不同时间非诺贝特内皮细胞增殖、凋亡、NO浓度及eNOS mRNA表达的变化.结果与正常对照组比较,LPC抑制内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,并使HUVECs eNOS mRNA表达降低,NO合成减少.非诺贝特可干预LPC对内皮细胞的作用,使内皮细胞增殖增强,细胞凋亡减少,eNOS mRNA表达升高,NO合成增加,且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系.结论非诺贝特可改善LPC对HUVECs的影响,使内皮细胞增殖增强,凋亡减少,eNOS mRNA表达升高,NO合成增加,从而起到抗动脉硬化作用.     

非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞增生、凋亡、NO生成及XIAP mRNA表达的影响

目的:探讨非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、凋亡、NO生成及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)mRNA表达的影响.方法:体外培养HUVECs株CRL-1730,分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特组(10 μmol/L)、中浓度非诺贝特组(50 μmol/L)、高浓度非诺贝特组(100 μmol/L).分别观测内皮细胞增生、凋亡、NO生成及XIAP mRNA表达的变化.结果:与正常对照组比较,LPC抑制CRL-1730细胞增生,促进凋亡,降低NO浓度,减弱XIAP mRNA的表达.非诺贝特干预后,CRL-1730细胞增生增强,凋亡减少,NO浓度升高,XIAP mRNA表达增强,且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系.结论:非诺贝特可通过促进XIAP表达,干预LPC对HUVECs的影响,使内皮细胞增生增强,凋亡减少,NO浓度升高,从而起到抗动脉硬化作用.     

苯扎贝特对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡基因Bcl-2/Bax的影响

目的 观察苯扎贝特对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡基因Bcl-2/Bax的影响. 方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),根据实验要求分为正常对照组、ox-LDL组、低浓度苯扎贝特(50μmol/L)组、中浓度苯扎贝特(100 μmol/L)组、高浓度苯扎贝特(200μmol/L)组.RT-PCR观察各组凋亡基因Bcl-2、Bax及Bd-2/BaxmRNA的变化. 结果 与正常对照组比较,ox-LDL组凋亡基因Bcl-2表达下降(P<0.05),凋亡基因Bax表达增加(P<0.05),Bcl-2/Bax比值下降(P<0.05);不同浓度苯扎贝特组与ox-LDL组比较,Bcl-2表达增加(P<0.05),Bax表达降低(P<0.05),Bcl-2/Bax上调(P<0.05),且呈浓度效应依赖关系. 结论 ox-LDL可引起内皮细胞抗凋亡基因Bcl-2表达下调,凋亡基因Bax表达上调,Bcl-2和Bax比值下降,从而引起内皮细胞凋亡增加;苯扎贝特可通过上调Bcl-2与Bax的比值抑制ox-LDL引起的内皮细胞凋亡,起到抗动脉粥样硬化作用.     

姜黄素对血管内皮细胞过氧化氢损伤的保护作用及其机制研究

目的研究不同浓度姜黄素（Cur）对正常血管内皮细胞活力的影响,及Cur对血管内皮细胞过氧化氢（H2O2）损伤的保护作用及机制。方法用不同浓度Cur（12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）处理体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）8 h,MTT法检测不同浓度Cur对HUVECs存活率的影响;H2O2（250μmol/L）孵育建立HUVECs损伤模型,不同浓度Cur（12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）与H2O2共同处理HUVECs 4 h,检测细胞存活率,黏附能力和培养液中乳酸脱氢酶（LDH）释放量;Griess法测定培养液中NO2-浓度,反映内皮细胞释放一氧化氮（NO）量。结果不同浓度Cur处理内皮细胞8 h后,内皮细胞的存活率无统计学差异（P〉0.05）;Cur能明显提高H2O2损伤的内皮细胞存活率和黏附能力（P〈0.01）,降低内皮细胞LDH的释放（P〈0.01）;增加H2O2损伤后HUVECs培养液中NO含量（P〈0.01）。其中Cur浓度为25μmol/L时效果最明显。结论不同浓度Cur（12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）对内皮细胞的存活率均无影响;Cur对血管内皮细胞氧化损伤具有保护作用,机制可能与其促进NO的合成有关。     

非诺贝特对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞CD40表达和基质金属蛋白酶活性的抑制作用

目的研究非诺贝特对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)CD40表达和基质金属蛋白酶(MMP)活性的作用。方法应用RT-PCR和流式细胞仪分别检测非诺贝特对TNF-α诱导的HUVECs的CD40mRNA和细胞表面CD40表达的影响;用明胶酶谱法测定TNF-α对HUVECs的MMP-2、MMP-9活性的影响以及非诺贝特对它们的作用。结果非诺贝特在5×10-5,1×10-4和2×10-4mol/L的浓度范围内能显著降低CD40mRNA和细胞表面CD40的表达(P<0.01),以1×10-4mol/L的非诺贝特的效果最为明显;浓度为2×10-4mol/L时,非诺贝特并没有进一步降低CD40mRNA和细胞表面CD40的表达。非诺贝特能抑制TNF-α诱导的HUVECs中MMP-2和MMP-9活性的增加。结论非诺贝特能降低TNF-α诱导的HUVECs的CD40表达,并且能抑制TNF-α诱导的HUVECs中MMP-2和MMP-9活性的增加。     

AngⅡ对血管内皮细胞表达粘附分子和释放NO的影响

目的：观察AngⅡ对体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达粘附分子（ICAM-1和VCAM-1）及内皮NO生成的影响，讨论三者之间的关系和可能机制。方法：采用胰蛋白酶消化法进行HUVECs的原代培养，3～5代用于实验；通过RT—PCR和WesternBlot检测两种粘附分子的mRNA和蛋白表达水平；利用Griees反应原理测定上清NO释放量。结果：HUVECs未活化时不表达VCAM-1而ICAM-1呈低表达状态；AngⅡ在生理浓度时（1019mol／L）即可刺激HUVECs表达ICAM-1和VCAM-1mRNA，随浓度增加表达增强；10^-7 mol／L AngⅡ在不同时间点刺激HUVECs 6h即有ICAM-1mRNA和VCAM-1mRNA较高表达，但高峰有所不同，前者在10h左右，后者为12h。在AngⅡ刺激下两种粘附分子的蛋白表达水平和趋势与mRNA相似；并随浓度增加而明显抑制NO生成。结论：AngⅡ明显增强HUVECs表达粘附分子，并抑制其NO生成，具有显著的促炎和促动脉粥样硬化作用。     

胰高血糖素样肽-1对高糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及相关机制

目的：探讨胰高血糖素样肽-1（glucagon—like peptide-1,GLP—1）对高糖诱导人脐静脉内皮细胞huma numbilica lvein endothelial cells,HUVECs）凋亡的影响及相关机制。方法：HUVECs加入不同处理因素后分组,分别培养48h后,MTT检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞早期凋亡率;Westernl印迹测定细胞P-Akt,p-eNOS水平;NO试剂盒检测NO浓度。结果：高糖（33mmol／L）培养48h后HUVECs细胞活力下降p〈0．05）,细胞凋亡率增加（p〈0．01）,细胞p-Akt,p-eNOS,NO水平均下降（P〈0．05）;高糖条件下加人GLP．1（3nmol／L）培养48h,与高糖组相比较,HUVECs细胞活力增加（P〈0．01）,细胞凋亡率减少（p〈O．05）,细胞p-Akt,p-eNOS,NO水平均增／JH（V〈0．05）;P13K抑制剂wortmannine（100nmol／L）可以阻断GLP-1的抗凋亡作用及其对P—Akt蛋白、p-eNOS蛋白及NO水平的影响;eNOS抑制剂L—NAME（100umol／L）仅能阻断GLP-1的抗凋亡作用及对NO水平的影响,不影响p-Akt蛋白的表达。结论：GLP．1可改善高糖诱导的HUVECs凋亡,该抗凋亡作用可能与P13K／Akt／eNOS通路的上调相关。     

PPARɑ激动剂抑制脂多糖诱导的单核细胞组织因子表达和促凝血活性

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）激动剂（非诺贝特）对细菌脂多糖（LPS）诱导的单核细胞株THP-1细胞的组织因子（TF）表达和促凝血活性（PCA）的影响。方法用非诺贝特预处理THP-1细胞，分别用流式细胞术（FCM）和改良组织因子凝血时间法（TiFaCT）检测LPS刺激下THP-1细胞的TF蛋白表达水平和TF-PCA。结果非诺贝特抑制LPS诱导下THP-1细胞的TF蛋白表达上调，并以浓度依赖的方式抑制LPS诱导下的TF-PCA增加（F=62．79，P〈0．05）。50μmol／L和100μmol／L浓度的非诺贝特分别使TF-PCA下降到LPS组的29％和25％。结论PPARα激动剂抑制LPS诱导的单核细胞TF蛋白表达和TF-PCA，这可能是PPARα激动剂减少动脉粥样硬化血栓形成并发症的机制之一，并在血栓性疾病的防治中具有潜在的临床价值。     

PPARα激动剂抑制脂多糖诱导的单核细胞组织因子表达和促凝血活性

目的研究过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）激动剂（非诺贝特）对细菌脂多糖（LPS）诱导的单核细胞株THP-1细胞的组织因子（TF）表达和促凝血活性（PCA）的影响。方法用非诺贝特预处理THP-1细胞，分别用流式细胞术（FCM）和改良组织因子凝血时间法（TiFaCT）检测LPS刺激下THP-1细胞的TF蛋白表达水平和TF-PCA。结果非诺贝特抑制LPS诱导下THP-1细胞的TF蛋白表达上调，并以浓度依赖的方式抑制LPS诱导下的TF-PCA增加（F=62．79，P〈0．05）。50μmol／L和100μmol／L浓度的非诺贝特分别使TF-PCA下降到LPS组的29％和25％。结论PPARα激动剂抑制LPS诱导的单核细胞TF蛋白表达和TF-PCA，这可能是PPARα激动剂减少动脉粥样硬化血栓形成并发症的机制之一，并在血栓性疾病的防治中具有潜在的临床价值。     

JNK信号通路在同型半胱氧酸诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

目的研究JNK信号通路在同型半胱氨酸（Hcy）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡中的作用。方法在人脐静脉内皮细胞培养基中加入不同浓度Hcy培养24h，以及加入SP600125预处理再加入10．0mmol／L的Hcy作用2h。用TUNEL法检测HUVECs凋亡情况。用Western-Blot法检测不同组HUVECs表达P-JNK的蛋白含量。结果用0．3mmol／L的Hcy干预后，HUVECs凋亡和JNK表达开始高于对照组（均P〈0．01）。100mmol／L最显著（均P〈0．01），呈浓度依赖关系；而SP600125两种浓度对HUVECs凋亡和JNK表达均有抑制作用，其中10．0umol／L更显著（P〈0．01）。结论Hey能够诱导HUVECs凋亡和上调JNK的表达，而SP600125具有明显的抑制作用，这可能是其促进动脉粥样硬化形成的重要机制之一。     

外周血内皮祖细胞体外培养分化研究

目的从人外周血中分离、培养和鉴定内皮祖细胞(EPCs),并观察其在体外增殖分化过程中各种细胞表型的变化。方法采用密度梯度离心方法获得外周血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,于培养第7天选择免疫荧光(DiI-acLDL/FITC-UEA-Ⅰ)鉴定EPCs,并且用流式细胞仪和RT-PCR方法观察上述细胞在第0、4、10和21天的CD34、CD31、KDR和eNOS的表达变化。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;第7天免疫荧光染色表明,约70%的细胞呈双荧光阳性;流式细胞仪分析显示,CD31和KDR表达在体外培养过程中逐渐升高,至第21天分别达到(72.1±11.2)%和(81.0±12.5)%,而CD34在第10天达到高峰(38.0±13.4)%后,第21天下降为(28.3%±12.2)%;RT-PCR结果表明,第4、10和21天eNOS的表达逐渐增强。结论本试验成功从外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增分化为成熟内皮细胞的过程中,CD31、KDR和eNOS等内皮细胞标志表达逐渐增强,而CD34的表达在内皮祖细胞的成熟分化过程中略有下降。     

人直肠癌淋巴管生成相关因子与癌转移关系的探讨

目的 探讨血管内皮生长因子C在直肠腺癌淋巴管生成中的作用。方法 用免疫组化SABC染色法观察63例直肠腺癌组织中VEGF-C和淋巴管内皮透明质酸受体1蛋白表达的情况。结果 直肠腺癌组织周边部淋巴管密度比内部明显增高（P〈0．01）；直肠腺癌组织周边部VEGF-C阳性细胞数比内部明显增多（P〈0．01）。VEGF-C表达阳性细胞密度和淋巴管密度呈正相关；直肠腺癌组织中VEGF-C异位表达在淋巴管内皮细胞上，而在血管中未见表达，差异有显著性（P〈0．01）。结论 VEGF-C促进直肠腺癌淋巴管的病理生成，淋巴管生成提示在为肿瘤细胞提供养分的同时，也为肿瘤转移创造了条件。     

可溶性血管内皮细胞生长抑制因子基因的克隆与表达

目的：对可溶性人血管内皮细胞生长抑制因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＶＥＧＩ）基因进行克隆和表达,检测表达产物对血管内皮细胞增殖的抑制活性。方法：将可溶性人ＶＥＧＩ基因克隆入载体ｐＵＣ１９后测序;再将正确的ＶＥＧＩ基因亚克隆入表达载体ｐＰＲＯＥＸＨＴｂ,ＩＰＴＧ诱导表达;初步纯化表达产物,检测对新生牛主动脉内皮细胞增殖抑制活性。结果：可溶性人ＶＥＧ     

小儿骨髓内皮细胞和内皮祖细胞的培养及鉴定

目的探索小儿骨髓内皮细胞和内皮祖细胞的分离培养,为组织工程血管、补片或带瓣管道的制备找新的种子细胞来源.方法采集小儿骨髓,梯度密度离心法分离单核细胞,内皮细胞培养液EGM-2培养,种植于提前包埋了纤维连接蛋白的培养皿进行体外扩增,分别取48 h内贴壁细胞和48 h后贴壁细胞,应用免疫组化和免疫荧光技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、FLK-1、VE-Cadherin和Ⅷ因子以及祖细胞标志CD133.结果经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、FLK-1、VE-Cadherin和Ⅷ因子,部分表达CD133.培养至第5代细胞形态基本相似,细胞总数可以达到108以上.结论自小儿骨髓可以分离培养出内皮细胞和内皮祖细胞并能体外扩增,可以作为构建组织工程血管、补片或带瓣管道的种子细胞来源.     

血管内皮细胞生长因子受体及其抑制剂的肿瘤治疗研究

新生血管为肿瘤组织提供氧和营养物质,在肿瘤的生长与转移过程中起重要作用。肿瘤血管的形成是多种细胞因子综合作用的结果,在这些细胞因子中研究最多的是血管内皮细胞生长因子。血管内皮细胞生长因子与其受体结合后通过酪氨酸激酶途径引起细胞的增殖及新生血管形成。抑制血管内皮细胞生长因子介导的途径可使肿瘤缩小,目前抗血管内皮细胞生长因子治疗已成为靶向治疗的热点。     

VEGF-C/Flt-4和Podoplanin 在人直肠癌淋巴管生成中的表达

目的探讨血管内皮生长因子C及其受体VEGF—R3（fms—like tyrosine kinase-4,Fit-4）在人直肠腺癌淋巴管生成中的作用。方法用免疫组化SABC染色法观察32例人直肠腺癌组织中VEGF—C及其受体VEGF—R3（fms—like tyrosine kinase-4,Fh-4）和Podoplanin表达的情况。结果直肠腺癌组织周边部淋巴管密度比内部明显增高（P〈0．01）;直肠腺癌组织周边部VEGF—C及其受体VEGF—R3阳性细胞数比内部明显增多（P〈0．01）。VEGF—C及其受体VEGF—R3表达阳性细胞密度和淋巴管密度呈正相关;直肠腺癌组织中VEGF—C及其受体VEGF—R3异位表达在淋巴管内皮细胞上,而在血管中未见表达,差异有显著性（P〈0．01）。结论VEGF—C及其受体VEGF—R3促进直肠腺癌淋巴管的病理生成,淋巴管生成提示在为肿瘤细胞提供养分的同时,也为肿瘤转移创造了条件。     

诱导正常血管内皮细胞具备肿瘤血管特性的研究

[目的]探讨用肿瘤细胞培养上清液诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)是否具备肿瘤血管内皮细胞的特性,旨在寻找一种简便的方法,解决肿瘤血管内皮细胞不易获得的难题.[方法]HUVEC用含不同浓度人肝癌细胞株HepG2培养上清的条件培养液培养,3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑盐法(MTS)检测其增殖率,免疫细胞化学法结合图像定量分析测量血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤内皮标记物1和8(TEM1、TEM8)的mRNA表达.[结果]含体积分数10%、20%、40%HepG2培养上清的条件培养液培养,HUVEC增殖率分别为71%、89%、109%.HUVEC用含体积分数50%HepG2培养上清液的条件培养液培养后,VEGFR2平均光密度值明显高于对照组(P＜0.05),且TEM1及TEM8呈阳性表达,而对照组不表达.[结论]HepG2上清液促进HUVEC增殖,增殖后的HUVEC具备肿瘤血管内皮细胞的特性.     

大鼠骨髓EPC的体外培养和生物学特性鉴定

目的 体外培养、诱导大鼠骨髓内皮祖细胞(EPC),观察EPC的生长特性,并进行鉴定.方法 冲洗大鼠长骨骨髓,用密度梯度离心法收集单个核细胞层,观察细胞在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导体系下生长情况并与未诱导组比较,对培养细胞进行免疫细胞化学检测.于培养3、7、14天采用流式细胞仪检测CD133 /Flk-1 双标记阳性细胞百分率.结果 贴壁细胞呈现团簇样生长、线样排列特殊形态.免疫细胞化学检测贴壁细胞CD133、CD34、Flk-1、Ⅷ因子(vWF)呈阳性表达.流式细胞检测结果显示,各个时间点诱导组CD133 /Flk-1 双标记阳性细胞百分率明显高于未诱导组(P＜0.01).结论 用密度梯度离心法在bFGF培养体系下可以获得较高纯度的EPC,该细胞具有内皮细胞的特性,经过体外诱导可以分化为内皮细胞.     

Expression of Vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF-C in serum and tissue of Wilms tumor

Background  Angiogenesis and lymphogenesis which were promoted by vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF-C are important in the growth and metastasis of solid tumors. The high level of VEGF and VEGF-C were distributed in numerous types of cancers, but their distribution and expression in Wilms tumor, the most common pediatric tumor of the kidney, was unclear.

Methods  To learn about the distribution, mass spectroscopy and immunohistochemistry were used to measure the level of VEGF and VEGF-C in serum and tissue of Wilms tumor.

Results  The expression level of VEGF in serum of Wilms tumor was the same as in pre-surgery and control, so it was the same case of VEGF-C. Both of these factors were chiefly located in Wilms tumor tissue, but not in borderline and normal. In addition, the higher clinical staging and histopathologic grading were important elements in high expression of VEGF and VEGF-C. Gender, age and the size of tumor have not certainly been implicated in expression level of VEGF and VEGF-C.

Conclusions  The lymph node metastasis and growth of tumors resulted from angiogenesis and lymphogenesis which were promoted by VEGF and VEGF-C in Wilms tumor. The autocrine and paracrine process of VEGF and VEGF-C were the principal contributor to specific tissues of Wilms tumor but not to the entire body.