Study on the penetrability of PEP-1-P27mt for cell membranes <Emphasis Type="Italic">in Vitro</Emphasis>

Summary Double-stranded oligomeric nucleotide encoding PEP-1 peptides was synthesized, prokaryotic expression pET15b-pep-1-p27mt recombinant constructed, E. coli BL21 (DE3)pLysS transformed and induced with IPTG to highly express fusion protein PEP-1-P27mt. Fusion protein with an N-terminal His-tag could be purified by Ni²⁺-resin affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and Western blotting. Cultured EC9706 cells treated with PEP-1-P27mt revealed that PEP-1-P27mt was transduced into cells after 15 min and reached maximal intracellular concentrations in 2 h. PEP-1-P27mt of 1 μmol/L final concentration could most strongly suppress the growth. It was suggested that PEP-1 can carry P27mt across membrane, which provides a new biological protocol for using cyclin dependent kinase inhibitors p27mt in suppressing the growth of tumor cells. YAN Shirong, female, born in 1965, Ph.D. This project was supported by a grant from Department of Education of Hubei Province, China (No. Q200524001).     

腺病毒介导的p27mt基因转染对肝癌细胞及裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的:研究携带突变型p27的重组腺病毒(Ad-p27mt)基因转染对肝癌的体内、外抑制作用,并探讨其抑癌机制。方法:⑴将Ad-p27mt转染人肝癌细胞SMMC-7721,Western blotting检测P27、Bcl-2、Bax的表达;流式细胞仪(FCM)观察Ad-p27mt对肝癌细胞生长抑制作用。⑵Ad-p27mt直接注射入人肝癌裸鼠移植瘤中,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率。结果:Ad-p27mt转染肝癌细胞后,细胞增殖明显受抑制,G0/G1期细胞比例增加,P27表达增强,Bax/Bcl-2比例增高,采用Ad-p27mt基因治疗肝癌裸鼠移植瘤生长受抑制,肿瘤生长抑制率达57.09%。结论:Ad-p27mt基因转染对肝癌具有较显著的体内、外抑制作用和诱导凋亡作用,其机制是通过增强P27表达,使细胞产生周期阻滞,诱导凋亡的机理可能是上调Bax/Bcl-2比例所引起。     

~1PEP-1-p27mt融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合蛋白PEP-1-p27mt的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自pORF9-hp27mtv21质粒中扩增p27mt基因,克隆入中间载体pGEM-TEasy Vector。经XhoI和BamH1双酶切后,构建原核表达载体pET15b-pep-1-p27mt,经测序证实构建成功后转化EcoliBL21(DE3)pLysS,表达PEP-1-p27mt融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲合层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了相对分子量为32×103的PEP-1-p27mt融合蛋白。结论:PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究提供了理论基础。     

人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达

目的 :为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变 p2 7的抗肿瘤特性 ,构建复制缺陷型重组hp2 7mt基因腺病毒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,经 2次亚克隆 ,插入到穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,形成转移质粒 pShuttle -CMV -hp2 7mt;然后再用PmeI线性化的 pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含腺病毒骨架质粒 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183,使其在细菌内发生同源重组。重组质粒鉴定正确后经PacⅠ酶切 ,转入Ad2 93细胞 ,包装成重组腺病毒Ad -hp2 7mt。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定 ,用紫外分光光度计进行滴度测定。用重组 p2 7mt的腺病毒Ad - p2 7mt感染大肠癌细胞SW 4 80 ,WesternBlot检测p2 7蛋白的表达。结果 :用含pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183后 ,可获得约 30 %的阳性重组质粒。PCR检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因。重组腺病毒滴度为 7.95× 10 15pfu/L。转染大肠癌细胞后 ,p2 7在SW4 80中获得了高表达 ,而未转染细胞和Ad -LacZ转染的细胞中仅有低表达。结论 :腺病毒作为一种基因转移载体 ,可有效介导 p2 7在肿瘤细胞中的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景。     

腺病毒介导的突变型p27对裸鼠大肠癌的抑制作用

目的:以腺病毒为载体,研究外源性突变型p27(p27mt)基因对大肠癌的体内抑制作用.方法:应用细胞移植法把人大肠癌SW480细胞接种于BALB/c裸鼠皮下,构建大肠癌裸鼠模型,将已成功构建的腺病毒介导的突变型p27(Ad-p27mt)及Lac-Z采用瘤体内直接注射法注射到瘤体内,与对照组比较,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率,并进行细胞凋亡的相关检测.结果:Ad-p27mt基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制,有明显的促凋亡作用,与Lac-Z、对照组比较,有显著性差异(P＜0.01).结论:Ad-p27mt基因对大肠癌裸鼠模型的体内肿瘤有明显的抑制作用.     

突变型p27基因治疗裸鼠大肠癌移植瘤的研究

目的:研究外源性突变型p27(p27 m t)基因对大肠癌的体内抑制作用。方法:应用细胞移植法把人大肠癌SW 480细胞接种于BALB/c裸鼠皮下,构建大肠癌裸鼠模型,将腺病毒介导的突变型p27(Ad-p27 m t)及Lac-Z注射到瘤体内,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率,并进行细胞凋亡及MMP-9的相关检测。结果:Ad-p27 m t基因治疗组肿瘤生长明显受到抑制,MMP-9的表达也明显较低,与Lac-Z、空白对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。结论:Ad-p27 m t基因对大肠癌裸鼠的体内肿瘤有明显的抑制作用,并能抑制MMP-9。     

p27mt对裸鼠肝癌移植瘤组织VEGF表达的影响

目的:研究外源性突变型p27基因(p27mt)对裸鼠皮下肝癌移植瘤血管生长的影响。方法:用人原发性肝癌细胞株SMMC-7721构建人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将腺病毒介导的突变型p27(Ad-p27mt组)注射瘤体2,1d后观察移植瘤的血管变化,免疫荧光法检测组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达。结果:Ad-p27mt组移植瘤血管单支、纤细,VEGF表达低于对照组和Ad-Lac Z组(P<0.05)。结论:p27mt抑制裸鼠皮下移植瘤滋养血管生成可能通过降低血管中VEGF表达完成。     

Effects of Ad-p27mt gene transfer on the expression of Bax,Bcl-2, VEGF and MMP-9 in the transplanted liver tumors in nude mice

In this study, the mechanism by which Ad-p27mt inhibits the growth, invasion and metastasis of transplanted liver tumor was studied by examining the effects of Ad-27mt gene transfer on the expression of Bax, Bcl-2, VEGF and MMP-9 in the transplanted liver tumors in nude mice.The model of transplanted hepatic tumor was established in nude mice.The mice were then divided into three groups, which were injected with PBS, Ad-LacZ and Ad-p27mt and the growth of the transplanted liver tumor was observed.The expressions of P27, Bax and Bcl-2 proteins were detected by Western blotting and the expressions of VEGF and MMP-9 were immunohistochemically determined.Our result showed that the tumor size, expressions of Bax, Bcl-2 proteins, VEGF and MMP-9 were all lower than those in PBS and Ad-LacZ groups and the differences were statistically significant (P<0.05).Our study suggested that Ad-p27mt could inhibit the growth, invasion and metastasis of hepatic cancer by lowering the expressions of VEGF and MMP-9.     

细菌内同源重组构建pAdeasy-1/hp27mt腺病毒质粒

目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含hp2 7mt基因的重组腺病毒质粒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,构成穿梭质粒 pShuttle -CMV/hp2 7mt;然后再用经PmeI酶切的 pshuttle-CMV/hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAdeasy - 1 /hp2 7mt;筛选同源重组质粒阳性克隆 ,提取pAdeasy - 1 /hp2 7mt质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果 :线性化的pShuttle-CMV/hp2 7mt转化含pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,1 2 - 2 0h后获得了30 %阳性重组质粒克隆 ,经酶切获得一大于 2 0kb的大片段和 3 .0kb的特征性片段 ,PCR反应扩增出了 2 75bp的片段 ,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp2 7mt。 结论 :用细菌内同源重组法可制备含hp2 7mt的重组腺病毒质粒且经济高效、简便、快捷。为转染 2 93细胞制备高滴度重组腺病毒提供高纯度的重组腺病毒质粒     

PEP-1肽介导人过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株(CRL-1730),研究PEP-1肽介导人过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法:构建原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT,将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”(His-tag)的重组蛋白,并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化,然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,通过Western blot来分析其转导能力。结果:测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT重组成功。SDS-PAGE和Western blot结果表明,PEP-1-CAT在E.coli中获得了高效表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.1 U/g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能保持酶活性达48 h。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞,为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导入人主动脉平滑肌细胞

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人平滑肌细胞的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和培养的人平滑肌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察PEP-1介导目的蛋白EGFP转导入人平滑肌细胞的能力。结果:EGFP蛋白不能进入细胞内,PEP-1-EGFP融合蛋白和人平滑肌细胞共同孵育1h后可见有明亮绿色荧光分布于胞浆和胞核。结论:PEP-1能有效携带目的蛋白进入人平滑肌细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的大分子抗平滑肌细胞增殖进行血管成形术后再狭窄的蛋白治疗奠定了基础。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞

目的研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性。结果EGFP蛋白不能进入细胞内。PEP-1-EGFP融合蛋白可在5min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27h仍可观察到微量绿色荧光。PEP-1-EGFP蛋白浓度达200μmol/L时对细胞仍无毒性。结论PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础。     

细胞穿透肽PEP-1介导过氧化氢酶转导大鼠心肌H9C2细胞

目的:探索细胞穿透肽PEP-1介导的人过氧化氢酶转导入H9C2细胞的能力。方法:利用基因工程方法表达和纯化His-tag-PEP-1-CAT及His-tag-CAT融合蛋白后,与体外培养的H9C2细胞株共孵育,利用免疫细胞荧光技术和Westernblot检测PEP-1-CAT融合蛋白是否转导入H9C2细胞内;并检测H9C2细胞内的过氧化氢酶活性。结果:制备的PEP-1-CAT融合蛋白纯度为90%以上,其浓度达0.501mg/mL;PEP-1介导的CAT融合蛋白能高效转导入H9C2细胞内,呈时间及剂量依赖性,6h时达峰值;转导入H9C2细胞内的融合蛋白的过氧化氢酶活性亦呈现出时间及剂量依赖的特点。结论:PEP-1-CAT能高效稳定转导入H9C2细胞内,为PEP-1介导的过氧化氢酶防治心肌缺血/再灌注损伤研究奠定基础。     

苦参碱诱导HepG2细胞凋亡与cyclin D1和p27kip1关系的实验观察

目的研究苦参碱抗肿瘤机制，初步探讨其与细胞周期调控蛋白cyclin D1和p27^kip1是否有关。方法苦参碱诱导后运用电镜、流式细胞仪方法检测HepG2细胞形态及细胞周期分布，并用免疫细胞化学法检测细胞内cyclin D1和p27^kip1蛋白表达变化。结果发现苦参碱诱导HepG2细胞凋亡，使细胞周期停滞于G1期。随着干预的苦参碱浓度增加cyclin D1下调，而p27^kip1蛋白上调，有统计学意义（P〈0．05）。结论苦参碱抗肿瘤机制可能是诱导肿瘤细胞凋亡，与细胞周期调控蛋白cyclin D1和p27^kip1有关。     

下丘脑褪黑素受体亚型基因及蛋白表达的研究

目的：应用PT－PCR技术和免疫组织化学染色显示人胚胎下捕脑褪黑素受体及其亚型的分布。方法：取人胚胎下丘脑组织，抽提总RNA并应用RT－PCR方法检测其mRNA，扩增所得阳性产物用自动测序仪测序；石蜡包埋下丘脑组织，应用鼠抗人mt1和MT2受体单克隆抗体分别检测褪黑素mt1和MT2受体亚型mRNA及其蛋白的表达。结果和结论：人胚胎下丘脑组织中存在mt1和MT2受体亚型mRNA的表达及其蛋白的翻译，提示在该组织中有mt1和MT2两种受体亚型的表达。     

PEP-1-SOD1融合蛋白预处理对大鼠骨髓间充质干细胞在缺氧无血清条件下的保护作用

目的:研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的能力及其在缺氧无血清条件下对MSCs的保护作用。方法:将纯化后的SOD1和PEP-1-SOD1蛋白分别加入到培养及鉴定后的第3代MSCs中,免疫荧光法和Western blot分析PEP-1-SOD1穿透入MSCs的变化,黄嘌呤氧化酶法分析其SOD酶活性。将2.5μmol/L PEP-1-SOD1预处理MSCs 45 min后去除PEP-1-SOD1,缺氧无血清条件下再处理24 h,Annexin V/PI双染标记,流式细胞术分析MSCs凋亡情况。结果:PEP-1-SOD1融合蛋白可以转导入MSCs,呈时间和剂量依赖性分布于胞浆和胞核,缺氧无血清条件下MSCs凋亡率明显降低(P<0.05)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白可以高效、稳定转导入MSCs,并对缺氧无血清所诱导的MSCs凋亡具有显著保护作用。     

PEP-1介导血红素加氧酶-1导入肝细胞的实验研究

目的采用体外培养的L02肝细胞株,研究PEP-1肽介导血红素加氧酶-1（PEP-1-HO-1）穿透肝细胞的能力。方法实验分为PEP-1-HO-1组和HO-1组,用基因工程的方法制备并纯化PEP-1-HO-1融合蛋白,将纯化的目的蛋白及HO-1蛋白加入培养的L02肝细胞,通过免疫荧光及western blot来分析其转导能力。结果经测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-HO-1重组成功。SDS-PAGE及western blot结果表明,PEP-1-HO-1在Rosetta（DE3）pLysS菌中获得了高效表达,经Ni2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,将其加入到体外培养的L02肝细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能持续稳定表达48h,免疫组化显示其主要分布于胞质和胞核中。结论 PEP-1-HO-1融合蛋白能高效地转导入培养肝细胞,为进一步研究肝细胞氧化应激损伤防治的动物模型实验提供了新的途径。     

癌基因Bmi-1引起中心体扩增的可能机制

 [目的] 探讨Bmi-1引起中心体扩增的可能机制。[方法] 体外建立Bmi-1稳定高表达和Bmi-1–RNAi稳定起作用的细胞株， 采用免疫荧光染色法计数中心体（Microtub）异常复制的比率及定位细胞周期素蛋白D1（cyclinD1）和P27的表达，同时进行Western blot检测cyclinD1和p27在核中的表达量。[结果] Microtub染色计数发现与对照细胞相比，中心体异常复制的比率在6-10B/Bmi-1-1细胞中升高，而在CNE2/Bmi-1-RNAi细胞中下降；免疫荧光染色和Western blot检测均发现cyclinD1蛋白在6-10B/Bmi-1细胞核内表达升高，而在CNE2/Bmi-1-RNAi细胞核内表达降低，P27蛋白则在两株细胞株中均呈现相反的变化。[结论] Bmi-1可能通过调控cyclinD1-P27途径引起中心体扩增。