EB 病毒 DNA 酶基因特异性结合蛋白的检测

ＰＣＲ法扩增出ＥＢ病毒ＤＮＡ酶全基因之后，用［γ－３２Ｐ］ＡＴＰ进行５’末端标记，然后利用凝胶迁移分析法（ｇｅｌｍｏｂｉｌｉｔｙｓｈｉｆｔａｓｓａｙ）来检测与该基因结合的蛋白质。结果表明在Ｒａｊｉ细胞核和细胞浆中均有ＥＢ病毒ＤＮＡ酶基因非特异性和特异性结合蛋白，在人乳清中也有与该基因结合的蛋白质。     

EB 病毒特异性 DNA 酶基因在大肠杆菌中的高效表达

含ＥＢ病毒特异性ＤＮＡ酶全基因片段的大肠杆菌受变温诱导后，其上清液在十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）时出现一条浓集带，分子质量大小约为５２ｋｕ，符合ＥＢ病毒ＤＮＡ酶全基因编码蛋白质大小。凝胶中蛋白质的定量扫描结果显示该蛋白质占宿主菌总蛋白质的２０％～２３％，实现了ＤＮＡ酶全基因在原核体系的高效表达。未见包涵体形成；迅速或缓慢升温所诱导目的蛋白质表达量基本相同。     

EB病毒特异性DNA酶基因在大肠杆菌中的高效表达

含ＥＢ病毒特异性ＤＮＡ酶基因片段的大肠杆蓖受变温诱导后，其上清液在十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳时出现一条浓集带，分子质量大约为５２ｋｕ，符合ＥＢ病毒ＤＮＡ酶全基因编码蛋白质大小。     

Epstein—Barr病毒DNA多聚酶基因扩增和表达载体构建

目的 扩增Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）ＤＮＡ多聚酶基因，构建高效表达载体。方法 根据ＥＢＶ全基因序列，在ＥＢＶ ＤＮＡ多聚酶基因的３’、５’端设计一对附加ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点的特异性引物，以Ｂ９５－８细胞ＤＮＡ为模板，采用改良ＰＣＲ方法扩增出ＥＢＶ ＤＮＡ多聚酶基因（３０４４ｂｐ）。用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切该基因片断并克隆有达载体ｐＭＡＬ－ｐ２，采用蓝白斑试验筛先阳性菌落。     

EBV－DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒（ＥＢＶ）基因全序列，设计包括ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一个ＳａｌⅠ切点，以便于克隆。选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一条１４６０ｂｐ的特异条带，纯比后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶的全基因片段。以ＪＭ１０３为宿主菌，以高效表达质粒ＰＢＶ２２１为载体，按常规方法作酶切、连接、转化，最后在含氨中青霉素的培养基上挑取单菌落扩大培养，用快速法少量制备质粒ＤＮＡ。根据质粒电泳结果粗筛，再行ＢａｍＨⅠ酶切初步鉴定，确定质粒大小为５１１７（１４５１＋３６６６）ｂｐ的菌落为阳性克隆。先后用ＢａｍＨⅠ和ＴａｑⅠ消化阳性重组体，以形成１２００ｂｐ和３９１７ｂｐ两片段的确定为正向连接重组体。本实验首次将ＥＢＶ－ＤＮＡ酶全基因片段克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２１上获得成功     

病毒与人类基因组同源性实探

探讨病毒与人类基因组同源性问题。选用ＥＢ病毒（ＥＢＶ），肠道病毒（ＥＶｓ）、单纯疱疹病毒－１型（ＨＳＶ－１），丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）特异性引的，以６份健康成人外周血ＤＮＡ为模板，分别进行酶链式反应（ＰＣＲ）。初步结果表明，有５份ＤＮＡ样品可通过ＥＢＶ、ＨＣＶ特异性引物扩增，ＥＢＶ引物扩增后的片段大小在１５４－２３４ｂｐ之间；ＨＣＶ引物扩增的片段大小约２００ｂｐ和１２０ｂｐ。提示病毒某些基因可能存在     

PCR扩增EBV－DNA酶及NA－1基因片段在鼻咽癌诊断上的应用

对６４例鼻咽部活检组织标本进行ＥＢ病毒（ＥＢＶ）特异性基因片段［ＤＮＡ酶、核抗原－１（ＮＡ－１）］的ＰＣＲ扩增，该结果与血清抗ＥＢＶ－ＤＮＡ酶抗体（ＥＢＶ－ＤＮａｓｅａｎｔｉｂｏｄｙ，ＥＤＡｂ）及初次细胞病理学结果对照，上述３种检测方法检出的阳性质例分别为：ＤＮＡ酶基因４０例（ＮＡ－１基因４１例），ＥＤＡｂ３７例，初次病理３５例，ｘ２检验表明３种检测方法结果相符。对ＤＮＡ酶基因和ＮＡ－１基因扩增阳性而初次病理阴性（诊断为慢性炎症）的８例中的６例（另２例因故未检）进行第２次活检，有５例病理确诊为原位低分化鳞癌。另对４２例头颈部肿大淋巴结的活检组织进行了上述基因片段的扩增，其中病理诊断为转移性低分化鳞癌的１０例中有６例为基因片段扩增阳性，该６例中４例后来在鼻咽部发现原发灶（２例为粘膜下型）。     

EB病毒3种全基因的扩增、克隆及表达

目的：扩增克隆及表达ＥＢ病毒（ＥＢＶ）３种（ＤＮＡ酶、胸苷激酶及ＢＨＲＦ１）全基因片段。方法：以Ｂ９５－８细胞株ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增３种目的基因。酶切鉴定后分别与高效表达载体ｐＢＶ２２１连接，用大肠杆菌ＪＭ１０３或ＨＢ１０１作为转化的宿主菌。抗氨苄青霉素培养形成单菌落后放大培养，根据重组质粒的电泳行为粗筛，再双酶切鉴定。结果：各种阳性菌经３０℃→４２℃变温诱导培养，超声破碎后其上清液经十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ），分别新出现一条分子大小为５２ｋｕ，６７ｋｕ及１７ｋｕ蛋白区带，符合ＥＢＶ该３种全基因所编码蛋白质大小。凝胶中蛋白质定量扫描结果显示目的蛋白质分别占宿主菌总蛋白质的２３％，６７％和２５％。结论：实现了ＥＢＶ３种全基因的扩增、克隆及在原核体系的表达。     

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术,即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列,然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中,以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定,确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。     

病毒与人类基因组同源性初探

探讨病毒与人类基因组同源性问题。选用ＥＢ病毒（ＥＢＶ），肠道病毒（ＥＶｓ）、单纯疱疹病毒－１型（ＨＳＶ－１），丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）特异性引物，以６份健康成人外周血ＤＮＡ为模板，分别进行聚合酶链式反应（ＰＣＲ）。初步结果表明：有５份ＤＮＡ样品可通过ＥＢＶ、ＨＣＶ特异性引物扩增。ＥＢＶ引物扩增后的片段大小在１５４～２３４ｂｐ之间；ＨＣＶ引物扩增后的片段大小约２００ｂｐ和１２０ｂｐ。提示病毒某些基因可能存在人类基因组中或两者具有很高的同源性。     

人脑髓鞘碱性蛋白基因cDNA在大肠杆菌中表达的初步研究

将ＢａｍＨＩ酶切的人脑髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）基因ｃＤＮＡ克隆片段和表达载体ｐＧＥＸ５Ｔ重组后转化大肠杆菌，再筛选、趱ＩＰＴＧ诱导，结果显示：阳性克隆１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ有２条特异区带（４９ｋｄ和３５ｋｄ），Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交证实文具区带具ＭＢＰ抗原特异性，蛋白质含量测定、免疫斑点杂交和ＥＬＩＳＡ分析，该膜蛋白表达量占菌体裂液蛋白质总量６％（５０ｍｇ／Ｌ菌液）。     

EB病毒与干综合征发病相关性的研究

为了进一步证实ＥＢ病毒与干燥综合片发病的关系，作者设计了ＥＢ病毒ＢａｍＷ片段特异的引物和寡核苷酸探针，利用ＰＣＲ体外基因扩散增方法和核酸分子杂交技术检测出干燥综合征患外周血白细胞及唇腺组织中存在有高频率的ＥＢ病毒ＤＮＡ，而对照组的阳性率对很低。用在位杂交方法检测干燥综合征患者唇腺组织中ＥＢ病毒ＤＮＡ，共２８例中有１６例为阳性。结果说明干燥综合征患者ＥＢ病毒感染率较正常人明显增高，且ＥＢ病毒感染与靶     

EBV—DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒基因全序列，设计包括ＥＢＶ特生ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一相ＳａｌⅠ切点，以便于克隆，选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一１４６０ｂｐ的特异条带，纯化后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特生ＤＮＡ酶的全基因片段。     

EB病毒与干燥综合征发病相关性的研究

为了进一步证实ＥＢ病毒与干燥综合征发病的关系，作者设计了ＥＢ病毒ＢａｍＷ片段特异的引物和寡核苷酸探针，利用ＰＣＲ体外基因扩增方法和核酸分子杂交技术检测出干燥综合征患者外周血白细胞及唇腺组织中存在有高频率的ＥＢ病毒ＤＮＡ，而对照组的阳性率相对很低。用原位杂交方法检测干燥综合征患者唇腺组织中ＥＢ病毒ＤＮＡ，共２８例中有１６例为阳性。结果说明干燥综合征患者ＥＢ病毒感染率较正常人明显增高，且ＥＢ病毒感染与靶器官的损害有关，提示靶器官控制ＥＢ病毒细胞内复制的免疫机制出现异常。     

人脑髓鞘碱性蛋白基因cDNA在大肠杆菌中表达的初步研究

将ＢａｍＨⅠ酶切的人脑髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）基因ｃＤＮＡ克隆片段和表达载体ｐＧＥＸ－５Ｔ重组后转化大肠杆菌，再筛选、增殖和ＩＰＴＧ诱导。结果显示：阳性克隆１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ有２条特异区带（４９ｋｄ和３５ｋｄ）；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交证实该区带具ＭＢＰ抗原特异性；蛋白质含量测定、免疫斑点杂交和ＥＬＩＳＡ分析，该膜蛋白表达量占菌体裂解液蛋白质总量６％（５０ｍｇ／Ｌ菌液）。     

PCR技术检测大肠肿瘤及肿瘤样病变中EB病毒DNA

目的 探讨人类大肠肿瘤中是否存在疱疹病毒属中ＢＥ病毒的感染，ＥＢ病毒是否参与了肿瘤的致病作用。方法 应用ＰＣＲ方法对１０例大肠良性肿瘤或肿瘤样病变标本和１０例大肠恶性肿瘤病变标本进行ＥＢ病毒ＤＮＡ扩增。结果 在２０例病变标本中，ＥＢ病毒ＤＮＡ阳性率为１９／２０，所得ＤＮＡ片段为３１１ｂｐ。结论 人类大肠良恶性肿瘤组织及某些称谓癌前病变的组织中存在的ＥＢ病毒感染。致病作用可能和宿主细胞之间基因调控，     

EB病毒BHRF1基因聚合酶链反应扩增及其鉴定

目的：ＢＨＲＦ１的研究对于认识ＥＢＶ有关肿瘤和其它疾病的发病机理、寻找预防、治疗途径有十分重要的意义。方法：以Ｂ９５８细胞ＤＮＡ为模板，设计一对引物，用ＰＣＲ方法扩增ＢＨＲＦ１基因，用目的基因内的两个限制性内切酶位点进行酶切鉴定。结果：扩增产物长５９２ｂｐ，与预期结果一致，两个酶所切下的四个片段长度也与理想值相符。结论：本研究首次采用ＰＣＲ方法，成功地获得完整的ＥＢ病毒ＢＨＲＦ１基因，从而为该基因的进一步研究和应用奠定基础。     

慢性喉炎患者与EB病毒、单纯疱疹病毒及肺炎支原体关系的探讨

近年来 ,有病毒、衣原体、支原体等与咽喉部炎症和肿瘤相关的报道[1,2 ] 。以往的临床病毒和支原体诊断技术 ,对有些病毒和支原体难以体外分离培养 ,或培养法费时费力而不利于早期快速诊断。1996年 6月至 1998年 11月我们用新引进的 (美国 )Ｃ -ｅｒｅａｍｐＰＥ96 0 0ＰＣＲ扩增仪 ,采用聚合酶链反应(ＰＣＲ)的基因检测方法 ,检测了部分慢性喉炎患者咽喉分泌物的ＥＢ病毒ＤＮＡ、单纯疱疹病毒ＤＮＡ及肺炎支原体ＤＮＡ ,并对这 3种病原体与慢性喉炎的关系作初步探讨。1　ＥＢ病毒ＤＮＡ检测ＥＢ病毒 (ＥＢＶ)与人上呼吸道感染、传染性单核…     

用PCR法探讨EB病毒与胃癌的关系

胃癌组织中ＥＢ病毒的检出率因地区而异。为调查黑龙江地区胃癌ＥＢ病毒核酸的存在情况，我们用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）法特异笥扩增本地区经临床病理确诊的胃癌组织中ＥＢ病毒ＥＢＮＡ１基因区域，结果２９例标本中有６例检出ＥＢ病毒ＤＮＡ，且胃癌病理类型均是胃腺癌，提示本地区胃癌特别是胃腺腺的发生与ＥＢ病毒感染密切相关。     

HP8：增强子结合蛋白家族的一个新基因的cDNA克隆

以大鼠增强子结合蛋白（Ｃ／ＥＢＰ）ｃＤＮＡ为探针，筛选人胎肝ｃＤＮＡ库，得到一个含有２４８０碱基命名为ＨＰ８的ｃＤＮＡ克隆，其中８４－１１０９位碱基属编码区。经基因数据库（ＥＭＢＬ，９５．６版本）查对未发现同源基因。该基因编码的蛋白Ｃ－末端含有亮氨酸拉链结构，和Ｃ／ＥＢＰ功能区（Ｃ／ＥＢＰ基因家族新成员。基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实该基因为单拷贝基因。在１４种胎儿组织中显示小肠、皮肤高表达，肾